이 작품은 HY에 Ehrman의 교제에 의해 지원되었다. H., DV, JR에 뉴욕 대학교 학장의 학위 논문 CD에 DJ로 휄로 십, NIH GrantR01 EY13010 및 DFG 교제에 RJJ, NIH 그랜트 F32EY016309에 의학 연구 박사 친목을위한 제인 코핀 일즈 기념 기금 (RI 2208/1- 1). 우리는 원고에 대한 의견 니나 Vogt와 파멜라 Boodram 감사드립니다.

1. 소개 세 번째 instar 애벌레의, midpupal과 성인 무대 :이 동영상에서는, 우리는 세 가지 정의 개발 기간의 망막 dissections 및 immunohistochemistry하는 방법을 설명합니다. 우리 프로토콜 다른 pupal 단계 (초기 단계에 대한 자세한 내용은, 16 참조)를 위해 일이지만 하나의 초점 평면과 핵의 모든 푸에르토 리코 놈들이의 시각화을 용이하게하는, 쉽게 식별 할 수있는 이미지에 적합하므로, 우리는 midpupal 단계를 선택 전사 인자의 발현 패턴. 후반 pupal 망막의 해부는 성인 망막의 해부와 매우 유사합니다. 첫째, 우리는 원하는 단계에서 유충과 pupae를 수집하는 방법을 보여줍니다. 그런 다음, 우리는 애벌레의 17-18, midpupal 및 성인 망막의 최적 dissections를 얻는 방법에 대해 설명합니다. 둘째, 우리는 immunohistochemistry와 공 촛점 현미경을 사용하여 이러한 단계에서 PR 개발을 시각화하는 방법을 보여줍니다. 곤충의 발달 기간은 온도에 따라 달라지게된다. 애벌레와 pupae의 재현 준비를 촉진하기 위해, 우리는 12 hr/12 시간의 빛 / 어둠의주기에 따라 25의 모든 비행 주식 ° C를 양육하는 것이 좋습니다. 공급 instar의 애벌레 : 96에 대해 알 부설 후 시간 (25 ° C에서), 늦은 셋째 instar의 애벌레 정류장 먹이하고 결국 번데기가되다 식품 유리 병의 벽에 산책. 부드럽게 식품 유리 병의 벽에서 방황 제 instar 애벌레를 제거하는 부드러운 브러쉬 나 집게를 사용하십시오. 50 % pupae ( &#39;midpupae&#39;는) pupation 후 48 시간을 관찰합니다. 정확한 타이밍를 들어, 음식 유리 병에 마커로 그냥 형성된 흰색 pupae를 동그라미 수 있습니다. 또한, 균일 한 준비의 병을 (형태학의 기준을 사용하여 pupae의 준비를 위해, 19 참조) 얻기 위해 새로운 유리 병에 모든 흰색 pupae 이동합니다. 후 48 시간 신중하게 수치집게를 사용하여 유리 병에서 midpupae을 ove. 성인 파리 : CO 2 패드에 마취 젊은 성인 파리 (2~5일 eclosion 이후). 집게를 사용하여 헤드를 제거하고 유리에 보관이 잘 차가운 1X PBS를 포함하는 요리. 3. 분해 절차 (실험 1-2에 대해 시간) 표본을 수집 한 후, Sylgard의 분해 요리에 차가운 PBS의 드롭에 배치합니다. 유전자형 당 10-15 망막에 대한 해부. 시약 및 장비의 적절한 처리에 대한 물질 안전 데이터 시트뿐만 아니라 교육 기관의 환경 보건 및 안전 사무소 (이 프로토콜의 끝에 테이블을 참조) 참조하십시오. 1. 애벌레의 눈 Imaginal 디스크 <ol><li> 입 후크를 포함하는 유충의 앞쪽 끝을 찾습니다. Sylgard 요리의 기본에 대해 부드럽게 유충의 가운데 부분을 눌러 집게를 사용하십시오. anoth를 사용하여응급실은 입 후크를 움켜 잡고 몸에서 부드럽게하고 서서히 끌어 포셉. 신체의 주요 부분을 취소하고 뇌에 첨부 된 상태로 유지 imaginal 디스크에서 필요없는 조직을 제거하기 위해 앞 부분을 보유하는 mouthparts을 사용합니다. </li><li> 3 잘 유리 접시에 1X PBS에 집게로 입 갈고리를 잡아서 imaginal 디스크로 뇌를 전송합니다. 고정 단계 (단계 4.1). 수행합니다. </li><li> 고정 후, 지방 조직을 침샘을 제거하고 눈 antennal imaginal 디스크에서 떨어져 뇌를 당긴다. &#39;어려운&#39;항체의 접근성을 개선하기 위해 상피의 표면에있는 peripodial 막은, 디스크의 antennal 부분을 누른 상태 해부 핀을 멀리 멤브레인을 필링으로 제거 할 수 있습니다. 다음으로, immunohistochemistry (단계 5.1). 수행합니다. </li></ol> 2. 50 % Pupation / Midpupal 망막 <ol><li> 집게와 pupal 가지 경우 뒤쪽 끝을 잡아.부드럽게 다른 집게로 큐티클을 잡아서 pupal 사건의 앞쪽 표면을 제거하고 천천히 번데기에서 떨어져 당긴다. 물러 머리를 노출하는 잔류 큐티클. </li><li> 피어스 등쪽의 앞 지역의 기본, 부드러운 자루에 포셉 &#39;팁을 사용하십시오. 이 머리에 액세스 할 수 있습니다. 부드럽게 천천히 P20의 피펫으로 머리를 빨아하여 가슴에서 머리를 분리. 신선한 차가운 1X PBS에 피펫 팁의 머리를 추방하고 초과 조직을 제거하고, 머리 표피를 잡아 코를 제거합니다. 고정 단계 (단계 4.1.)로 진행합니다. </li><li> 안정된 조직 한 해부 핀 피어스는 광 엽. 얇은 판과 얇은 판 / 광 엽에서 망막을 분리하기 위해 망막 사이에 다른 해부 핀을 삽입합니다. immunohistochemistry (단계 5.1). 수행합니다. </li></ol> 3. 성인 눈 <ol><li> 집게와 함께 뒤쪽 머리 캡슐의 중심을 잡고 입 부품 (코), 지​​방 tiss를 제거UE와 tracheae. </li><li> 한 집게로 등쪽의 머리 표피를 잡고 부드럽게 옆으로 당겨 뇌 조직에서 눈을 분리하는 다른을 사용합니다. 대부분의 경우, 얇은 판, 뇌 neuropil의 얇고 투명한 피복은 망막에 부착 남아있을 것입니다. 그것은 고정 후 얇은 판을 제거하는 것이 더 쉽습니다. </li><li> 눈 여백에 큐티클을 제거하지만, 다른 솔루션에 망막의 전송을 촉진하기 위하여 뒤에 작은 조각을 두십시오. (단계 4.1.) 고정을 수행합니다. </li><li> 집게로 한쪽에서를 쥐어 조심스럽게 망막을 혼란하게 다른 집게로 옆으로 당겨 얇은 판을 제거합니다. 가 장착되는 동안 망막에 접어 될 수 있으므로 잔류 큐티클을 제거합니다. 이 두 단계는 달리 얇은 판으로 덮여 있으며 이미징 과정에서 표피의 유적 될 photoreceptors을 시각화 중요하다. immunohistochemistry (단계 5.1.)로 진행합니다. </li></ol> 4. 고정 및 와시NG (약 1 시간) <ol><li> 갓 (1X PBS, 얼음에 소용돌이 및 매장 360 μl 37 %의 포름 알데히드 용액의 40 microliters을 희석) 정착액을 준비하는 동안 얼음에 위치 3 잘 유리 접시에 1X PBS에서 해부하는 망막를 저장합니다. 우리는 고정 프로토콜을 진행하고 얼음 (&gt; 15 분)에 긴 저장 시간을 방지하는 것이 좋습니다. </li><li> 3.7 %의 포름 알데히드 용액 200 μl와 1X PBS를 교체하십시오. 조직 정착액에 잠겨되어 있는지 확인하십시오. 이 달리 제대로 고정되지 않을 수 있으므로 이것은 중요합니다. 필요한 경우, 포셉과 기포와 tracheae를 제거합니다. </li><li> 실온에서 15 분에 쉐이커에 품다. </li><li> 1X PBS로 정착액을 교체하고 1X PBS로 두 번 씻어. 30 분 (셰이커에, 상온에서)을 PBS에 세척 계속합니다. </li><li> PBST로 PBS를 교체하십시오. PBST로 두 번 씻어. </li><li> 애벌레의 눈 디스크 (3.1.3.)와 midpupal / 성인 망막에서 laminas에서 peripodial 멤브레인을 제거 진행 &lt;STRONG&gt; (3.2.3., 3.3.4.). </li></ol> 5. Immunohistochemistry <ol><li> 차단 : 상온에서 흔드는 20 분에 PBST 및 배양 망막 5 % 정상 혈청 200 μl와 PBS를 교체하십시오. </li><li> 기본 항체 솔루션을 차단 솔루션을 대체합니다. parafilm으로 세 잘 요리를 밀봉하고 실온에서 흔드는을 하루 아침에 품다. </li><li> PBST로 솔루션을 교체하고 3 번 씻어. 상온에서 흔드는에서 1 시간의 최소 PBST로 세척 계속합니다. </li><li> 실온에서 하룻밤 흔드는에 parafilm - 밀폐 된 유리 잘 요리의 보조 항체 솔루션과 배양에 전송. </li><li> PBST로 항체 솔루션을 교체하고 세 번 씻어. 상온에서 흔드는에서 한 시간의 최소 PBST로 세척 계속합니다. 샘플은 여러 가지 일 PBST에 보관하지만, 밖으로 건조에서 그들을 방지하기 위해 적어도 하루에 한 번 신선한 PBST를 추가하는 것이 중요합니다 수 있습니다. </li></ol> 6. 엠ounting <ol><li> 애벌레의와 midpupal 망막를 장착 들어, 깨끗한 유리 슬라이드의 중심에 망막을 전송할 P20를 사용합니다. 초과 PBST를 제거합니다. 영상을 촉진하기 위해 망막을 정렬 집게를 사용하십시오. </li><li> 망막의 상단에 미디어를 마운트의 10 μl를 추가합니다. 투명 매니큐어와 24x40-1 커버 슬립과 도장 부드럽게을 다룹니다. </li><li> 마운트 성인 망막를 들어, &#39;다리&#39;(20) 준비 : 유리 측의 양쪽에 50 % 글리세롤의 두 5 μl 방울을 추가하고 22x22-1 커버 용지 (두께 0.13-0.17 mm)로을 다룹니다. </li><li> P20의 피펫으로 PBST를 제거하고, 망막 아웃 건조하지 있는지 확인하십시오. 잘에 매체를 장착 20 μl를 추가합니다. &#39;다리&#39;유리 슬라이드에 P20와 망막을 전송하는 설치 매체를 사용하십시오. </li><li> 방향에 집게를 사용합니다 (렌즈는 유리 슬라이드에 직면한다) 및 이미징을 촉진하기 위해 망막을 맞 춥니 다. 필요한 경우, P20과 기포를 제거합니다. </li><li> 천천히투명 매니큐어 또는 스카치 테이프 상단과 인감 가장자리에 한쪽 곳에서 24x40-1 커버 슬립 (두께 0.13-0.17 mm). 스토어 샘플 4에 ° 현미경 슬라이드 보호기 상자에 C (어둠 속에서 유지). </li></ol> 7. 대표 결과 이 프로토콜의 응용 프로그램에 대한 예를 들어, 우리는 동영상에 세 발달 단계에서 photoreceptor의 차별화를 시각화를위한 대표적인 결과를 보여줍니다. 애벌레의 눈 antennal 디스크 및 midpupal 망막들은 개발 (그림 1A, B) 동안 다른 photoreceptor 유형을 라벨 및 성인 망막는 두 photoreceptor의 하위 유형 (그림 1C)을 시각화 두 Rhodopsin 항체 물들 된 항체 물들했다.

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

1. 문제 해결 우리의 경험에서 dissections가 연습 (최대 몇 주까지)이 필요하고 테이블에 팔꿈치와 팔을 쉴 의해 손가락 분해 요리와 접촉을 갖춘 편안한 손의 위치 21 달성에 의해 촉진된다. 이렇게 만 엄지 손가락, 색인 및 중간 손가락이 미묘한 움직임을 수행합니다. photoreceptors를 손상시키지 않고 얇은 판을 제거하면 아마도 가장 어려운 단계입니?...

<table border="1"><tr><td></td><td></td><td></td><td> 시약 </td></tr><tr><td> (PBS1x, 산도 7.4) 생리 인산염 버퍼 </td><td> 시그마 </td><td></td><td> 10X 재고 솔루션 (20)를 준비합니다. 실온에서 1X PBS와 상점을 얻기 위해 증류수로 희석. dissections 전에 얼음에 냉각. </td></tr><tr><td> 트리톤 - X 100 </td><td> 시그마 </td><td> 9002-93-1 </td><td> 주의 :! 자극 장갑을 착용한다. 와 0.3 % 트리톤 X-100 (PBST). 50 ML의 1xPBS 준비 실온에서 보관하십시오. </td></tr><tr><td> 37%의 포름 알데히드 용액 </td><td> 피셔 과학 </td><td> F75P1GAL </td><td> 주의 :! 독성, 가능성이 인간의 발암 물질이 장갑을 착용한다. 고정 단계 전에, 신선한 얼음에 PBS로 diluting하여 화학 퓸 배출 후드에 매장을 3.7 % 용액을 준비. </td></tr><tr><td> 5% 정상적인 말 혈청 </td><td> 잭슨 Immuno 연구 </td><td> 008-000-001 </td><td> PBST 5 % V / V 희석을 준비합니다. 네도에서 보관하십시오. </td></tr><tr><td> 기본 및 보조 항체 (예 : 돈키 안티 - 양, 알렉사 형석 488, 동키 - 반 토끼, 알렉사 형석 555, 돈키 안티 - 마우스 알렉사 형석 647) </td><td> Invitrogen 분자 프로브 </td><td> A11015 A31572 A31571 </td><td> 네도에서 PBST과 매장에서 1:800 보조 항체를 희석. </td></tr><tr><td> 알렉사 형석 488 Phalloidin </td><td></td><td> A12379 </td><td> 차 항체 용액에 1:100을 희석. </td></tr><tr><td> Slowfade 골드 Antifade 시약 </td><td> Invitrogen 분자 프로브 </td><td> S36936 </td><td> 매체를 장착. -20도에서 보관하십시오. </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> 피셔 과학 </td><td> G31-1 </td><td> 장착하십시오. 온도는 실온에서 증류수, 상점과 50 %의 희석의 10 ML를 준비합니다. </td></tr><tr><td> CO 2 </td><td></td><td></td><td> 파리 성충을 anesthetizing하십시오. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 두 날카로운 집게 (뒤몽 # 55) </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11255-20 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트 </td><td> 다우 코닝 </td><td></td><td> Sylgard 혼합으로 플라스틱 페트리 접시를 작성하여 Sylgard의 분해 요리를 준비합니다. </td></tr><tr><td> 세 잘 유리 분해 요리 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 21-379 </td><td></td></tr><tr><td> TWO minutien 해부 핀 (0.1 mm 직경)와 두 개의 pinholders (12 ㎝) </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 26002-10 </td><td> 두 pinholders의 각 한 minutien 핀을 삽입하고 후크를 형성하기 위해 핀 중 하나를 구부린다. </td></tr><tr><td> 현미경 커버 용지 (22x22-1과 24x40-1) </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12 542A </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 슬라이드 (25x75x1.0 mm, precleaned) </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12-550-143 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 ML의 microcentrifuge 관 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 폴란드어 또는 스카치 테이프를 손톱 삭제 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 궤도 셰이커 </td><td> Bellco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 슬라이드 홀더 상자 </tD&gt; <td> 피셔 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Bemis </td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td> 얇은 붓 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> P20와 P200 micropipettes 및 팁 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 현미경을 해부 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 얼음과 작은 양동이 </td><td></td><td></td><td> 유리 잘 판, 해부하는 망막과 솔루션을 냉각하십시오. </td></tr></table>

dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult drosophila retinas

Drosophila melanogaster의 화합물 눈은 약 750 ommatidia (단위 눈)으로 구성되어 있습니다. 각 ommatidium는 렌즈 분비 콘 세포, 안료 세포, 억센 털 셀 및 8 photoreceptors (푸에르토 리코 놈들) R1-R8이 포함 약 20 세포로 구성되어 있습니다. 푸에르토 리코 놈들은 빛에 민감한 안료, Rhodopsins을 (RHS)를 포함 전문 microvillar 구조, rhabdomeres을 수 있습니다. 여섯 푸에르토 리코 놈들의 rhabdomeres (R1-R6)는 사다리꼴을 형성하고 Rh1 3 4이 포함되어 있습니다. R7 및 R8의 rhabdomeres는 사다리꼴의 중심에 직렬로 위치와 빛의 동일한 경로를 공유 할 수 있습니다. R7 및 R8 푸에르토 리코 놈들은 stochastically 두 가지 하위 유형 5 RHS의 다른 조합을 표현 : &#39;P&#39;하위 유형에서, P R7s의 Rh3는 P R8s에 Rh5와 결합되어, &#39;Y&#39;하위 유형에 Y R7s의 Rh4이 연관된 반면, Y의 Rh6는 6 7 8 R8s. 푸에르토 리코 놈들과 ommatidia 개발의 초기 사양은 애벌레의 눈 antennal imaginal 디스크, 상피 세포의 monolayer에서 시작됩니다. 차별화의 파도가 디스크 9에서 쓸어과 ommatidia 10-11로 undifferentiated 세포의 조립을 시작합니다. &#39;설립자 셀&#39;R8 먼저 지정하고 R7 12-14 R1-6 그리고 모집합니다.합니다 그 후, pupal 개발하는 동안, 홍보 차별화 rhabdomere 형성, synaptogenesis 결국 RH 표현을 포함한 다양한 형태학의 변화 15로 연결됩니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 망막 형성과 발달 경로에 관한 질문의 다양한 해결하기 위해 적용 할 수있는 망막 개발의 세 정의 된 기간에서 망막 dissections 및 immunohistochemistry하는 방법을 설명합니다. 여기, 우리는 전체 마운트 애벌레의, midpupal 및 성인 망막 (의 단일 셀 레벨에서 stepwise PR 차별화를 시각적으로 이러한 방법을 사용 <s&gt; 그림 1) trong.

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Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

<em&gt; Drosophila</em&gt; 망막은 틀에 박힌 방식으로 생성 된 세포 유형의 소수로 구성된 크리스탈과 같은 격자입니다<sup&gt; 1</sup&gt;. 정교한 유전자 분석에의 복종 할 의무는 복잡한 개발 프로그램의 연구를 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 photoreceptor 차별화를 중심으로 세 이산 발달 단계에서 dissections와 망막의 immunohistochemistry에 대해 설명합니다.

애벌레의, Pupal 및 성인의 해부 및 Immunohistochemistry<em&gt; Drosophila</em&gt; 망막

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

dissection-immunohistochemistry-larval-pupal-adult-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

25.1K 조회수.  New York University.  Drosophila 망막은 틀에 박힌 방식으로 생성 된 세포 유형의 소수로 구성된 크리스탈과 같은 격자입니다 1. 정교한 유전자 분석에의 복종 할 의무는 복잡한 개발 프로그램의 연구를 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 photoreceptor 차별화를 중심으로 세 이산 발달 단계에서 dissections와 망막의 immunohistochemistry에 대해 설명합니다.

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Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 expression is rarely tissue-specific enough to allow for precise correlation of the circuit with behavioral readouts. To overcome this major hurdle, we recently developed the FINGR method to achieve a more restrictive Gal4 expression in the tissue of interest. The FINGR method has three components: 1) the traditional Gal4/UAS system; 2) a set of FLP/FRT-mediated Gal80 converting tools; and 3) enhancer-trap FLP (ET-FLP). Gal4 is used to define the primary neural circuitry of interest. Paring the Gal4 with a UAS-effector, such as UAS-MJD78Q or UAS-Shits, regulates the neuronal activity, which is in turn manifested by alterations in the fly behavior. With an additional UAS-reporter such as UAS-GFP, the neural circuit involved in the specific behavior can be simultaneously mapped for morphological analysis. For Gal4 lines with broad expression, Gal4 expression can be restricted by using two complementary Gal80-converting tools: tubP&gt;Gal80&gt; ('flip out') and tubP&gt;stop&gt;Gal80 ('flip in'). Finally, investigators can turn Gal80 on or off, respectively, with the help of tissue-specific ET-FLP. In the flip-in mode, Gal80 will repress Gal4 expression wherever Gal4 and ET-FLP intersect. In the flip-out mode, Gal80 will relieve Gal4 repression in cells in which Gal4 and FLP overlap. Both approaches enable the restriction of the number of cells in the Gal4-defined circuitry, but in an inverse pattern. The FINGR method is compatible with the vast collection of Gal4 lines in the fly community and highly versatile for traditional clonal analysis and for neural circuit mapping. In this protocol, we demonstrate the mapping of FLP expression patterns in select ET-FLPx2 lines and the effectiveness of the FINGR method in photoreceptor cells. The principle of the FINGR method should also be applicable to other genetic model organisms in which Gal4/UAS, Gal80, and FLP/FRT are used.

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

We describe a Flippase-induced intersectional Gal80/Gal4 repression (FINGR) method, allowing tissue-specific FLP to determine Gal80 expression patterns. Wherever Gal4 and FLP overlap, Gal4 expression is turned on (Gal80 flipped out) or off (Gal80 flipped in). The FINGR method is versatile for clonal analysis and neural circuit mapping.

매핑 및 애벌레와 성인의 확장기 - 트랩 Flippase의 표현의 응용 Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

연구

신경과학

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

단일 Drosophila Ommatidium의 해부 및 이미징

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear. Since there is no cell line that satisfactorily represents mammalian hair cells, research on hair cells relies on primary organ cultures. The best-characterized in vitro model system of mature mammalian hair cells utilizes organ cultures of utricles from adult mice (Figure 1) 1-6. The utricle is a vestibular organ, and the hair cells of the utricle are similar in both structure and function to the hair cells in the auditory organ, the organ of Corti. The adult mouse utricle preparation represents a mature sensory epithelium for studies of the molecular signals that regulate the survival, homeostasis, and death of these cells.
Mammalian cochlear hair cells are terminally differentiated and are not regenerated when they are lost. In non-mammalian vertebrates, auditory or vestibular hair cell death is followed by robust regeneration which restores hearing and balance functions 7, 8. Hair cell regeneration is mediated by glia-like supporting cells, which contact the basolateral surfaces of hair cells in the sensory epithelium 9, 10. Supporting cells are also important mediators of hair cell survival and death 11. We have recently developed a technique for infection of supporting cells in cultured utricles using adenovirus. Using adenovirus type 5 (dE1/E3) to deliver a transgene containing GFP under the control of the CMV promoter, we find that adenovirus specifically and efficiently infects supporting cells. Supporting cell infection efficiency is approximately 25-50%, and hair cells are not infected (Figure 2). Importantly, we find that adenoviral infection of supporting cells does not result in toxicity to hair cells or supporting cells, as cell counts in Ad-GFP infected utricles are equivalent to those in non-infected utricles (Figure 3). Thus adenovirus-mediated gene expression in supporting cells of cultured utricles provides a powerful tool to study the roles of supporting cells as mediators of hair cell survival, death, and regeneration.

Mechanosensory hair cells are the receptor cells of the inner ear. The best-characterized in vitro model system of mature mammalian hair cells utilizes organ cultures of utricles from adult mice. We present the dissection of the adult mouse utricle, and we demonstrate adenovirus-mediated infection of supporting cells in cultured utricles.

성인 마우스 Utricle 및 아데노 바이러스 - 매개 지원하는 세포 감염의 해부

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

의 애벌레 먹이 회로의 기능적 분석 초파리</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of the nervous system often produce viable larvae and adults that have locomotion defective phenotypes that are difficult to adequately describe with text or completely represent with a single photographic image. Current modes of scientific publishing, however, support the submission of digital video media as supplemental material to accompany a manuscript. Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique for acquiring high-quality digital video of both Drosophila larval and adult phenotypes from a lateral perspective. Video of larval and adult locomotion from a side-view is advantageous because it allows the observation and analysis of subtle distinctions and variations in aberrant locomotive behaviors. We have successfully used the technique to visualize and quantify aberrant crawling behaviors in third instar larvae, in addition to adult mutant phenotypes and behaviors including grooming.

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique to acquire high-quality digital video of Drosophila adult and larval mutant phenotypes from a lateral perspective.

의 고품질의 디지털 비디오 취득<em&gt; 초파리</em&gt; 측면 관점에서 애벌레 및 성인 동작

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

전체 마운트 해부 및 성인 마우스 달팽이관의 면역 형광

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

선형 아가로 오스 채널을 사용하여 공부하기<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 크롤링 동작

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

간단한 한 단계 성인의 전체 마운트 준비에 대한 해부 프로토콜<em&gt; 초파리</em&gt; 두뇌

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

초파리 melanogaster Larval 및 성인 두뇌의 변화 분석

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...