이 프로토콜의 목적은 칼슘 신호에 관여하는 새로운 유전자를 식별하는 데 사용할 수있는 방법을 식별하는 것입니다. 이를 위해, 우리는 고전적인 앞으로 유전 화면을 사용합니다. 칼슘 시그널링은 여러 플랜트 시스템에서 중요한 방어 대응 경로입니다.
이 통로에 관련시킨 유전자를 확인하기 위하여는, 우리는 고전적인 전진 유전 스크린을 이용했습니다. 이 방법에서 EMS는 식물 시스템에 임의의 돌연변이를 도입하기 위해 알킬팅 에이전트로 사용될 것이다. 개발된 돌연변이 생성은 관심 표현형에 대한 스크리닝에 사용될 수 있다.
관심표현형이 확인되면 인과 유전자를 매핑할 수 있다. 이 연구에서는 칼슘 리포터 aequorin이 있는 모델 식물 아라비도시스를 사용합니다. 무게 150 EMS 돌연변이 발생에 대 한 aequorin의 mg 씨앗 및 다른 150 제어로 사용 하는 mg 씨앗.
씨앗을 50ml 팔콘 튜브로 옮기고 2%EMS 또는 오토클레이브 워터를 추가합니다. EMS를 사용하는 동안 발암성이므로 주의하십시오. EMS를 사용하는 동안 보호 장비를 착용해야 하며 모든 종류의 유출을 방지해야 합니다.
팔라핀으로 팔콘 튜브를 밀봉하고 알루미늄 호일을 감쌉니까. 실온에서 18시간 동안 튜브 끝을 끝까지 회전시다. 씨앗이 EMS 용액을 신중하게 정착하고 제거하도록 허용하고 하나의 어금니 NaOH가 들어있는 폐기물 용기에 버려십시오.
돌연변이 된 씨앗을 40 ml의 자동 용수로 8 번 이상 철저히 씻으십시오. 최종 세척을 위해, 100 밀리머 나트륨 티오술파테를 추가하고 EMS의 흔적을 제거하기 위해 적어도 세 번 헹구라. 씨앗을 40ml의 오토클레이브 워터에 1시간 동안 담그고 EMS를 씨앗에서 확산한 다음 완전히 건조할 때까지 Whatman 용지에 놓습니다.
씨앗을 에펜도르프로 옮기고 계층화를 위해 2~4일 동안 섭씨 4도에서 배양합니다. 돌연변이 된 씨앗과 물로 처리 된 씨앗을 모두 토양에 옮기고 섭씨 22도및 70 %의 상대 습도에서 16 시간 빛과 8 시간 어두운 사진 기간이있는 성장실로 옮겨집니다. 돌연변이 발생이 성공했는지 확인하려면 엽록소 섹터를 찾습니다.
단일 가계도 기반 종자 수집 방법을 사용 하 고 각 M1 식물은 고유 한 번호를 부여 합니다. 성숙시, 씨앗은 이러한 개별 돌연변이 식물에서 수확하고 개별 M1 라인으로 저장됩니다. 높은 처리량 종자 살균 및 수경 식물 뿌리 프로토콜이 사용되며 Ranf 외에서 적응됩니다.
첫날에는 M1 당 거의 12~15M2 씨앗을 24웰 조직 배양플레이트의 개별 우물에 놓고 3대 비율로 염화나트륨 및 염산 용액을 사용하여 살균한다. 이렇게 하면 씨앗을 살균하는 염소 가스가 방출됩니다. 남은 염소 가스를 완전히 증발시키기 위해 밤새 접시를 둡니다.
살균 후, 개별 우물에 반 강도 액체 MS 미디어를 추가하고 섭씨 4도에서 2 ~ 4 일 동안 씨앗을 계층화 한 다음 10 시간 빛의 사진 기간과 섭씨 70 % 대비 14 시간 어둡게 성장 챔버로 씨앗을 이동합니다. 14일, 묘목이 8~12일 된 후 각 라인에서 각각 12M2 묘목을 96개의 밝은 광노미터 플레이트에 개별적으로 놓습니다. 모종 전달 후, 개별 우물에 5 개의 마이크로 몰라 Coelenterazine 용액의 150 마이크로 리터를 추가하고 8 시간 동안 섭씨 21도에 어둠 속에서 저장하십시오.
Coelenterazine는 기능성 aequorin를 형성하기 위하여 아포아에쿠린에 묶는 보철 단입니다. Coelenterazine는 빛에 민감하고 따라서 빛으로부터 보호 어두운 색의 병에 저장됩니다. 다음 날, 과산화수소를 자극으로 사용하여 돌연변이를 스크린하고 후속 칼슘 고도를 측정합니다.
24개의 우물을 동시 측정하기 위해 1분 동안 배경 측정을 포함하는 아웃 자동화 운동 프로그램이 만들어지며, 그 다음에 10분 동안 자극 추가 및 측정을 한 다음 방전 주입 150 마이크로리터및 측정을 3~5분 동안 측정합니다. 그리고 딸 aequorin에 대한 모든 방전은 측정 된 칼슘을 정량화하고 기능성 aequorin에 대한 추가 제어로 판독값에 포함될 것입니다. 상기 방법에서 제공된 판독값은 상대광 단위에 있다.
세포칼슘 이온 농도를 계산하기 위해, 2004년 렌탈과 나이트가 제공한 이전에 설명된 농도 방정식이 사용되며, 이는 프로토콜에 기재되어 있다. 발광계에서 얻은 루미노미터는 칼슘 이온 농도를 계산하기 위해 방정식에 첨가됩니다. 얻어진 세포성 칼슘 이온 값은 칼슘 반응에 과산화수소 돌연변이를 식별하기 위한 야생식 대조군에 대해 그래픽으로 플롯됩니다.
이는 표시된 프로토콜의 대표적인 결과입니다. 우리는 칼슘 이온 농도의 고도를 위해 측정된 12개의 개별 묘목과 1개의 M1 선을 보여주었습니다. 그래프의 녹색 선은 돌연변이와 함께 측정된 야생형 aequorin을 나타냅니다.
빨간색은 모든 12 모종의 평균이며, 검은 선은 칼슘 이온 고도를 위해 측정 개별 M2 묘목이다. 과산화수소 응용 프로그램에 대한 반응이 매우 감소된 모종은 구조됩니다. 구조된 돌연변이는 다음 세대에 재확인되고, 인과 유전자를 확인하기 위한 매핑이 뒤따릅니다.
발암물질이기 때문에 EMS를 돌연변이원으로 사용할 때주의해야 합니다. 보호 기어링은 항상 착용해야하며 유출은 좋은 실험실 관행을 다루어야합니다. 또한, 씨앗의 혈통 기반 컬렉션을 할 때, 개별 식물은 어떤 단계에서 어떤 씨앗의 혼합이 없도록 최대한주의수확해야한다.
이것은 다시 가서 동종 가우성 돌연변이 식물인 어머니 식물을 추적하는 데 도움이됩니다. 또한,이 방법은 선별 방법에 어떤 편견이나 사전 가정을 도입하지 않기 때문에, 관심의 표현형을 식별하기 위해 하나 이상의 조건에 사용할 수 있습니다. 추가적으로, 다중 독립적인 유전자는 또한 동일 프로토콜을 사용하여 확인될 수 있었습니다.
프로토콜은 작은 복용량으로 사용하기 쉽기 때문에, 식물의 거대한 숫자는 돌연변이 될 수있다. 돌연변이 식물의 이 거대한 수는 몇몇 인구및 몇몇 조건에 이용되고 몇몇 유전자를 확인하기 위하여 이용될 수 있습니다. 기능의 부분적 손실, 변경된 기능, 기능의 완전한 손실, 또는 또한 구성적인 유전자 기능은 이 방법을 통해 확인할 수 있다.
매핑은 현재 시나리오에서 매핑 기술의 발전을 감안할 때 쉬운 작업이어야 합니다. de novo 기반 매핑 시스템, SNP 기반 인종 플롯 및 많은 다른 사람들은 관심의 표현형을 일으키는 인과 유전자를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 적용성을 감안할 때, 그것은 뿐만 아니라 애비도시스 모델 식물에 사용할 수 있습니다., 하지만 다른 모델 식물 너무 관심 판독의 표현형을 설립 할 수 있는 제공.
