smFISH는 mRNA의 서브 셀룰러 위치로 절대 수를 측정하는 것으로 알려져 있습니다. 우리의 두 가지 색상 sMFISH 프로토콜은 전사 및 mRNA 분해의 운동학을 측정하는 추가 기능을 가지고 있습니다. 이 방법을 사용하면 추가 시간이나 노력 없이 많은 샘플을 동시에 처리할 수 있습니다.
예를 들어, 48개의 샘플을 산출하는 4개의 시간 과정 실험은 8시간 안에 이미징을 위해 처리될 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 많은 유전자와 세균성 종에 광범위하게 적용됩니다. 실험을 위해 커버 슬립과 유리 슬라이드를 준비합니다.
100% 에탄올이 들어 있는 코플린 항아리에 커버 슬립과 슬라이드를 놓고 항아리를 15~20분 동안 수조 초음파 수용체에 놓습니다. 초음파 처리의 끝에서 슬라이드를 세척하고 커버는 70 %에탄올로 항아리를 다시 채우고 초음파 를 반복하기 전에 매우 순수한 물로 3 ~ 4 번 미끄러. 모든 초음파 처리 단계가 완료되면, 질소 가스로 커버 슬립과 슬라이드를 건조.
커버 슬립을 빈 1000 마이크로리터 파이펫 팁 박스에 넣고 슬라이드를 깨끗한 슬라이드 상자에 넣습니다. 이어서, 파이펫 팁 박스의 구멍을 따라 소수성 마커를 사용하여 커버 슬립에 원을 그리고 이들 각 우물에 0.1% 폴리 l 리신의 20 마이크로리터 드롭을 적용한다. 타임 코스 실험을 설정하려면 20 밀리리터에서 750 마이크로리터를 기하급수적으로 성장하는 E.coli 문화권에 1.5 밀리리터 배양 튜브를 추가하여 시간 제로로 표시합니다.
그리고 즉시 튜브를 반전. 0.2~1밀리머 IPTG로 락 Z 식을 유도하고 타이머를 시작합니다. 타이머를 확인한 후, 방금 입증된 바와 같이 각 연속 실험 시점의 세포 배양을 수집합니다.
실험 중 적절한 시점에서, 5밀리몰러 ONPF를 플라스크에 추가하여 락 Z 발현을 억제하고 mRNA 분해를 추적하기 위해 배양을 계속 샘플링한다. 시간 과정 샘플 수집이 끝나면 실온에서 샘플을 15 분 동안 배양한 다음 얼음에 30 분 동안 배양하십시오. 인큐베이션 원심분리의 끝에서 시료는 고정을 제거하고 파이펫을 사용하여 상퍼를 제거합니다.
DEPC PBS의 1 밀리 리터에서 박테리아를 다시 일시 중단하고 세척 당 신선한 DEPC PBS의 1 밀리 리터에 세포를 두 번 더 세척. 마지막 세척 후, 신선한 DEPC PBS의 30 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단. 세포의 투과화를 위해.
먼저 에탄올 멸균 유리 커버 전표 중 하나에 개별 소수성 우물에 각 시점의 샘플을 추가합니다. 그리고 세포가 실온에서 10~30분 배양으로 커버 슬립을 부착할 수 있도록 한다. 인큐베이션이 끝나면 각 웰에 70%의 에탄올 15마이크로리터를 추가합니다.
4분 후, 우물이 완전히 건조되도록 각 우물에서 에탄올을 흡입합니다. 세척 후 30 마이크로리터의 사전 혼성화 용액을 각 웰에 추가하고 섭씨 37도 오븐에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 사전 혼성화 솔루션을 약 30마이크로리터의 프로브 하이브리드화 솔루션으로 잘 교체하십시오.
그리고 37섭씨 오븐에서 2시간 동안 알루미늄 호일로 챔버를 덮습니다. 인큐베이션의 끝에서 멀티 채널 파이펫을 사용하여 세척당 잘 세척용 30 마이크로리터로 우물을 3~5회 헹구는 다중 채널 파이펫을 사용합니다. 마지막 세척 후, 세척 당 신선한 DEPC PBS의 30 마이크로 리터와 함께 우물을 5 번 세척하기 전에 섭씨 37도에서 15 ~ 30 분 동안 세포를 배양.
마지막 세척 후, 커버 슬립에서 액체의 모든 을 흡인. 그리고 각 우물에 신선한 DEPC PBS의 네 마이크로 리터를 추가합니다. 집게를 사용하여 커버 슬립을 에탄올 멸균 유리 슬라이드 샘플 측면에 조심스럽게 놓고 실리콘 치과 검을 사용하여 커버 슬립의 가장자리를 밀봉하십시오.
관심 영역을 찾으려면 위상 대비 영상의 라이브 모드를 선택하고 스테이지 조이스틱을 기동하여 우물 내에서 시야를 변경합니다. 세포 밀도가 최적 영역을 위치하고 위상 대비 세포 이미지가 초점에 있도록 Z 초점을 조정한다. 그런 다음 4초 노출을 가진 C 5 이미지, 2초 노출을 가진 C 3 화상 및 우물당 약 10개의 다른 영역에 대해 0.2초 노출을 가진 위상 대비 이미지를 획득합니다.
또는 C5, C3 및 위상 대비 이미지를 연속적으로 획득할 수 있는 NDI 획득. 모든 우물이 이미지화되면 적절한 셀 세분화 도구를 열고 스택을 클릭 취소합니다. 위상 대비 이미지를 로드하고 독립적인 프레임을 선택하고 컴퓨팅 위상 프로파일을 0으로 클릭합니다.
셀을 식별하고 윤곽선이 계산되는 세분화 프로세스를 시작합니다. GitHub 폴더에 제공된 매개 변수를 로드하고 모든 프레임을 클릭합니다. 처리의 끝에서 메시를 시각화할 윤곽을 선택합니다.
다음으로, 스팟 감지 탭 에서 스택을 확인 취소하고, 메쉬를 확인하고 문지르기를 클릭하여 두 개의 D Gaussian 피팅을 기반으로 스팟 식별 및 정량화를 시작합니다. 형광 이미지가 포함된 폴더와 셀 감지 절차에서 방금 계산된 메시 파일을 선택하고 스팟 감지 결과가 저장되는 파일 이름을 나타냅니다. 그런 다음 GitHub에 제공된 이미지 분석 워크플로를 사용하여 형광 이미지를 분석합니다.
이 전체 시야에서는 세포 세분화를 위한 양호한 밀도에서 약 500개의 대장균 세포를 관찰할 수 있다. 상 대비 이미지에서 세포의 형태는 세분화 목적을 위해 살아있는 세포의 형태와 비교할 수 있어야 합니다. 세포가 과다 하게 되면, 그들의 형태는 세분화에 적합하지 않게 됩니다.
유도 전에 락 Z mRNA 스팟 강도의 분포는 높은 강도와 반점의 존재로 인해 정상 또는 푸아송 분포와 잘 맞지 않습니다. 락 Z의 발현이 유도되면 5개의 프라임 락 Z mRNA의 신호가 증가하여 3개의 프라임 락 Z mRNA 신호가 증가한다. 락 Z의 발현이 5및 3개의 프라임 락 Z mRNA 신호가 모두 감소되는 경우.
전사 신장속도를 얻으려면 5가지 및 3개의 주요 신호의 상승이 선에 적합합니다. mRNA 분해의 속도는 지수 기능을 가진 부패 부위를 피팅하여 얻어진다. 단일 분자 물고기는 단일 세포 기술이기 때문에 전사에서 세포 가변성을 분석할 수도 있다.
또한, 5개의 프라임 및 3개의 프라임 락 Z mRNA의 공동국화의 분석은 락 Z 유전자에 RNA 중합효소의 밀도를 정량화할 수 있게 한다. 이 절차 중에 서로 다른 시간 점의 샘플이 동시에 처리됩니다. 샘플이 튜브에 있는 동안 과 커버 슬립에 있는 동안 분리된 상태로 유지하는 것이 중요합니다.
이 단일 분자 단일 세포 현미경 기술을 사용 하 여. 연구원은 지금 전사와 mRNA 분해 운동학이 mRNA의 절대 숫자 또는 세포외 위치와 관련되는 방법을 탐구할 수 있습니다.
