치료와 그 운반선의 운송 특성을 특성화하는 것은 효과적인 생물학적 반응을 보장하기 위해 중요합니다. 이러한 방법은 음전하 조직을 대상으로 최적으로 충전된 약물 운반수단을 설계하는 데 도움이 됩니다. 이러한 기술의 주요 장점은 조직을 통한 솔루트 수송을 특징짓는 일련의 체외 실험을 통해 생체 내 치료 효능을 더 잘 예측할 수 있는 능력입니다.
골관절염과 같은 연골 질환은 조밀한 배반 연골 매트릭스를 관통하는 약물의 무능력으로 인해 치료되지 않고 남아 있으며, 약물 운반대가 치료 효능을 촉진하도록 요구합니다. 섬세한 작업 와이프를 사용하여 직경 3mm, 1mm 두께의 연골 익은 표면에서 과도한 PBS를 부드럽게 제거하십시오. 균형을 사용하여 각 축출물의 젖은 무게를 빠르게 기록하고 즉시 탈수를 방지하기 위해 PBS 욕조에 이출을 넣습니다.
다음으로, 갓 준비된 300마이크로리터, 30마이크로몰라 형광형으로 표기된 양이온 펩타이드 캐리어 용액을 96웰 플레이트의 내부 우물에 잘 넣고 주걱을 사용하여 각 용액에 각 각 우물에 하나의 해장을 추가합니다. 주변 우물각각에 300마이크로리터의 PBS를 채우고 뚜껑으로 접시를 덮습니다. 유연한 필름으로 플레이트 가장자리를 밀봉하여 증발을 최소화하고 15mm 궤도를 가진 분당 50 회전에서 24 시간 동안 37도 섭씨 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다.
인큐베이션이 끝나면 각 웰에서 각 폴리프로필렌 튜브로 평형 욕조를 옮기고 주식 30 마이크로몰라 양이온 펩타이드 캐리어 용액으로부터 직렬 희석을 하여 표준 곡선을 생성한다. 이어서, 각 용액의 200마이크로리터를 블랙 96웰 플레이트의 개별 우물로 옮기고 형광 라벨의 내분 및 방출 파장에 기초하여 각 시료및 표준의 형광 판독값을 얻는다. 연골 외유 내에서 양이온 펩타이드 캐리어 침투의 깊이를 확인하려면 메스를 사용하여 직경 6mm, 1mm 두께의 연골 이질을 반으로 자르고 프로테우스 억제제로 생성된 반 디스크 조각을 PBS를 보충하여 수분을 공급합니다.
맞춤형 1차원 수송 챔버의 중앙에 에폭시를 적용하고 챔버의 상류 측을 향한 각성의 피상적 측면으로 우물 내에 반 디스크 를 이식합니다. 연골의 확산 표면적과의 접촉을 방지하고 농출의 양쪽에 PBS를 보충 한 프로테아제 억제제 80 마이크로 리터를 추가하기 위해 우물에서 여분의 접착제를 제거하십시오. 액체를 각성의 한쪽에 위아래로 피펫하여 다른 쪽으로 누출을 확인합니다.
누출이 없는 경우, 상류측에서 PBS를 보충한 프로테아제 억제제를 30마이크로리터로 교체하고 양이온 펩타이드 캐리어 용액으로 분류된 30마이크로리터를 신중하게 세포 배양 접시에 배치한다. 양이온 펩타이드 캐리어 용액 증발을 피하기 위해 PBS로 접시의 베이스를 덮습니다. 업스트림 챔버와 다운스트림 챔버의 솔루션 간에 직접 접촉이 없다는 것을 주의하십시오.
덮인 접시를 셰이커에 놓고 실온에서 4~24시간, 분당 50회 회전을 15mm 궤도로 제한합니다. 인큐베이션의 끝에서, 챔버에서 각기를 제거하고 각 각 절제의 중심에서 약 100 미크로네 두꺼운 조각을 잘라. 유리 슬라이드와 커버 슬립 사이에 각 식제 조각을 놓고 신선한 프로테아제 억제제로 조각을 PBS를 보충합니다.
공초점 현미경의 단계에 슬라이드를 고정하고 10X 배율에서 슬라이스의 전체 두께를 통해 형광 이미지의 Z 스택을 얻을 수 있습니다. 이미지 파일 및 이미지 J를 열고 이미지를 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 스택 및 Z 프로젝트를 선택합니다. 그런 다음 슬라이스 번호를 하나의 최종 슬라이스로 입력하고 프로젝션 유형 아래에 평균 강도를 선택하고 확인을 클릭합니다.
비평형 양이온 펩타이드 캐리어 연골 확산 속도를 평가하기 위해, 수송챔버의 각 절반을 조립하여 대형 고무 개스킷 1개, 폴리메틸메타크레이트 인서트 1개, 작은 고무 개스킷 1개를 포함한다. 연골 의 두께를 측정한 다음, 상류 챔버를 향한 피상적 인 표면으로 플라스틱 인서트의 우물에 박출을 놓고 두 반쪽을 함께 샌드위치하여 조립을 완료합니다. 렌치를 사용하여 반쪽을 단단히 나사로 고정한 후 상류 챔버를 프로테아제 억제제 2밀리리터로 채우고 PBS를 보충합니다.
업스트림 챔버에서 누출되는 다운스트림 챔버를 확인합니다. 누출이 감지되지 않으면 다운스트림 챔버를 프로테아제 억제제 2밀리리터로 채우고 PBS를 보충합니다. 위류 챔버에 단일 미니 스터드 바를 추가하고 챔버가 정렬된 챔버에 챔버를 배치하여 분광광계에서 레이저가 다운스트림 챔버의 중심을 향해 초점을 맞춘다.
다운스트림 챔버 뒤에 분광미터의 신호 수신기 부분을 사용하면 최소 5분 동안 안정적이고 실시간 다운스트림 형광 방출 판독값을 수집합니다. 안정적인 판독값을 얻은 후, 상류 챔버에 형광 펩타이드 캐리어 스톡 용액의 미리 계산된 부피를 3마이크로몰러의 최종 목욕 농도로 추가하고, 하류 형광 신호를 모니터링하면서, 솔루트 수송이 경사면에서 꾸준히 증가하는 것을 허용한다. 정상 상태에 도달하면 업스트림 챔버에서 다운스트림 챔버로 20마이크로리터의 용액을 이송하여 스파이크 테스트를 하고 실시간 다운스트림 형광 판독값을 수집합니다.
양전하가 너무 높면 캐리어가 연골 매트릭스의 음전하 아그레칸 그룹에 너무 강하게 결합함에 따라 피상 지대에 대한 솔루트 침투를 제한합니다. 반대로, 약하고 가역적인 전하 상호 작용을 활용할 수 있는 운반대는 조직의 깊은 영역을 통해 관통한다. 최적으로 충전된 약물 운반대는, 그러나, 조직의 깊은 구역을 관통할 뿐 아니라, 또한 평형 목욕및 조직 젖은 무게의 형광 측정을 사용하여 결정할 수 있는 높은 조직 내 섭취를 보여줄 것입니다, 도시된 바와 같이.
비평형 확산 수송 실험은 점차 경사가 증가하는 데이터 생성 곡선을 초래한다. 곡선의 초기 부분은 용성 매트릭스 바인딩 상호 작용이 발생할 때 연골을 통해 용이성 확산을 나타냅니다. 솔루트가 다운스트림 챔버에 도달하면 시간이 지남에 따라 형광 판독값이 증가함에 따라 곡선의 경사가 증가합니다.
커브의 이 두 번째 부분은 안정적인 상태 확산을 나타내는 안정적인 경사에 도달합니다. 곡선의 정상 상태 부분에서 그려진 접선 선의 X 차단은 안정된 상태 확산 또는 타우 지연에 도달하는 데 걸리는 시간을 나타냅니다. 상류에서 하류 챔버로의 용액 전달에 따라 형광의 스파이크가 관찰되며, 이 시점에서 안정화된 형광 강도는 형광 강도를 농도와 상관시키는 데 사용될 수 있다.
대표적인 유효 확산성 및 정상 상태 확산 값을 계산할 수 있습니다. 정상 상태 확산성은 점령되는 모든 충전 기반 바인딩 사이트의 결과로 유효 확산성보다 두 배 더 높은 크기입니다. 따라서, 이 시점에서 확산은 크기와 전하가 아닌 것을 기반으로 하며, 이는 같은 크기의 CC들 사이에서 유사한 안정된 상태 확산 값을 초래한다.
각성 수분을 유지하고 실험 전반에 걸쳐 용액 증발을 최소화하여 연골 형태와 용액 농도의 변화를 방지하고 정확하고 재현 가능한 데이터 수집을 보장합니다. 최적으로 충전된 약물 운반체의 설계에 따라, 다양한 결합 기술은 조직 표적화를 위한 약물을 수정하고 생물학적 효능의 평가를 용이하게 하기 위해 활용될 수 있다.
