이 프로토콜은 여러 다운스트림 응용 프로그램에 대한 Drosophila pupal 눈 조직의 격리를위한 효율적인 방법이기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 조직을 손상시키지 않고 많은 수의 pupal 눈의 빠른 해부를 허용한다는 것입니다. 드로소필라 푸팔 망막의 해부는 초보자에게 도전이 될 것입니다.
이 기술을 연습하는 것이 해분의 속도와 결과의 품질을 향상시키는 가장 좋은 방법입니다. 드로소필라 푸파를 검은 해부 접시에 넣은 후, 양면 테이프를 해부 접시에 놓고, 강아지에서 멀리 떨어진 곳에 양면 테이프를 놓고, 강아지 등쪽을 테이프위에 조심스럽게 올려놓습니다. 접시를 스테레오 현미경 아래에 놓고 집게를 사용하여 각 강아지의 오퍼쿨룸을 제거합니다.
미세 절 부 가위를 사용하여 각 pupal 케이스를 슬라이스하여 머리, 흉부 및 전방 복부 세그먼트를 드러내고 푸팔 케이스의 가장자리를 양면 테이프로 고정할 수 있도록 합니다. 날카로운 집게로 각 강아지의 복부를 관통하고, 푸팔 케이스에서 강아지를 제거합니다. 강아지를 해부 접시에 놓고 테이프에서 멀리 떨어진 곳에 놓고 400 마이크로리터의 얼음 차가운 PBS로 강아지를 덮습니다.
집게를 사용하여 복부에 의해 각 것을 파악하고 미세 절 가위를 사용하여 흉부를 통해 하나의 깨끗한 단면 절개를 만들어 새끼를 반으로 자른다. 두 쌍의 미세 한 개의 미세 한 집게를 사용 하 여 각 흉부 상피의 절단 된 가장자리를 잡고 점차적으로 흉부와 머리 캡슐을 열고 눈물, 눈 - 뇌 복합체와 주변 지방 조직을 노출. 그런 다음 조직을 파악하지 않고 집게를 사용하여 각 반투명, 오프 화이트, 아령 모양의 눈 - 뇌 복합체를 머리 캡슐의 잔해에서 멀리 안내하십시오.
6~10개의 강아지를 해부한 후 깨끗한 면도날로 마이크로피펫 팁을 직경 약 1mm로 자르고 PBS와 지방이 혼합된 팁을 윤활합니다. 윤활피 팁을 사용하여 눈-뇌 복합체를 얼음에 400 마이크로리터가 들어있는 9웰 유리 접시의 한 우물로 옮은 다음, 20마이크로리터의 PBS 마이크로리터로 조직을 얼음에 35분 간 배양하기 위해 최소 250마이크로리터로 옮길 수 있습니다. 고정의 끝에서, 얼음에 5 ~ 10 분 동안 신선한 PBS의 400 마이크로 리터를 포함하는 세 번째 우물로 조직을 전송하는 동일한 파이펫 팁을 사용합니다.
비특이적 항체 결합을 차단하기 위해 눈-뇌 복합체를 PBS 400 마이크로리터와 트리톤 X로 옮겨 얼음에 10-60분 간 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 일차 항체 용액의 10 마이크로리터를 72웰 마이크로웰 플레이트의 필요한 수의 우물로 인용하고, PBS 플러스 트리톤 X로 윤활된 0.5밀리미터 팁이 있는 P10 공기 변위 마이크로파이프를 사용하여 5개 이상의 눈-뇌 복합체를 전송하지 않고 각 PBS의 미세한 약체에 더 이상 미세하게 전달하지 않습니다. 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 잠복한 후, PBS 400 마이크로리터와 트리톤 X를 9웰 유리 접시에 넣고 세척당 5~10분 동안 샘플을 두 번 씻습니다.
세 번째 세척 후, PBS 플러스 트리톤 X의 400 마이크로 리터에 3 5 ~ 10 분 세척에 따라, 실온에서 2 시간 동안 적절한 이차 항체 용액의 100 마이크로 리터로 조직을 전송하고 PBS에서 1 개의 세척을 합니다. 그런 다음, 1~2시간 동안 마운팅 배지의 200마이크로리터에서 샘플을 상형화한다. 인큐베이션의 끝에서, 현미경 슬라이드에 샘플을 전송하고, 해부 현미경아래 슬라이드에 눈 뇌 복합체를 고정하는 튼튼한 텅스텐 바늘을 사용합니다.
그런 다음, 미세 텅스텐 바늘을 사용하여 각 눈을 관련 광학 엽에서 멀리 슬라이스하고 눈의 기저 표면이 슬라이드에 인접하도록 현미경 슬라이드의 표면으로 각 눈을 기동합니다. 그런 다음 샘플 위에 깨끗한 커버 슬립을 적용하고 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉하십시오. 서양 얼룩 분석을 위한 pupal 눈 조직을 준비하기 위하여는, 먼저 이전에 2개의 배치에서 입증된 것과 같이 10 에서 16 pupae를 해부하기 위하여, 프로테아제와 인산염 억제기로 보충된 PBS에서 10- 15 분 떨어져.
PBS 플러스 억제제 400 마이크로리터에 얼음에 9웰 유리 접시의 개별 우물에서 두 번 고립 된 눈 뇌 복합체를 잠시 헹구고, 모든 눈 - 뇌 복합체를 얼음 차가운 PBS 플러스 억제제 400 마이크로 리터로 옮기고 깨끗한 검은 해부 접시에 디캔션합니다. 깨끗한 해부 현미경하에서 튼튼한 텅스텐 바늘과 미세면도날 날을 사용하여 눈의 눈을 광학 엽에서 깨끗하게 자르고 윤활 팁을 사용하여 눈-뇌 복합체를 PBS의 5 마이크로리터와 얼음에 있는 500마이크로리터 마이크로센트심리후지 튜브로 옮겨 넣습니다. 그런 다음, 서쪽 조직 리시스 완충제의 5마이크로리터와 2X 농축 단백질 샘플 버퍼의 10 마이크로리터를 튜브에 첨가한다.
RNA 추출을 위한 눈-뇌 복합체를 처리하려면 장갑을 착용하고 벤치탑, 현미경, 해부 도구 및 70%에탄올 및 RNase 제염 시약으로 검은 해부 요리를 청소하십시오. 이 지역이 건조할 수 있게 한 후, 총 30~40개의 푸파를 6~8개 로 해부한다. 눈-뇌 복합체의 각 배치가 해부 된 후, 깨끗한 해부 접시에 신선한, 얼음 차가운, 뉴클레아스가없는 PBS의 400 마이크로 리터로 눈 - 뇌 복합체를 전송하고, 튼튼한 텅스텐 바늘과 미세 면도날을 사용하여 깨끗한 눈의 각 눈을 깨끗하게 잘라.
배치에 대한 모든 눈이 제거되면, 멸균, RNase가없는 미세 원심 분리기 튜브로 전송하고 다음 배치로 진행하기 전에 액체 질소로 샘플을 플래시 동결. pupal 눈은 형태 발생을 구동 하는 그들을 포함 하 여 개발 과정을 조사 하기 위한 훌륭한 모델 역할을 하는 쉽게 액세스할 수 있는 조직. 푸파리움 형성 후 약 40시간 후, 세포의 최종 배치가 달성된다.
이것은 유전 돌연변이 또는 수정된 유전자 발현의 결과를 평가하는 이상적인 나이입니다. 예를 들어, 세포멸의 핵심 억제제인 Diap1의 자궁 외 발현에 이어, 격자 세포의 수의 증가는 대조군 망막에서 관찰되는 것과 비교될 수 있다. 세포멸증은 또한 항체를 활용하여 사망 카스파제-1을 활성화하거나 죽어가는 세포를 검출하기 위한 다른 접근법을 사용하여 보다 직접적으로 평가될 수 있다.
눈 용액의 서양 얼룩 분석은 관심있는 단백질의 존재 또는 상대적 발현을 결정하거나 다른 발달 시점에서 단백질 발현을 비교하는 데 사용될 수 있습니다. 유전자형 또는 실험 조건당 60개 이상의 눈을 해부하는 것이 충분한 고품질 RNA를 분리하는 데 최적입니다. 기억해야 할 가장 중요한 것은 푸팔 망막이 매우 깨지기 쉽고, 무결성을 보장하기 위해 해부 중에 세심한 주의를 기울여야 한다는 것입니다.
