이 프로토콜은 척추 모토뉴런의 세포내 기록을 사용하여 척추 네트워크의 기능에 대한 트랜스 척추 직접 전류 자극의 영향을 직접 조사합니다. 이 기술의 주요 장점은 완전히 성숙한 신경계에서 세포 내 녹음을 수행 할 수 있다는 것입니다. 실험 관측의 번역을 실용적인 응용 분야에 용이하게 합니다.
페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 마취 된 6 개월 된 남성 Wistar 쥐는 해부 현미경과 숫자 21 블레이드를 사용하여 흉골에서 턱까지 세로 피부 절개를합니다. 그리고 무딘 해부를 사용하여 올바른 경정맥을 노출하십시오. 분기 점 없이 정맥 의 섹션 아래에 2, 4-0 합자 놓습니다.
그리고 정맥 세그먼트의 근근 끝에 하나의 느슨한 매듭을 합니다. 그리고 세그먼트의 말단 끝에 하나의 느슨한 매듭. 정맥 근위를 심장에 고정시키고 정맥의 말단 끝을 리게이트합니다.
홍채 가위를 사용하여 클램프와 단산 합자 사이에 절개를 합니다. 그리고 정맥의 플랩을 들고 정맥이 클램프에 의해 막힌 지점에 미리 채워진 카테터를 소개합니다. 그런 다음 클램프를 제거하고 카테터를 몇 밀리미터 밀어 정맥으로 밀어 넣습니다.
기관관 배치의 경우 무딘 집게를 사용하여 스테르노하이드 근육을 덮는 두 개의 하악샘을 분리하십시오. 그리고 중간선에 스테인로이드 근육을 분리하여 기관진을 노출시한다. 기관 아래에 3개, 4-0 합자를 놓고 기관관 삽입 점 아래에 2매듭을 만들고 위의 매듭 을 만듭니다.
그런 다음 제 3 기관 연골 아래 기관관에 기관 튜브를 삽입합니다. 그리고 미리 준비된 합자로 튜브를 제자리에 고정시합니다. 뒷다리 신경을 해부하려면 숫자 21 블레이드를 사용하여 아킬레스 건에서 엉덩이에 이르기까지 왼쪽 뒷다리의 후방 측면에 세로 절단을 합니다.
그리고 가위를 사용하여 무릎 관절의 뒤쪽에 있는 포라이트 포사의 전방 및 후방 영역 사이의 절단을 합니다. 이두근 여성스러움의 두 머리를 잘라, 상골 신경을 노출. 그리고 측면 머리를 위장관 근육의 내측 머리에서 분리하여 경골 신경과 가지를 노출시하십시오.
그런 다음 55번 의 집게를 사용하여 내측 위트로테미와 측면 위트로테미와 솔레우스 신경을 조심스럽게 해부합니다. 근육의 각각에 그들의 연결을 유지 하면서 주변 조직에서 그들을 분리. 라미케네절절제술을 수행하려면 21번 블레이드를 사용하여 천골에서 흉부 척추까지 종방향 절개를 합니다.
그리고 흉부 삽입을 가진 가장 낮은 흉부 세그먼트로, Th13 척추를 식별합니다. 그런 다음 미세 한 rongeurs를 사용하여 Th13에서 L2 척추까지 가시 적 과정과 라미네를 제거하고 척수의 요추 세그먼트를 노출시하십시오. 척추 열을 고정하려면 닫힌 루프 가열 시스템에 연결된 섭씨 37도 가열 패드에 쥐를 사용자 지정 만든 프레임에 넣습니다.
그리고 피부 플랩을 사용하여 노출된 척수 위에 깊은 풀을 형성합니다. 금속 클램프를 Th12 횡단 공정 아래에 놓고 L3 가시 공정에 놓고 풀을 섭씨 37도 미네랄 오일로 채웁니다. 피부 플랩을 사용하여 노출된 티비알, 내측 위트로테믹, 측면 위트로테믹 및 솔레우스 신경위에 깊은 미네랄 오일 풀을 만듭니다.
그리고 양극성 실버 와이어 자극 전극에 신경을 배치합니다. 그런 다음 각 신경에 대해 별도의 자극 채널을 사용하여 전극을 제곱 펄스 자극기로 연결합니다. 표면 전극 배치의 경우, 해부 현미경 의 밑에, 노출된 척수의 왼쪽 caudal 쪽에 은공 전극을 놓습니다.
후면 근육에 레퍼런스 전극이 삽입됩니다. 그리고 두 전극을 차동 DC 증폭기에 연결합니다. 일정한 전류 자극기를 사용하여 내측 위트로네미하와 측면 위트로테네미에이즘 및 솔레우스 신경을 자극하고, 3헤르츠 주파수에서 반복되는 0.1 밀리초 의 제곱 펄스와 발포성 발리를 관찰한다.
시뮬레이션의 끝에서, 표면 전극을 장밋빛으로 이동하고, 배구의 진폭이 각 신경에 대해 가장 높은 척추 세그먼트를 식별하기 위해 자극을 반복한다. 최대 발리의 위치를 결정 한 후, 쥐를 마비하는 정맥 신경 근육 차단제를 제공합니다. 도우미가 설치류 호환 캡 지명자와 일치하는 외부 인공호흡기에 기관관을 연결합니다.
듀라와 피아 메이트를 열려면 숫자 55 집게를 사용하여 듀라 마터를 부드럽게 들어 올리고 L5 세그먼트에서 조직을 다시 잘라 L4 세그먼트까지 장밋빛으로 자릅니다. 그런 다음 초박형 5SF 집게 쌍을 사용하여 혈관 사이의 등갈 컬럼을 덮고 피아에 작은 패치를 만듭니다. 정확히 내측 위트로테미온및 측측 위트로테미하및 솔레우스 신경으로부터 최대 발구의 수준에서.
트랜스 척추 직접 전류 자극 전극을 배치하려면 Th12 척추의 등쪽에 식염수에 담근 스폰지를 놓습니다. 그리고 활성 트랜스 척추 직접 전류 자극 전극으로 스폰지를 누르기 위해 미세 조작을 사용합니다. 그런 다음 사용자 정의 풀링 된 마이크로 전자 전차를 마이크로 조작기에 장착하여 1 ~ 2 개의 미크론 스테핑 움직임과 스테레오 탁스 교정을 허용합니다.
그리고 15~ 20도 내측 각도에서 피아의 선택된 패치로 마이크로피펫 팁을 구동한다. 세포내 증폭기의 브리지 모드에서, 모토뉴런 막 및 발사 특성을 기록하기 위해, 항드로믹 작용 잠재력의 전부 또는 전혀 모양에 기초하여 모토뉴런을 식별하기 위해 각 신경 가지를 자극한다. 현재 스위치 속도 모드를 가진 세포내 증폭기의 불연속 전류 클램프 모드에서 4~8킬로헤르츠, 0.5밀리초 세포내 탈극 전류 펄스를 사용하여 모토뉴런에서 치열 교정 작용 잠재력을 연상시킨다.
세포 입력 저항을 계산하려면 1 나노그램 전류의 40개의 짧은 100밀리초 펄스로 모토뉴런을 자극합니다. 단일 스파이크를 유도하는 데 필요한 탈극 전류의 최소 진폭으로 실제 기준 값을 결정하기 위해, 증가 진폭에서 50 밀리초 제곱파 펄스로 모토뉴런을 자극한다. 그런 다음 진폭을 증가시면 500밀리초 의 제곱파 펄스를 탈극 전류의 펄스를 주입합니다.
0.1 ~ 2 나노 앰프 단계에서, 모토 뉴런의 리듬 배출을 연상시킨다. 트랜스 척추 직접 전류 자극의 경우, 모토뉴런의 안정적인 침투를 유지하면서 직접 전류의 척추 횡단 응용에 의해 편광 절차를 시작합니다. 여기서, 데이터 포함에 대한 모든 기준을 충족하는 세포 내 자극에 의해 불러지는 전형적인 정형 외과 동작 전위가 표시됩니다.
이 분석에서, 1나노그램의 100밀리초 과극화 전류 펄스에 대한 세포 반응. 모토뉴런의 피크 및 고원 입력 저항이 모두 전압 편향으로부터 결정될 수 있는, 관찰될 수 있다. 실제 기본 스파이크의 확장 된 전압 추적은 스파이크의 명확하게 표시된 전압 임계 값을 나타낸다.
전압 게이트 나트륨 채널이 활성화되어 작업 전위를 시작하는 멤브레인 탈극화 수준을 나타냅니다. 이 그래프는 셀룰러 전압 추적의 예를 제공합니다. 두 개의 motoneurons에서, 탈극 전류의 500 밀리 초 제곱 펄스와 세포내 자극.
전, 도중, 그리고 트랜스 척추 직접 전류 자극 응용 프로그램 후. 아노달 척추 직접 전류 자극은 증가 된 motoneuron 흥분성 및 리듬 발사의 높은 주파수를 향해 작용하는 것으로 나타났습니다. 음극 트랜스 척추 직접 전류 자극 동안, 발사 억제를 향해 행동.
더욱이, 두 가지 유형의 트랜스 척추 직접 전류 자극의 효과는 양극화 기간을 능가했습니다. 불완전한 셀 침투로 인해 데이터 포함 기준이 손상된 경우 부정확한 데이터를 수집할 수 있습니다. 미세 전극 저항 및 정전 또는 척수 불안정을 보상하지 못하는 경우.
해부 동안 척수에 손상이 발생하지 않는 것은 부상이 척추 충격을 초래할 수 있으므로 추가 기록이 불가능해짐에 따라 반드시 손상되지 않는 것이 필수적입니다. 추가 조직학적 또는 면역 세포 화학 분석을 위해 조직 샘플을 수확할 수 있다. 예를 들어, c-fos 발현의 측정은 뉴런 활동의 프록시로서 사용될 수 있다.
