이 혈역학 루프 모델을 사용하면 연구원이 관류 튜브 또는 스텐트와 같은 혈관 장치의 체외 헤모 호환성을 테스트 할 수 있습니다. 표준화된 조건하에서. 따라서이 기술은 기계적 힘에 의해 혈액에 어떤 영향을 미치지 않으므로 혈액 성분의 본질적 활성화에 의해 오해의 소지가있는 결과를 피합니다.
실험을 시도하기 전에 적절한 기계적 부품 조립, 완벽한 루프 폐쇄 시스템 구성 및 루프에 느린 혈액 적재를 연습해야합니다. 루프 어셈블리를 준비하려면 튜브 커터를 사용하여 평평한 표면에 250센티미터 길이, 5밀리미터 의 내경 직경 조각을 절단합니다. 그리고 튜브의 개방 엔딩을 조사 튜브의 외경에 피트하는 실리콘 튜브의 짧은 조각으로 연결하여 루프 모양을 생성합니다.
텐션 밴드 커넥터의 잠금 나사를 조심스럽게 조이고 닫는 힘을 조정하여 두 굽힘 사이에 간격이 남지 않도록 합니다. 잠금 나사가 완전히 강화되고 폴리 카보네이트 밴드의 장력이 너무 낮아두 벤딩 사이의 간격을 닫고 잠금 시스템을 열고 장력 대역의 몇 밀리미터를 자른경우. 스텐트 루프 어셈블리를 준비하려면 루프 두 개를 열고 튜브를 장력 밴드 시스템에서 꺼냅니다.
그런 다음 제조업체의 지시에 따라 스텐트를 튜브 중앙에 삽입합니다. 실험에 적합한 루프 수가 생성되면 회전 장치의 루프 요람에서 루프를 확보하고, 37도 수조 의 외부및 루프 요람을 수조 내부의 회전 장치에 부착한다. 다음으로, 150 마이크로리터 또는 갓 준비된 헤파린 스톡 용액으로 채취하는 혈액 2개의 루프당 10밀리리터 주사기를 채우고 21 게이지 나비를 사용하여 주사기에 혈액을 부드럽게 수집하여 과도한 진공으로 인한 동종 분석이나 세포 활성화를 피하기 위해 주의를 기울입니다.
모든 혈액이 수집되면 혈액을 유리 비커로 옮기고 5 밀리리터 세로지컬 파이펫을 사용하여 혈액과 헤파린을 부드럽게 혼합합니다. 피펫 팁이 튜브에 완전히 삽입되지 않은 균일한 용액을 획득하면 각 루프를 5 밀리리터의 혈액으로 채웁니다. 각 루프가 채워진 후 닫고 루프, 장력 밴드 및 랙이 제대로 고정되어 있는지 확인합니다.
그런 다음 분당 30 회전에서 3 시간 동안 루프를 회전합니다. 회전의 끝에서 루프가 2 분 동안 랙에 서서 조심스럽게 커넥터를 열고 중복에서 개별 10 밀리리터 유리 비커로 혈액을 당기기 전에 혈액이 루프 바닥에 축적되도록합니다. 모든 혈액이 수집되면 PBS의 10 밀리리터로 각 튜브를 헹구고 메스를 사용하여 각 튜브의 끝에서 1 센티미터 샘플을 조심스럽게 잘라냅니다.
샘플을 섭씨 4도에서 2%의 글루타랄데히드로 하룻밤 동안 배양하고, 실온에서 15분 동안 배양하고 1%의 오스뮴 테트로이드를 배양합니다. 오스뮴 테트산화물 배큐베이션의 끝에서, 농도 당 20 분 동안 상승 에탄올 계열에서 샘플을 탈수, 100 % 에탄올에서 30 분 탈수. 100% 에탄올 인큐베이션의 끝에서, 엑스레이 마이크로 CT 스캐너를 사용하여 5킬로볼트의 가속 전압에서 전자 현미경을 스캔하여 샘플을 이미징하기 전에 실온에서 밤새 건조시 샘플을 보자.
혈액 샘플의 유동 세포 측정 분석을 위해. 각 샘플에서 100마이크로리터의 혈액을 9개의 밀리리터 FACS 튜브로 옮기고 빛으로부터 보호되는 실온에서 15분 동안 튜브당 4%의 포름알데히드100마이크로리터를 추가하여 샘플을 수정합니다. 세척 후 각 펠릿을 튜브 당 적혈구 용해 버퍼 1 밀리리터로 다시 중단하고 실온에서 5 분 동안 실내 온도에서 잠식하여 빛으로부터 보호합니다.
인큐베이션의 끝에서, 튜브 당 PBS의 1 밀리리터에서 원심 분리에 의해 샘플을 세척하고 얼음에 자신의 슈퍼 나티츠없이 샘플을 배치. 단일 얼룩 보정 비즈를 준비하려면 개별 1 밀리리터 버퍼에 4 방울의 양수와 네 방울의 네 방울의 부정적인 구슬을 추가하고 균일 한 비드 서스펜션을 얻기 위한 솔루션을 소용돌이시다. 각 솔루션의 마이크로리터 100개를 표시된 대로 표지된 4밀리리터 FACS 튜브에 추가하고 튜브당 FACS 버퍼 1밀리리터로 구슬을 세척합니다.
다음으로 각 실험 및 형광에 적절한 소용돌이 항체 칵테일 100 마이크로리터를 추가하여 부드러운 혼합으로 한 튜브를 빼냅니다. 실온에서 30분 동안 인큐베이션을 통해 빛으로부터 보호합니다. 인큐베이션이 끝나면 시료당 1밀리리터의 신선한 FACS 버퍼로 샘플을 세척하고 튜브당 FACS 버퍼 250마이크로리터에서 펠릿을 재보페수합니다.
표준 프로토콜에 따르면 세포 측정을 유동하여 세포 샘플에 있는 구슬을 분석하기 전에. 혈액 세포 분포는 마이크로 CT에 의해 접합된 두 개의 블루프의 전체 표면에 걸쳐 시각화될 수 있고 전자 현미경 이미징을 스캐닝하는 반면 틈새없이 닫힌 루프에서 혈전이 관찰되지 않습니다. 전혈구 수의 분석은, 시험된 조건, 혈소판 및 백혈구 수 사이 적혈구 수에 있는 중요한 다름을 보여주지 않습니다, 라텍스 루프 단에서 급격하게 감소되고 자유로운 헤모글로빈 수는 극적으로 증가하여 라텍스의 생체 적합성이 매우 나쁘다는 것을 나타낸다.
모든 시험된 혈관 장치는 응고 시스템 및 칭찬 구성 요소의 증가된 활성화를 유도합니다. 헤파린 코팅 PVC 루프는 폴리머 코팅, PVC 루프에 비해 두 유형의 활성화 수준이 감소하는 추세를 나타낸다. 라텍스 루프는 TNF IL-6 및 PMN 엘라스타제의 최고 수준을 나타내며 라텍스에 의한 백혈구의 강력한 활성화를 강조합니다.
CD41 양혈소는 라텍스 튜브에서 회수되고 CD62P에 대한 매우 높은 중간 형광 강도를 나타내며, 통합식은 과립구및 림프구에서 크게 감소된다. 관심의, 일체 수준은 라텍스 튜브에서 단핵구에서 더 높은, 단세포 활성화 혈소판 상호 작용을 제안. 실제로 단핵혈소판 응고에 대한 염색은 라텍스 및 스텐트 루프에서 응집되는 경향이 증가합니다.
라텍스 루프 내에서 단핵구의 빈도가 감소했음에도 불구하고. 본질적인 혈액 분대 활성화를 피하기 위하여는 적당한 루프 폐쇄를 확인하고 주의로 혈액을 취급하는 것이 중요합니다. 따라서 이 절차에 따라 염증 또는 제약 연구에 사용되는 동종 단백질 또는 TRUCKs 및 혈액 성분 간의 상호 작용을 분석할 수 있습니다.
