우리는 다음과 같은 자금 출처를 인정: NIH NINDS – K08NS101122 (JB), R01NS040337 (JK), R01NS044370 (JK), 버지니아 의과 대학 (JB).

모든 동물 연구는 버지니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
1. 전극 건물 / 케이블 건물
<ol><li>단극성 절연 스테인리스 스틸 와이어(0.005" 베어 직경, 0.008"코팅)를 사용하여 여성 소켓 커넥터(여성 리셉터클 커넥터 0.079)와 연결된 전극을 만듭니다.</li>
	<li>특수 맞춤형 케이블을 사용하여 동물을 앰프에 연결합니다.<ol>
<li>남성 4핀 커넥터(Male 커넥터 0.079")를 4채널 유니티 게인 어피던스 매칭 운영 앰프(op-amp)에 부착합니다. 9V 배터리에 연결되는 와이어에 10K 저항기를 부착합니다. op-amp에 연결되지 않은 접지 와이어는 배터리의 중간점 역할을 합니다.</li>
		<li>케이블의 한쪽 끝(AWG, 0.012" OD)을 op-amp에 연결하고 케이블의 다른 쪽 끝을 증폭기에 연결합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 전극 이식 수술
<ol><li>새끼 (산후 9 일)를 4-5 %의 이소플루란으로 마취하여 하향 흐름 후드에 있습니다. 시술시작 전에 부피바카인(0.02-0.05mL, 0.25% 피하국인 침전)으로 새끼를 주입한다.</li>
	<li>동물이 움직이지 않는 후 코 콘이있는 스테레오 전술 단계로 옮습니다. 머리를 안정적으로 유지하는 것이 부드럽기 때문에 이어 바의 역쪽을 사용합니다. 이 나이에 새끼는 이어 바의 뾰족한 끝을 사용하기 위해 완전히 발달 된 귀가 없습니다.</li>
	<li>이소플루란의 흐름을 거절하고 2.5-3 %로 유지합니다. 수술 시술 내내 강아지의 꾸준한 호흡을 주시하십시오. 꼬리를 꼬집어 통증 반응을 확인한 다음 절개를 진행합니다.</li>
	<li>베타딘과 알코올 (3 번갈아 요오드의 3 주기와 70 % 에탄올)와 두개골에 절개 영역을 살균. 절개 부위가 보이면 주변 신체 부위를 드레이프합니다.</li>
	<li>눈 위에서 두피 앞쪽 후방을 약간 열고 약 0.5cm의 피부를 후퇴시킵니다. 마우스 머리를 스테레오탁 스테이지에 재배치하여 피부가 두개골을 노출하는 바깥쪽으로 당겨지게 합니다.</li>
	<li>면봉을 사용하여 두개골에 과산화수소를 바르고 메스 블레이드를 사용하여 두개골을 깨끗하게 긁어냅니다. 두개골은 매우 부드럽습니다. 긁는 동안주의하십시오.</li>
	<li>접착제 1방울(약 50μL)을 적용하여 노출된 두개골 부위 주위에 퍼뜨려 어플리케이터를 사용합니다. 40s의 UV 광에 노출하여 접착제를 설정합니다.</li>
	<li>노출된 bregma를 참조로 사용하여 좌표를 측정합니다. 임플란트 전극은 해마의 CA1 영역에서 양자간 [-3.5 mm 도르살-벤탈(DV), ±2mm 내측-측면(ML), -1.75mm 딥(D)] 및 정수리 피질에서 양자간 [-1.22 mm DV, ±0.5mm ML, -1mm D] 및 전기전극7의 전기전극. 32 G 바늘을 사용하여 표시된 영역에 구멍을 만듭니다.</li>
	<li>두개골 표면에서 혈액을 청소합니다. 여성 소켓 커넥터에 부착된 낮은 전극은 스테레오탁스 암의 도움으로 뇌에 부착되어 치과 아크릴로 고정합니다. 뇌의 전극을 이식합니다. 소켓 커넥터 헤드셋은 치과 아크릴에 의해 함께 붙어 두개골 의 상단에 앉아있다.</li>
	<li>전극이 고정되면 케토프로펜(5 mg/kg)을 교차 부위에 피하한다. 새끼를 어머니와 함께 다시 놓습니다. 참고: 한 번에 하나씩 소개하는 대신 헤드셋이 있는 쓰레기의 절반을 어머니에게 한 번에 하나씩 소개합니다. 이렇게 하면 어머니가 강아지의 헤드셋을 손상시키는 것을 방지할 수 있습니다.</li>
</ol>3. EEG 설정 및 기록 (기준 / 사전 부상)
<ol><li>전극 이식 후 24 시간 의 회복 후, EEG 레코딩을위한 가열 (37 °C) 주문 제작 플렉시 글라스 챔버에 각 동물을 배치합니다. 이 챔버는 저산소챔버역할을 할 것이다.</li>
	<li>유연한 케이블(사용자 지정 제작 op-amp 케이블)을 통해 챔버의 새끼를 비디오-EEG 모니터링 시스템에 연결합니다. 참고: 헤드셋을 제자리에 두고 마우스는 자유롭게 이동하며 행동에 차이가 없습니다. 전극 전선에 부착되면, 새끼가 자유롭게 챔버 를 통해 이동할 수 있도록 여유의 적당한 양을 제공하기 위해 챔버 밧줄 내에서 와이어를 조정해야합니다.</li>
	<li>잔디 증폭기사용으로 1K 게인으로 1000Hz에서 EEG 데이터를 디지털화합니다. 나중에 소프트웨어(예: LabChart Pro)를 사용하여 EEG 신호(3-70Hz 사이의 대역 패스 필터)를 검토합니다.</li>
	<li>경동맥 결찰 절차에 대한 동물을 분리하기 전에 30 분 동안 부상 전 기준선 EEG를 기록합니다.</li>
</ol>4. 왼쪽 경동맥 결찰
<ol><li>새끼 (산후 10 일)를 아래쪽 흐름 후드에 4-5 %의 이소플루란으로 마취하고 수유 패드에 특별히 배치 된 설정에 배치합니다. 동물 척추를 배치하고 종이 테이프로 앞다리를 고정합니다.<ol>
<li>이소플루란의 흐름을 2-3%로 낮춥습니다. 통증 반응을 위해 꼬리를 꼬집고 시술 내내 호흡을 모니터링합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>베타딘과 알코올 (3 번의 요오드 및 70 % 에탄올)으로 목 왼쪽에 절개 영역 (하악과 쇄골 사이)을 살균합니다.</li>
	<li>미세 시저를 사용하여 목 의 왼쪽에 약 1cm 길이의 절개를합니다. 해부 현미경을 사용하여 피하 조직과 피부를 조심스럽게 철회하여 경동맥을 노출시킵니다. 미주 신경을 식별하기 위해주의 (동맥에 측면 실행) 섬세하게 분리하고 동맥에서 철회.</li>
	<li>마이크로포스를 사용하여 동맥 아래에 5cm 길이의 멸균 실크 봉합사를 실어 두어 보실. 이중 매듭봉합사를 동맥 주위에 묶어 흐름을 바칩니다.</li>
	<li>피하 조직과 피부를 다시 당겨 여분의 봉합사를 잘라 노출 된 동맥을 닫습니다. 수의사 결합을 사용하여 절개를 밀봉하십시오.</li>
	<li>온난화 매트리스에 놓인 실온챔버에 동물을 연속 EEG 모니터링에 다시 배치합니다. 챔버를 열지 않도록 강아지 코어 온도의 스팟 적외선 온도 검사를 받아. 저산소증 에 앞서 동물이 1 시간 동안 회복되도록 허용하십시오.</li>
</ol>5. EEG 및 저산소증
<ol><li>산소 모니터를 통해 챔버 내에서 FiO2 (영감받은 산소의 일부)를 지속적으로 모니터링합니다.</li>
	<li>챔버를 100% N2 의 60 L/min, 0.415 L/min으로 100% O2로 플러시합니다. 챔버의 산소 포화도가 12%에 도달하면 O2 흐름을 변경하지 않고 N2 흐름을 10L/min으로 줄입니다. 작은 조정으로 FiO2 를 8%에서 45분 동안 유지합니다.</li>
	<li>저산소증 노출 45분 후 FiO2 를 21%로 되돌리보시면 됩니다.</li>
	<li>새끼가 챔버에서 회복하고 2 시간 후 저산소증에 대한 EEG에 모니터링해야합니다.</li>
	<li>기록 기간이 완료된 후, EEG 레코딩에서 마우스를 분리하고 어머니에게 돌아갑니다.</li>
</ol>6. EEG 분석
<ol><li>LabChart Pro에서 비디오로 EEG 파일을 분석합니다. 눈을 멀게 한 연구원이 발작과 배경 패턴에 대한 EEG를 표시해야합니다17. 발작은 명확한 진화17을 가진 고주파 리듬 날카로운 파도 배출 (≥3x 기준선)으로 10 초 이상 지속되는 전기 전극 이벤트로 정의됩니다.</li>
	<li>두 번째 맹목적인 연구원이 합의를 위해 무작위로 표시된 이벤트를 검토하십시오.</li>
	<li>각 표시된 전극 이벤트에 대한 관련 비디오를 검토하고 신생아 설치류 행동 발작 점수16에 따라 분석합니다. 간단히 말해서, 이 점수는 0-6(심각한 강장제-클로닉 동작에 부동성)에 이르기까지 다양합니다. 발작 반학을 더 특성화하려면 측면(다초점/양자 운동 대 초점/일방적 대 혼합)에 대한 동작을 분석합니다.</li>
	<li>전원 분광기를 만듭니다. 1024개의 데이터 포인트 크기의 코신 벨 데이터 창으로 빠른 푸리에 변환을 사용합니다. 87.5%의 창 중첩을 통해 분광기에 부드러운 x축을 만듭니다. μV218로 전원을 표현합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vasudevan, C., Levene, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+aetiology+of+neonatal+seizures.">Epidemiology and aetiology of neonatal seizures.</a> Seminars in Fetal &amp; Neonatal Medicine. , (2013).</li><li>Volpe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Seizures.">Neonatal Seizures.</a> Volpe's Neurology of the Newborn. , 275-321 (2018).</li><li>Shankaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+EKSNNR.+Childhood+outcomes+after+hypothermia+for+neonatal+encephalopathy.">Network EKSNNR. Childhood outcomes after hypothermia for neonatal encephalopathy.</a> New England Journal of Medicine. 366 (22), 2085-2092 (2012).</li><li>Pappas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+outcomes+after+neonatal+encephalopathy.">Cognitive outcomes after neonatal encephalopathy.</a> Pediatrics. 135 (3), 624-634 (2015).</li><li>van Schie, P. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+immaturity+on+hypoxic-ischemic+brain+damage+in+the+rat.">The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat.</a> Annals of Neurology. 9 (2), 131-141 (1981).</li><li>Burnsed, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-ischemia+and+therapeutic+hypothermia+in+the+neonatal+mouse+brain--a+longitudinal+study.">Hypoxia-ischemia and therapeutic hypothermia in the neonatal mouse brain--a longitudinal study.</a> PLoS One. 10 (3), 0118889 (2015).</li><li>Semple, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+development+in+rodents+and+humans:+Identifying+benchmarks+of+maturation+and+vulnerability+to+injury+across+species.">Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species.</a> Progress in Neurobiology. , 1-16 (2013).</li><li>Comi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gabapentin+neuroprotection+and+seizure+suppression+in+immature+mouse+brain+ischemia.">Gabapentin neuroprotection and seizure suppression in immature mouse brain ischemia.</a> Pediatric Research. 64 (1), 81-85 (2008).</li><li>Comi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+stroke+and+ischemic+seizures+in+the+immature+mouse.">A new model of stroke and ischemic seizures in the immature mouse.</a> Pediatric Neurology. 31 (4), 254-257 (2004).</li><li>Kadam, S. D., White, A. M., Staley, K. J., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+Electroencephalographic+Monitoring+with+Radio-Telemetry+in+a+Rat+Model+of+Perinatal+Hypoxia-Ischemia+Reveals+Progressive+Post-Stroke+Epilepsy.">Continuous Electroencephalographic Monitoring with Radio-Telemetry in a Rat Model of Perinatal Hypoxia-Ischemia Reveals Progressive Post-Stroke Epilepsy.</a> Journal of Neuroscience. 30 (1), 404-415 (2010).</li><li>Burnsed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Circuit+Activity+during+Neonatal+Hypoxic+-+Ischemic+Seizures+in+Mice.">Neuronal Circuit Activity during Neonatal Hypoxic - Ischemic Seizures in Mice.</a> Annals of Neurology. 86, 927-938 (2019).</li><li>Sampath, D., White, A. M., Raol, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neonatal+seizures+in+an+animal+model+of+hypoxic-ischemic+encephalopathy.">Characterization of neonatal seizures in an animal model of hypoxic-ischemic encephalopathy.</a> Epilepsia. 55 (7), 985-993 (2014).</li><li>Sampath, D., Valdez, R., White, A. M., Raol, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticonvulsant+effect+of+flupirtine+in+an+animal+model+of+neonatal+hypoxic-ischemic+encephalopathy.">Anticonvulsant effect of flupirtine in an animal model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy.</a> Neuropharmacology. 123, 126-135 (2017).</li><li>Kang, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+sex-dependent+susceptibility+to+phenobarbital-resistant+neonatal+seizures:+role+of+chloride+co-transporters.">and sex-dependent susceptibility to phenobarbital-resistant neonatal seizures: role of chloride co-transporters.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-16 (2015).</li><li>Zanelli, S., Goodkin, H. P., Kowalski, S., Kapur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+transient+acute+hypoxia+on+the+developing+mouse+EEG.">Impact of transient acute hypoxia on the developing mouse EEG.</a> Neurobiology of Disease. 68, 37-46 (2014).</li><li>Lewczuk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EEG+and+behavior+patterns+during+experimental+status+epilepticus.">EEG and behavior patterns during experimental status epilepticus.</a> Epilepsia. 59 (2), 369-380 (2017).</li><li>Wu, D., Martin, L. J., Northington, F. J., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillating+gradient+diffusion+MRI+reveals+unique+microstructural+information+in+normal+and+hypoxia-ischemia+injured+mouse+brains.">Oscillating gradient diffusion MRI reveals unique microstructural information in normal and hypoxia-ischemia injured mouse brains.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 72 (5), 1366-1374 (2014).</li></ol>

우리는 저산소 허혈성 발작 도중 신생아 마우스에 있는 지속적인 비디오 EEG 감시를 위한 모형을 제시했습니다. EEG와 함께 비디오 분석을 통해 발작 반학의 특성화를 허용합니다. EEG의 분석은 전력 분광 및 배경 진폭 분석의 추출을 허용합니다.
전극 배치 또는 부정확한 배치 중 부상이 결과에 크게 영향을 줄 수 있기 때문에 이 프로토콜에서는 전극의 정확하고 신중한 배치가 ...

저산소 허혈성 뇌병증 (HIE)은 매년 신생아 1000명 중 1.5명에 영향을 미치는 상태이며 신생아 발작의 가장 흔한 원인입니다1,2. 살아남은 유아는 뇌성 마비, 지적 장애 및 간질3,4,5와 같은 다양한 신경 장애의 위험이 있습니다.
동물 모델은 저산소증 허혈및 신생아 발작의 병리생리학을 이해하고 조사하는 데 중요한 역할을합니다6,7. 변형된 반누치 모델은 산후 10일째(p10)7,8에서 저산소증 허혈(HI)을 유도하는 데 사용된다. 이 시대의 마우스 새끼는 신경학적으로 대략 전체 용어 인간 neonate9로 번역합니다.
이 상해 모형과 함께 이용된 연속적인 비디오 뇌파학 (EEG) 감시는 신생아 저혈성 허혈성 발작의 추가 이해 그리고 특성화를 허용합니다. 이전 연구는 비디오 녹화, 제한된 EEG 녹음 및 원격 측정 EEG 기록 10,11,12,13,14,15,16을 포함하여 설치류의 신생아 발작을 분석하기 위한 다양한 방법을 사용했습니다. 다음 원고에서는 저산소증-허혈 중에 마우스 새끼로 연속 비디오 EEG를 기록하는 과정에 대해 자세히 설명합니다. 신생아 마우스 새끼에서 연속 비디오 EEG 모니터링을위한이 기술은 다양한 질병 및 발작 모델에 적용 될 수있다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SURGERY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ball Point Applicator</td>
			<td>Metrex Research</td>
			<td>8300-F</td>
			<td>i-bond applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cranioplast (Powder/Resin)</td>
			<td>Coltene</td>
			<td>H00383</td>
			<td>Perm Reline/Power</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Bond</td>
			<td>Kulzer GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOOK Silk Suture</td>
			<td>Surgical Specialities Corporation</td>
			<td>SP115</td>
			<td>LOOK SP115 Black Braided Silk Non absorbable surgical suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS-5168 Botvin Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS5168</td>
			<td>Forcep for surgery/ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS-5138 Graefe Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS5138</td>
			<td>Forcep for surgery/ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light for I-Bond</td>
			<td>Blast Lite By First Media</td>
			<td>BL778</td>
			<td>UV ligth for I-bond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Microdissecting Scissor</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS5618</td>
			<td>Scissor for ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vet Bond</td>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>Vet Glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYPOXIA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxidial</td>
			<td>Starr Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen sensor</td>
			<td>Medical Products</td>
			<td></td>
			<td>MiniOxI- oxygen analyzer/sensor for hypoxia rig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EEG RECORDING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female receptacle connector 0.079&#34;</td>
			<td>Mill-Max Manufacturing Corp</td>
			<td>832-10-024-10-001000</td>
			<td>Ordered from Digikey</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grass Amplifier</td>
			<td>Natus Neurology Incorporated</td>
			<td></td>
			<td>Grass Product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChart Pro</td>
			<td>ADI Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software to run the system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Socket Connector 0.079&#34;</td>
			<td>Mill-Max Manufacturing Corp</td>
			<td>833-43-024-20-001000</td>
			<td>Ordered from Digikey</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operational Amplifier</td>
			<td>Texas Instruments, Dallas, TX, USA</td>
			<td>TLC2274CD</td>
			<td>TLC2274 Quad Low&#8208;Noise Rail&#8208;to Rail Operational Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operational Amplifier</td>
			<td>Texas Instruments, Dallas, TX, USA</td>
			<td>TLC2272ACDR</td>
			<td>TLC2274 Quad Low&#8208;Noise Rail&#8208;to Rail Operational Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel wire</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>791400</td>
			<td>0.005&#34; Bare/0.008&#34; Coated 100 ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Flexible Wire</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9564T1</td>
			<td>36 Gauze wire of various color</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous video electroencephalogram during hypoxia-ischemia in neonatal mice

저산소증 허혈은 신생아 발작의 가장 흔한 원인입니다. 동물 모델은 신생아 발작과 저산소증 허혈의 기전과 생리학을 이해하는 데 중요합니다. 이 원고는 신생아 마우스에서 지속적인 비디오 뇌전도(EEG) 모니터링을 위한 방법을 설명하여 저산소증 허혈 중 발작을 감지하고 EEG 배경을 분석합니다. 비디오 및 EEG를 함께 사용하면 발작 반학에 대한 설명과 발작 확인이 가능합니다. 이 방법은 또한 실험 기간 동안 전력 분광 및 EEG 배경 패턴 동향을 분석할 수 있습니다. 이 저산소증 허혈 모델에서, 방법은 EEG 가 손상 전 과 부상 및 회복 중에 규범적 기준을 얻을 수 있도록 허용한다. 총 모니터링 시간은 새끼를 어머니와 4 시간 이상 분리할 수 없다는 데 의해 제한됩니다. 비록, 우리는이 원고에서 저산소 허혈성 발작의 모델을 사용 했지만, 신생아 비디오 EEG 모니터링을 위한 이 방법은 설치류에 있는 다양한 질병 및 포착 모형에 적용될 수 있었습니다.

발작 세미로지
신생아 저산소증 -허혈 노출은 마우스에서 일반화 및 초점 발작 모두에서 초래 (도 1A-C). 비디오 EEG 녹화를 통해 전극 결과는 비디오의 동작과 상관관계가 있습니다. 이러한 행동은 이전에 발표된 신생아 설치류 행동 발작 점수(BSS)16을 사용하여 득점되었다. BSS 외에도 동작이 초점/일방적, 양자 또는 혼...

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Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

본 원고는 저산소증-허혈을 앓고 있는 신생아 마우스의 다중 깊이 전극을 이용한 연속 비디오 EEG 레코딩방법을 설명합니다.

신생아 쥐의 저산소증-허혈 중 연속 비디오 뇌전도

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying ...

continuous-video-electroencephalogram-during-hypoxia-ischemia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.3K 조회수.  University of Virginia. 본 원고는 저산소증-허혈을 앓고 있는 신생아 마우스의 다중 깊이 전극을 이용한 연속 비디오 EEG 레코딩방법을 설명합니다.

비디오: Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

Video-oculography in Mice

Eye movements are very important in order to track an object or to stabilize an image on the retina during movement. Animals without a fovea, such as the mouse, have a limited capacity to lock their eyes onto a target. In contrast to these target directed eye movements, compensatory ocular eye movements are easily elicited in afoveate animals1,2,3,4. Compensatory ocular movements are generated by processing vestibular and optokinetic information into a command signal that will drive the eye muscles. The processing of the vestibular and optokinetic information can be investigated separately and together, allowing the specification of a deficit in the oculomotor system. The oculomotor system can be tested by evoking an optokinetic reflex (OKR), vestibulo-ocular reflex (VOR) or a visually-enhanced vestibulo-ocular reflex (VVOR). The OKR is a reflex movement that compensates for "full-field" image movements on the retina, whereas the VOR is a reflex eye movement that compensates head movements. The VVOR is a reflex eye movement that uses both vestibular as well as optokinetic information to make the appropriate compensation. The cerebellum monitors and is able to adjust these compensatory eye movements. Therefore, oculography is a very powerful tool to investigate brain-behavior relationship under normal as well as under pathological conditions (f.e. of vestibular, ocular and/or cerebellar origin).
Testing the oculomotor system, as a behavioral paradigm, is interesting for several reasons. First, the oculomotor system is a well understood neural system5. Second, the oculomotor system is relative simple6; the amount of possible eye movement is limited by its ball-in-socket architecture ("single joint") and the three pairs of extra-ocular muscles7. Third, the behavioral output and sensory input can easily be measured, which makes this a highly accessible system for quantitative analysis8. Many behavioral tests lack this high level of quantitative power. And finally, both performance as well as plasticity of the oculomotor system can be tested, allowing research on learning and memory processes9.
Genetically modified mice are nowadays widely available and they form an important source for the exploration of brain functions at various levels10. In addition, they can be used as models to mimic human diseases. Applying oculography on normal, pharmacologically-treated or genetically modified mice is a powerful research tool to explore the underlying physiology of motor behaviors under normal and pathological conditions. Here, we describe how to measure video-oculography in mice8.

Video-oculography is a very quantitative method to investigate ocular motor performance as well as motor learning. Here, we describe how to measure video-oculography in mice. Applying this technique on normal, pharmacologically-treated or genetically modified mice is a powerful research tool to explore the underlying physiology of motor behaviors.

마우스의 비디오 - oculography

Eye movements are very important in order to track an object or to stabilize an image on the retina during movement. Animals without a fovea, such as the ...

연구

신경과학

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central nervous system. Changes in ENS function are a major cause of GI symptoms and disease and may contribute to GI symptoms reported in neuropsychiatric disorders including autism. It is well established that isolated colon segments generate spontaneous, rhythmic contractions known as Colonic Migrating Motor Complexes (CMMCs). A procedure to analyze the enteric neural regulation of CMMCs in ex vivo preparations of mouse colon is described. The colon is dissected from the animal and flushed to remove fecal content prior to being cannulated in an organ bath. Data is acquired via a video camera positioned above the organ bath and converted to high-resolution spatiotemporal maps via an in-house software package. Using this technique, baseline contractile patterns and pharmacological effects on ENS function in colon segments can be compared over 3-4 hr. In addition, propagation length and speed of CMMCs can be recorded as well as changes in gut diameter and contraction frequency. This technique is useful for characterizing gastrointestinal motility patterns in transgenic mouse models (and in other species including rat and guinea pig). In this way, pharmacologically induced changes in CMMCs are recorded in wild type mice and in the Neuroligin-3R451C mouse model of autism. Furthermore, this technique can be applied to other regions of the GI tract including the duodenum, jejunum and ileum and at different developmental ages in mice.

This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

비디오 이미징 및 시공간지도는 마우스에서 위장관 운동성을 분석하는

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

신생아 생쥐의 척수 신경 세포 분리 및 배양

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo에서 신생아 쥐에 있는 대뇌 피 질의 뉴런의 두 광자 영상

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 (ChR2), is expressed by a virus vector in a particular type of neuronal cells in various Cre-driver mice. Activation of these opsins is triggered by application of light pulses which are delivered by laser or LED through optic cables, and the effect of activation is observed with very high time resolution. Experimenters are able to acutely stimulate neurons while monitoring behavior or another physiological outcome in mice. Optogenetics can enable useful strategies to evaluate function of neuronal circuits in the regulation of sleep/wakefulness states in mice. Here we describe a technique for examining the effect of optogenetic manipulation of neurons with a specific chemical identity during electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) monitoring to evaluate the sleep stage of mice. As an example, we describe manipulation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis (BNST). Acute optogenetic excitation of these neurons triggers a rapid transition to wakefulness when applied during NREM sleep. Optogenetic manipulation along with EEG/EMG recording can be applied to decipher the neuronal circuits that regulate sleep/wakefulness states.

Here, we describe methods of optogenetic manipulation of particular types of neurons during monitoring of sleep/wakefulness states in mice, presenting our recent work on the bed nucleus of the stria terminalis as an example.

마우스에서 수면/각성 상태를 모니터링하는 동안 신경 회로의 광유전학 적 조작

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

Modeling Neonatal Intraventricular Hemorrhage Through Intraventricular Injection of Hemoglobin

Neonatal intraventricular hemorrhage (IVH) is a common consequence of premature birth and leads to brain injury, posthemorrhagic hydrocephalus (PHH), and lifelong neurological deficits. While PHH can be treated by temporary and permanent cerebrospinal fluid (CSF) diversion procedures (ventricular reservoir and ventriculoperitoneal shunt, respectively), there are no pharmacological strategies to prevent or treat IVH-induced brain injury and hydrocephalus. Animal models are needed to better understand the pathophysiology of IVH and test pharmacological treatments. While there are existing models of neonatal IVH, those that reliably result in hydrocephalus are often limited by the necessity for large-volume injections, which may complicate modeling of the pathology or introduce variability in the clinical phenotype observed.
Recent clinical studies have implicated hemoglobin and ferritin in causing ventricular enlargement after IVH. Here, we develop a straightforward animal model that mimics the clinical phenotype of PHH utilizing small-volume intraventricular injections of the blood breakdown product hemoglobin. In addition to reliably inducing ventricular enlargement and hydrocephalus, this model results in white matter injury, inflammation, and immune cell infiltration in periventricular and white matter regions. This paper describes this clinically relevant, simple method for modeling IVH-PHH in neonatal rats using intraventricular injection and presents methods for quantifying ventricle size post injection.

We present a model of neonatal intraventricular hemorrhage using rat pups that mimics the pathology seen in humans.

헤모글로빈의 뇌실내 주사를 통한 신생아 뇌실내 출혈 모델링

Neonatal intraventricular hemorrhage (IVH) is a common consequence of premature birth and leads to brain injury, posthemorrhagic hydrocephalus (PHH), and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Neuronal Activity Mapping in Developing Mouse Sensory Cortex(생쥐 감각 피질 발달에서의 신경 활동 매핑)

In Vivo Visualization of Spontaneous Activity in Neonatal Mouse Sensory Cortex at a Single-Neuron Resolution

The mammalian brain undergoes dynamic developmental changes at both the cellular and circuit levels throughout prenatal and postnatal periods. Following the discovery of numerous genes contributing to these developmental changes, it is now known that neuronal activity also substantially modulates these processes. In the developing cerebral cortex, neurons exhibit synchronized activity patterns that are specialized to each primary sensory area. These patterns markedly differ from those observed in the mature cortex, emphasizing their role in regulating area-specific developmental processes. Deficiencies in neuronal activity during development can lead to various brain diseases. These findings highlight the need to examine the regulatory mechanisms underlying activity patterns in neuronal development. This paper summarizes a series of protocols to visualize primary sensory areas and neuronal activity in neonatal mice, to image the activity of individual neurons within the cortical subfields using two-photon microscopy in vivo, and to analyze subfield-related activity correlations. We show representative results of patchwork-like synchronous activity within individual barrels in the somatosensory cortex. We also discuss various potential applications and some limitations of this protocol.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Deciphering Neural Circuit Formation from Two-Photon Microscopy and Single Neuron Imaging(이광자 현미경 및 단일 뉴런 이미징에서 신경 회로 형성 해독)

Primary sensory areas in the neocortex exhibit unique spontaneous activities during development. This article describes how to visualize individual neuron activities and primary sensory areas to analyze area-specific synchronous activities in neonatal mice in vivo.

단일 뉴런 해상도에서 신생아 마우스 감각 피질의 자발적 활동에 대한 In vivo 시각화

The mammalian brain undergoes dynamic developmental changes at both the cellular and circuit levels throughout prenatal and postnatal periods. Following ...