우리는 시신경엽에 특히 중점을 두고 유충 및 성체 초파리의 뇌를 절개, 면역 염색 및 장착하는 프로토콜을 설명합니다. 시신경엽의 복잡한 3차원 구조를 감안할 때, 여기에 설명된 프로토콜은 연구자들이 장착 방향과 시각화된 시신경엽 구조 간의 관계를 더 잘 이해할 수 있도록 할 것으로 예상됩니다. 이 프로토콜은 유충 및 성체 시신경엽에 대한 세 가지 장착 전략을 설명하며, 각 전략은 이미징 중 특정 시신경엽 구조를 시각화하기 위한 최적의 각도를 제공합니다.
해부를 시작하기 전에 3개의 웰 플레이트의 모든 웰을 웰당 400마이크로리터의 PBS로 채우고 집게를 사용하여 초파리 바이알 또는 병 내부를 기어 다니는 15개의 떠돌이 제3 인스타 유충을 부드럽게 선택합니다. 모든 유충을 세 개의 웰 플레이트의 첫 번째 웰에 놓고 한 유충을 플레이트의 중간 웰로 옮깁니다. 우세하지 않은 손을 사용하여 우물 바닥에서 유충의 몸을 구속하고 우세한 손을 사용하여 유충 입 고리를 부드럽게 잡습니다.
입 고리를 몸에서 당겨 뇌를 제거합니다. 그런 다음 상상 디스크를 포함한 부속 조직을 제거합니다. 그런 다음 뇌를 접시의 세 번째 우물에 넣습니다.
모든 뇌를 절개한 후에는 P200 피펫을 사용하여 세 번째 웰에서 PBS를 조심스럽게 제거하고 뇌가 물에 잠길 수 있을 만큼의 용액만 남깁니다. 500 마이크로 리터의 갓 준비된 냉간 고정 용액을 우물에 추가하십시오. 뇌가 접시 안에서 소용돌이치도록 집게로 용액을 부드럽게 저어주고 유리 현미경 슬라이드로 우물을 덮습니다.
그런 다음 접시를 얼음 위에 30분 동안 올려 티슈를 고정합니다. 세척 당 400 마이크로 리터의 신선한 PBS와 트리톤으로 뇌를 5 번 씻으십시오. 뇌는 이제 1차 항체 배양을 할 준비가 되었습니다.
성체 뇌 해부의 경우, 10-15마리의 성체 파리를 마취하고 얼음 위에서 실험실 닦음에 올려 놓습니다. 집게를 사용하여 날개를 가진 성인 파리 한 마리를 400 마이크로 리터의 PBS가 들어있는 3 웰 해부 플레이트의 한 웰로 부드럽게 옮깁니다. 주로 사용하지 않는 손에 한 쌍의 집게를 사용하여 파리의 흉부를 우물 바닥에 대고 잡고 주로 사용하는 손으로 초미세 집게를 사용하여 몸의 나머지 부분에서 머리를 부드럽게 잡아당깁니다.
시체를 실험실에 버리고 우세하지 않은 손으로 닦고 우세한 손을 사용하여 주둥이로 우물 바닥에 머리를 고정합니다. 양쪽 집게를 사용하여 뇌가 노출될 때까지 눈 사이의 큐티클 각 부위를 벗겨내고 뇌에 붙어 있는 부속 조직을 제거합니다. 세척된 뇌를 세 번째 우물에 넣고 15개의 뇌를 얻거나 최대 30분의 절개 시간이 경과할 때까지 시연된 대로 다음 뇌를 절개합니다.
500 마이크로리터의 고정 용액으로 상온에서 20분 동안 뇌를 고정하고 시연된 것처럼 PBS와 트리톤으로 뇌를 5회 세척합니다. 성인의 뇌는 이제 1차 항체 배양을 할 준비가 되었습니다. 마지막 세척을 형광 안전 장착 매체 두 방울로 교체하여 뇌를 잠기고 새 유리 현미경 슬라이드의 중앙에 장착 매체 한 방울을 추가합니다.
겸자를 사용하여 배쪽 신경삭으로 각 유충의 뇌를 잡고 슬라이드로 전달합니다. 외부 증식 센터의 중앙 영역에서 전구 세포와 뉴런을 시각화하려면 라미나 또는 소엽 플러그를 통해 복부 신경 코드가 엽 위로 돌출되어 있는지 확인하고 유충 뇌를 조직의 앞쪽이 위를 향하도록 슬라이드에 배치합니다. 외부 또는 내부 증식 센터의 끝에 속하는 세포를 시각화하려면 복부 신경삭이 엽 아래에서 돌출되어 있는지 확인하십시오.
유충 뇌를 조직의 뒤쪽이 위를 향하도록 슬라이드에 놓습니다. 등쪽 배측 축과 내측 측축의 내부 및 외부 증식 센터에서 뉴런의 초승달 모양을 시각화하려면 한 쌍의 날카로운 집게나 텅스텐 바늘을 사용하여 뇌엽 사이의 절단 지점에서 시작하여 복부 신경삭을 통해 뇌엽을 분할합니다. 측면이 위를 향하도록 각 로브의 방향을 변경합니다.
유충의 뇌가 적절하게 방향을 잡았을 때, 뇌의 양쪽에 작은 방울의 장착 매체를 놓습니다. 각 방울에 하나의 커버 슬립을 놓고 마지막 커버 슬립을 뇌 위에 올려 오른쪽과 왼쪽 가장자리가 다른 두 개의 커버 슬립에 놓이도록 하여 커버 슬립 브리지를 형성합니다. 그런 다음 매니큐어를 사용하여 커버 슬립 브리지의 가장자리를 밀봉하여 장착된 브레인을 고정합니다.
마지막 2차 항체 세척 후 400마이크로리터의 PBS로 최종 세척을 수행합니다. PBS를 형광 안전 장착 매체 3방울로 교체하여 뇌를 담그십시오. 유리 현미경 슬라이드의 왼쪽과 오른쪽 3분의 1에 장착 매체 한 방울을 추가합니다.
각 방울 위에 커버 슬립을 놓아 커버 슬립 브리지를 만듭니다. 오른쪽 커버 슬립의 바깥쪽 가장자리를 매니큐어로 밀봉하고 커버 슬립 사이에 장착 매체 한 방울을 추가합니다. 겸자를 사용하여 시신경엽이 손상되지 않도록 각별한 주의를 기울여 뇌를 슬라이드로 부드럽게 옮깁니다.
얇은 판과 수질 뉴런의 세포체를 시각화하려면 텅스텐 바늘을 사용하여 더듬이 엽이 바깥쪽으로 돌출된 앞쪽 위치에 뇌의 방향을 지정합니다. 소엽 복합체의 뉴런을 시각화하려면 더듬이 엽이 슬라이드 위치에 대해 아래를 향하도록 뇌를 후방으로 배치합니다. 모든 시신경 세포를 단일 평면에서 시각화하려면 뇌를 수평 위치로 향하게하고 뇌를 전방 마운트에 정렬 한 다음 텅스텐 바늘을 사용하여 각 뇌를 위쪽으로 90도 회전시켜 복부 쪽에 앉게하고 커버 슬립의 가장자리에 놓습니다.
성인의 뇌가 적절하게 방향을 잡았을 때 오른쪽 및 왼쪽 가장자리가 다른 두 개의 덮개 쪽지와 겹쳐져 다리를 형성하도록 뇌 위에 최종 덮개 쪽지를 놓고 매니큐어로 슬라이드를 밀봉합니다. 다음은 전방 장착 방향에 있는 유충 시신경엽의 이미지입니다. 전방 장착 방향에서는 중앙 시끄러운 증식 센터의 상피, 수질 신경 아세포 및 층판 뉴런이 뇌를 감싸는 세포 띠로 표면에 나타납니다.
뇌 깊숙한 곳, Z-스택의 중앙에는 주요 외부 증식 중심 상피와 각각의 신경 아세포 및 뉴런이 보입니다. 또한, 내부 증식 중심의 상피와 소엽 플러그의 뉴런은 이러한 중간 절편에서 볼 수 있습니다. 가장 깊은 Z 절편은 바깥쪽 증식 센터의 뒤쪽 끝이 위치한 뇌의 다른 쪽을 묘사합니다.
내부 증식 센터의 표면 끝부분도 존재합니다. 이것들은 시신경엽이 후방에 장착된 경우 볼 수 있는 첫 번째 구조입니다. 다음은 측면에 장착된 시신경엽의 이미지입니다.
측면 마운트의 표면에서 lamina 초승달이 보이고 lobula plug 초승달이 팔 사이에 있습니다. 수질 신경 초승달은 약간 더 깊은 Z 위치에서 나타납니다. 다음은 전방 방향으로 장착된 성인 시신경엽의 이미지입니다.
수질은 전방 산의 표면에 위치하기 때문에 수질 피질은 즉시 볼 수 있습니다. 피질의 세포체는 중간 Z 위치에서 시각화할 수 있는 신경pil에 arborizations를 투영합니다. 소엽은 또한 이 수준에서 나타나며 수질에 수직으로 향합니다.
시신경엽의 마지막 신경파일인 가장 깊은 Z 위치에서 소엽판을 볼 수 있습니다. lobula plate는 posterior mount에서 볼 수 있는 첫 번째 구조입니다. 다음은 수평 방향으로 장착된 성인 시신경엽의 이미지입니다.
뇌를 옆으로 90도 뒤집어 수평으로 위치시키면 시신경엽의 모든 신경필과 피질이 단일 평면에서 볼 수 있습니다. 이 프로토콜을 수행할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 프로토콜 전반에 걸쳐 뇌 조직을 용액에 담그는 상태로 유지하는 것입니다. 뇌가 공기에 노출되면 얼룩의 품질과 최종 이미지가 크게 저하됩니다.
장착 방향이 시신경 엽 시각화에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 것은 실시간 이미징에 중요합니다. 유충 및 성충 뇌는 세포 분열 또는 자신의 형태 변화를 추적하기 위해 며칠에 걸쳐 배양하고 이미지화할 수 있습니다. 여기서 장착 방향이 매우 중요한데, 관심 세포 유형이 in vivo 형광 신호의 최적 검출을 위해 cover slip에 가까워야 하기 때문입니다.
