저자는 (중량 HL097246 및 HL119371) AHA (중량 13GRNT16990019) 및 NHLBI을 포함하여 자금 출처를 인정하고 싶습니다.

1. 실란 화 및 슬라이드의 생체 분자 기능화 또는 폴리 카보네이트 막 참고 :이 프로토콜 내에서 화학 물질 및 솔루션의 대부분은 높은 증발 속도 (에탄올 (EtOH로), 아세톤 등)이있다. 다른 단계 낮은 증발 속도에 대한 긴 배양 시간을 수반한다. 파라핀 필름 용기를 밀봉하는 것이 좋습니다. 주의 : (포함 : 황산, 아세톤, (3- 아미노 프로필) 트리에 톡시 실란, 글루 타르 알데히드, EtOH로) 화학 물질의 대부분은 위험, 또는 휘발성 간주됩니다. 사용하기 전에 적절한 보관, 취급 및 폐기에 대한 각 물질의 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. <ol><li> 전체 침수를 보장 방향에 관계없이 깨끗한 유리 슬라이드 염색 접시에 1mm에 의해 50mm로 75mm를 측정하는 새로운 유리 슬라이드를 놓습니다. 단계 1.1-1.12에 대한 용기를 사용할 것. 주 : 모든 후속 인트 들면 50mm로 75mm의 크기로 잘라 0.4 미크론 기공 크기의 공동 배양에, 폴리 카보네이트를 포함한다 (PC) 막,PC의 작용과 EC 파종을위한 PS. </li><li> 황산 (20 %), O / N에서 슬라이드를 담가. 주의 : 사용하기 전에 황산에 대한 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. </li><li> 5 분, 3 회 탈 이온수 (DI)를 침지마다 DI를 ​​변경하여 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 30 분 동안 아세톤에 슬라이드를 담가. 주의 : 사용하기 전에 아세톤에 대한 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. </li><li> 6 % (3- 아미노 프로필) 트리에 톡시 실란 / 아세톤 용액의 O / N에 슬라이드를 담가. 주의 : 사용하기 전에 (3- 아미노 프로필) 트리에 톡시 실란 및 아세톤에 대한 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. </li><li> 아세톤마다 변경, 5 분, 3 회 아세톤 슬라이드 담가. 주의 : 사용하기 전에 아세톤에 대한 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. </li><li> 5 분, 3 회 DI에 담가 때마다 탈을 변경하여 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 60 분 동안 1.5 % 글루 타르 알데히드 / DI 솔루션에 슬라이드를 담가. 주의 : 사용하기 전에 글루 타르 알데히드에 대한 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. </li><li> 5 분, 두 번 DI에 담가 때마다 탈을 변경하여 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 장소 슬라이드멸균 층류 후드에서 30 분 동안 70 % 에탄올 (EtOH 중)로 S. </li><li> 의 EtOH를 제거하고 증발 잔류 남아 있습니다. 슬라이드를 재수하기 위해 멸균 DI와 드레인에 슬라이드를 담가. 참고 : 슬라이드 또는 PC 막 1 주일까지 4 ° C에서 유리 슬라이드 홀더에 밀봉 저장 될 수있다. 세포 배양에 대한 사용하면, 반복 1.10 및 1.11 단계를 반복합니다. </li><li> 슬라이드 홀더에서 슬라이드를 제거하고 층류 후드에 100mm 광장 페트리 접시에서 100mm로 배치합니다. 참고 :이 컨테이너는 나머지 모든 단계에 사용됩니다. <ol><li> 단종 실험에 대한 내피 세포 시드를위한 슬라이드 또는 PC를 준비합니다. <ol><li> 코트 기능화 슬라이드 또는 PC 한쪽에 1 ml의 피브로넥틴 용액 (25 μg의 / ㎖)과 함께 (단계 1.11), 세포 배양 챔버에 노출 근사 면적. </li><li> 1 ~ 2 시간 동안 37 ℃로 설정 무균 인큐베이터에서 슬라이드 나 PC를 품어. </li><li> 배양 후, GLA를 사용하여 남아있는 용액을 대기음진공에 접속 SS 흡인기 피펫. 참고 : 슬라이드는 이제 향후 사용을 위해 4 ° C에서 O / N을 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 단지 EC / SMC 공동 문화의 제조 1.12.2 단계를 수행합니다. 제조와 공동 배양 실험 평활근 세포 (SMC) 배양을 시드. <ol><li> 흐름 챔버 진공에 맞춰 50mm 외경 30mm로 50mm의 내경, 두께 0.5 mm로 75mm의 크기와 구멍과 슬라이드 (단계 1.11)의 상단에 배치 실리콘 가스켓. </li><li> 10 % FBS / DMEM 서스펜션에 1 ml의 SMC를 준비합니다. 7 %의 NaHCO3 및 7.4의 pH를 0.1 M NaOH 용액으로 2 ㎎ / ㎖의 콜라겐 타입 I의 1 ml의 용액을 중화하고, 2 × 106 세포 / ml의 최종 세포 밀도와 SMC 현탁액과 혼합한다. </li><li> 가스켓 내에 SMC 용액을 확산하고, 30 분간 CO 2, 37 ℃에서 슬라이드를 배양하고 5 %. </li><li> 배양 후, 수정 된 둘 베코 혼합 25 ㎖, 0.1 % 소 태아 혈청 (FBS)과 슬라이드 커버72 시간 동안 독수리 중간 (DMEM). </li></ol></li></ol></li><li> 유리 슬라이드 / 폴리 카보네이트 막에 문화 내피 세포되는 EC (). <ol><li> 시드 유리 슬라이드 또는 폴리 카보네이트 막의 피브로넥틴 표면에 6.0 × 105 세포 / ml 농도의 초기와 10 % FBS / DMEM에서 한 ML되는 EC. </li><li> 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 배양 한 세포, 및 10 % FBS 120 분. </li><li> 37 ° C에서 인큐베이터에서 추가로 10 % FBS / DMEM으로 세포 및 장소를 포함하는 커버 슬라이드, 5 % CO 2 O / N, 70 % -80 %의 합류까지. </li></ol></li></ol> 유체 점도 및 체적 유량 2. 결정 참고 : 회전 점도계 민감한 장비, 그리고 점도계 사용자 설명서는, 교정 제로, 또는 측정을 수행하기 전에 참고해야한다. <ol><li> 실험의 대상으로 혈관의 문학에서 원하는 유체 전단 (τ)를 결정합니다. </li><li> 지표 성과회전 점도계를 사용하여 E 1 % FBS / (μ) DMEM 점도. </li><li> Poiseuille 식으로부터 필요한 체적 유량 (Q)을 결정 : <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/53224/53224eq1.jpg" /> , 여기서 τ = 유체 전단, μ = 점도, Q = 권. 유량, W = 챔버 폭, H = 챔버 높이). </li><li> 설정 펌프는 단계 2.3에서 파생 된 유량, 이후의 모든 단계에 사용하는. </li></ol> 박동 지수 3. 결정 주 : 시스템 내의 모든 연결 포트는 적절한 크기의 로크 링 투 미늘 또는 암형 루어 투 미늘 연결부와 연결되어야한다. 연결 PVC 튜빙은 미늘 이음쇠에 접속 될 수 있고, 회로는 완성했다. <ol><li> 올바른 흐름 방향 챔버 (그림 3) 초음파 유량계를 감쇠와, 그림 2에서와 같이 흐름 회로를 연결합니다. 초음파 유량계는 장비의 중요한 부분이며, 참고사용자 설명서는 사용하기 전에 참고해야한다. </li><li> 저장 볼륨 내에서 침수 (펌프하기 위해) 저수지 배출 튜브를 보장함으로써, DI 물 흐름 회로와 저수지를 입력합니다. 유량계를 사용하여 흐름 파형을 시각화. </li><li> 댐핑 챔버에 야외 방출 밸브는 유체 / 풍량 비율을 변경합니다. 가까이 다른 오일 레벨 간격으로 공기 방출 밸브 및 계산 박동 지수 (PI = (V 맥스 - V 최소) / V 평균) 흐름 파형 피크 (V 최대), 통 (V 최소)를 사용하여, 그리고 의미 (V 평균). 노트북에 기​​록 PI 값. </li><li> 마크는 향후 사용을 위해 팁 펠트, 영구적 인 잉크 펜을 사용하여, 댐핑 챔버에 오일 레벨 및 PI를 결과. 병리 문학 (11)에서 원하는 PI 수준을 결정합니다. </li><li> 실리콘 튜브 Formation- 선택, 제어 박동의 더 진보 된 방법 <ol><li> 예 (BAS을 다른 비율로 실리콘 엘라스토머 기재와 경화제를 혼합1-36 : 10의 전자 - 투 - 가교제 비율. 1) 변경 대상 탄성 계수를 들어, 이전에 도시 한 바와 같이 2 </li><li> 간단히 소정의베이스 - 가교제 비율로 실리콘 프리폴리머 혼합물에 강 캐 뉼러 (14 G)에 침지 반복 침지 처리에 의해 경화 실리콘 튜브를 제작. </li><li> 경화 공정의 중간에 방향 전환, 캐 뉼러 상에 폴리머 코팅을 경화시키기 4 시간 동안 60 ℃에서 오븐 세트로 예비 코팅 된 캐 뉼러를 배치했다. </li><li> 같은 실리콘 엘라스토머 혼합물로 침지 과정을 반복 0.3 ~에 mm 두께의 튜브 결과 추가로 4 시간에 대해 다시 오븐에 넣습니다. </li><li> 스테인레스 스틸 정맥에서 얇은 실리콘 튜브를 제거합니다. </li><li> 3.3에서와 같이 각 대신 챔버 댐핑 회로 및 테스트 PI를 흐름에 튜브를 연결합니다. </li></ol></li></ol> 4. 펌프 살균 <ol><li> 1에서 유량 용기 (그림 2), PVC 튜브, 가스켓을 담가0 % 과산화수소 (H 2 O 2). 4 단계 전에 멸균 디 씻으시오. </li><li> 예비 보육 선반에 혈액 펌프를 놓습니다. 주 : 인큐베이터 선반 스테인리스, 그리고 전체 유동 회로의 무게를 지탱할 수 있어야한다. </li><li> 저장 볼륨 내에 잠기 저장조 출구 관 (펌핑하기 위해)하도록함으로써 10 % H 2 O 2 유동 회로 및 저장조를 채운다. 에 UV 광으로 층류 후드에서 20 분 동안 회로를 통해 펌핑하여 H 2 O 2를 순환. </li><li> 기음 모든 H 2 O 튜브 2, 및 흐름 회로를 통해 펌핑에 의해 멸균 PBS로 씻는다. </li></ol> 5. 유량 용기 조립 참고 : 유량 용기는 진공 포트와 입구 및 출구 흐름 ​​포트 (그림 2 참조), 아크릴, 사용자 정의 만든 판으로 구성되어 있습니다. 챔버 어셈블리 문화 슬라이드 상단의 유량 용기 및 개스킷을 배치 구성, 프로perly 정렬하고 설명한다. <ol><li> 37 ° C의 물을 욕조에 1 % FBS / DMEM을 따뜻하게하고 유량 용기를 준비합니다. <ol><li> 세포면을 위로하여 상단에 장소 가스켓 (단계 1.13)에서 용지가 EC 슬라이드를 가져 가라. </li><li> (선택 사항) 미디어에서 PC 멤브레인을 가지고 세포면을 위로하여 상단에 장소 가스켓 (단계 1.13에서). PC 막 아래 시드 SMC (단계 1.12.2)와 공동 문화 슬라이드를 놓습니다. </li></ol></li><li> 개스킷의 구멍 (그림 2)와 유량 용기의 진공 채널을 맞 춥니 다. </li><li> 진공에 어떤 미디어 누수를 보장하지 진공 포트 (그림 2)에 진공 튜브를 연결합니다. </li><li> 스프링 클램프, 유량 용기의 각면 (그림 2와 5)에 하나의 유리 슬라이드 클램프 유량 용기 어셈블리 아래 장소의 폴리 카보네이트 시트. </li><li> 장소 흐름 37 ° C에서 인큐베이터 시스템 및 5 % CO 2, 낮은 박동에 가득 저수지에서 펌핑에 의해 미디어와 회로를 입력합니다.세포를 전처리하는 4 시간 동안이 흐름을 유지한다. </li><li> 원하는 시간에 대한 유체 표시된 PI 수준으로 챔버 댐핑에 볼륨과 문화를 조정합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+co-culture+system+for+studying+mechanobiology+effects+of+pulse+flow+waves.">A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves.</a> Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).</li><li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffening-Induced+High+Pulsatility+Flow+Activates+Endothelial+Inflammation+via+a+TLR2/NF-&#954;B+Pathway.">Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-&#954;B Pathway.</a> PLoS ONE. 9 (7), e102195 (2014).</li><li>Wexler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+Artery+Calcification:+Pathophysiology,+Epidemiology,+Imaging+Methods,+and+Clinical+Implications+A+Statement+for+Health+Professionals+From+the+American+Heart+Association.">Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association.</a> Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).</li><li>Lan, T. -. H., Huang, X. -. Q., Tan, H. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+fibrosis+in+atherosclerosis.">Vascular fibrosis in atherosclerosis.</a> Cardiovasc Pathol. 22 (5), 401-407 (2013).</li><li>Lee, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+endothelial+recovery+and+reducing+neointimal+hyperplasia+using+sequential-like+release+of+acetylsalicylic+acid+and+paclitaxel-loaded+biodegradable+stents.">Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents.</a> Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).</li><li>Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Remodeling+in+Hypertension+Roles+of+Apoptosis+Inflammation,+and+Fibrosis.">Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis.</a> Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).</li><li>Greil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+carotid+artery+flow+velocities+after+stent+implantation:+a+fluid+dynamics+study+with+laser+Doppler+anemometry.">Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry.</a> J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).</li><li>Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. 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이 프로토콜은 시험관 내에서 맥동 흐름을 재생하는 방법을 설명하고, 질환 병리에 유동 조건의 기여도를 결정하는 수단이 최초의 단계가 될 수도있다. 이 프로토콜을 사용하여 이전의 연구는이 프로토콜을 경험 연구소를 대상으로, 유동 조건은 또한 혈관 염증 반응. 1, 10에 기여 발견했다. 이와 같이, 어느 깊이 유체 역학 않으며 생화학 분석은 본원에 기재되어있다. 고급 ?...

심혈관 질환의 이환율은 많은 사람들이 건강에 해로운 혈관의 결과로, 미국에서 가장 큰 있습니다. 건강한 동맥 내피 세포 (EC) 단일 층으로 코팅 된 소프트 내강 표면과, 탄성 조직으로 구성되어 있습니다. 동맥 흐름 긍정적 평균 유량을 갖는 진동 파 함수로서 모델링 될 수있다. 박동 지수 (PI)는 진동 크기의 몫과 평균 흐름 (.. (PI) = (최대 - 최소) / 평균)이며, 1 변수 혈관 탄성과 함께 체외에서 모델링 된 2 동맥의 탄력이 흐름의 저장에 중요하다. 심장 수축으로부터 에너지 수축기 압력으로 확장시키고,과 혈류를 PI 조절에 중요​​한 역할을한다. 심장 일관 박동성, 체적 유량을 유지하기 때문에, 동맥의 확장은 혈류 속도, 전단 응력, 및 PI의 흐름을 감소시킴으로써 안정성을 향상 단면적을 증가시킨다. 탄성에 자주, 건강에 해로운 동맥 본 변경또는 규정 준수, 혈관 재, 흉터 조직 또는 석회화 3, 4에서 보강 표시. 또한, 이러한 신생 내막 증식증 (NIH), 5 (6) 동맥류, 고혈압 및 혈관 섬유증 4와 같은 다른 혈관 질환은 혈관 직경을 수축 할 수있다. 그러나, 현재의 약물 치료 및 혈관 질환의 치료 장치들은 종종 용기의 형태 및 성질의 변화에​​ 의해 복잡 혈관 질환에서 혈관 벽 컴플라이언스 또는 혈류 역학의 중요성을 무시. 어느 풍선 혈관 성형술이나 스텐트 벽 탄성 (7)의 합병증에 응답합니다. 따라서, 혈액의 체외 모델링 동맥 질환과 치료에 의한 흐름은 질병의 병리와 치료의 미래 효능을 조사하는 것이 중요하다. 여기서, 우리는 혈관 질환 pathol에서 세포 반응을 판정하기위한 생리 학적 및 병리학 적 혈류를 복제하는 방법을 서술프라 이즈. 유체 유동은 혈관 내의 모든 셀에 영향을주는, 혈관 건강에 중요한 기계적 신호 혈관벽에서 전단 응력을 야기한다. 유체 전단의 혈관 내피 세포에 여러 기계적 센서는 내피 8 mechanosensing에 대한 최근의 연구에서 보여 주 섬모를 포함, 확인되었습니다. 내피 세포 활성 및 형태는 유속, 방향 및 박동에 의해 영향을 받는다. 또한 평활근 세포 (SMC) 마이그레이션 간질 액 (9)을 통해 저속 유동 - 기계 신호에 의해 영향을받을 수 있고, 또한 유동 및 사이토킨 통해 유동 신호 - 기계 형질 그들의 응답을 통해 내피 세포로부터의 분비 신호를 통해 ​​할 수있다 (10)를 놓습니다. 평균 전단, PI 및 분비 신호의 &quot;용량&quot;의존은 상호 의존적 일 수있다. 단층 문화에서이 끝, 다양한 &quot;투여&quot;와 유체 전단에 혈관 세포 반응의 결정에또는 생체 외에서 공동 배양은 혈관 재에 역학적 통찰력을 제공하고, 질병 및 치료의 예측을 개선 할 수있다. 이 실험에 사용 된 유동 시스템은 혈액 펌프, 상류 흐름 댐핑 공기 저장소 만 실험 장치, 하류 세포 배양, 평행 평판 유동 챔버, 및 미디어 저장 기 동안 사용 하류 유량계로 구성된다. , 유속 의미 같은 혈관 흐름의 제어 변수는 분당 비트 및 PI는 제어 유량, 펄스 주파수, 압력 도입 댐핑을 통해 달성 될 수있다. 박동성 혈액 펌프는 체적 유량, 및 펄스 주파수를 의미하는 직접 관련 제어 스트로크 주파수에서, 가변 스트로크 변위 가능하다. 흐름 회로 내의 공기 저장소의 도입 유량 진동 크기를 감소 압력 댐핑을 허용한다. 댐핑 챔버 내의 공기가 유동 될 파의 과도한 압력을 허용하면서 압축 가능 매체는 비압축성 유체압축 공기에 의해 흡수. 미디어 비율 공기는 많은 감쇠가 발생하는 방식을 제어 할 수 있습니다. 폭 50mm로 길이가 75mm 사용자 정의 세포 배양 흐름 챔버는 아크릴로 만들어졌습니다. 흐름은 유입구를 통해 유입 및 유동 챔버의 전체에 걸쳐 일관된 유동을 제공하는 입구 매니 폴드를 통해 확장된다. 유사한 흐름과 구조는 챔버 출구에 존재한다. 세포가 기능화 된 슬라이드 상에 접종하고,이어서 유동 챔버에 부착된다. 이것은 쉽게 연구 한 후 검색된 큰 인구 수 있습니다. 공동 배양 실험 사이토킨 / 플로우 전송을 허용하면서 문화 간의 세포 간 접촉을 제거하는 다공성 폴리 카보네이트 멤브레인을 사용할 수있다. 이 시스템은 이전에, 높은 PI 흐름 및 내피 단층 배양 및 EC / SMC 공동 배양 1, 10에 미치는 영향을 모델링하기 위해 세포 반응에 병리학 PI 높은 질환을 조사하는데 사용되었다. 이러한 플로우 콘을 모델링하는 데 사용되는 프로토콜을 기술함으로써ditions, 우리는 응답을 셀에 흐름 신호 기여를 결정하는 다른 사람을 도울 수 있도록 노력하겠습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)trethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide (70mm x 50mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS294775X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Membrane</td>
			<td>Millipore Corp.</td>
			<td>HTTP09030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Gasket</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>RD 475464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (25 &#956;g/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type-I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>36486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Damping Chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>529552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Vinyl Carbonate Tubing</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>65066, 65063, 65062</td>
			<td>Various sizes may be required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Connections</td>
			<td>Nordson Medical</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Chamber</td>
			<td>Machined in-house</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri Dish</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-14007-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide Holder</td>
			<td>Capitol Scientific</td>
			<td>WHE-900303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter</td>
			<td>Sonotec, GmbH</td>
			<td>Sonoflow co.55/060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Elastomer Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 G Steel Cannula</td>
			<td>General Laboratory Supply</td>
			<td>S8365-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of physiological and pathological blood flow with application to investigations of vascular cell remodeling

혈관 질환은 미국 내 사망의 흔한 원인이다. 여기서, 우리는 혈관 질환의 병리 향해 유동 역학의 기여를 조사하는 방법을 제시한다. 보강 벽, 흉터, 또는 모든 유체의 유량에 영향을 미칠 수있는 부분 협착증 및 유량 맥동의 크기, 또는 박동성 지수 종종 본 해로운 동맥. 다양한 유동 조건의 복제는 혈액 펌프의 하류 챔버 댐핑 유동 압력 조정의 결과이다. 압축성 매체 펌프로부터의 압력 맥동을 흡수하므로 박동 지수를 변화시키기 위해 닫힌 유동 시스템 내에서 공기의 도입은 허용한다. 본원에 기술 된 방법은 매우 간단하게 제어 가능한 입력하고 쉽게 측정 결과와 함께 재생된다. 몇 가지 제한 사항은 시스템에 의해 근사 복잡한 생리 펄스 파형, 레크리에이션이다. 내피 세포, 평활근 세포, 섬유 아세포 및 혈류 THR 의해 영향동맥을 깨닫지 못하고 있거나 남의. 혈류의 다이내믹 성분은 심 박출량 및 동맥벽의 준수에 의해 결정된다. 유동 역학의 혈관 세포 - 기계 전달은 사이토 카인의 방출과 동맥 내 세포 유형 사이의 크로스 토크를 트리거 할 수 있습니다. 혈관 세포의 공 배양은 혈관벽과 혈관 기계적 시그널링 응답에 대한보다 정확한 그림 반사 세포 - 세포 상호 작용이다. 흐름의 동적 및 평균 (또는 정상) 성분 세포 반응을 포함 유동 역학의 기여는, 따라서 질병 병리 및 치료 효능을 결정하는 중요한 메트릭이다. 시험 관내 공동 배양 모델을 도입하고, 압력 모의 심 박출량을 생성 혈액 펌프의 하류 댐핑 통해, 각종 동맥 질환의 병리 상태를 조사 할 수있다.

유동 조건의 유지 보수 흐름 회로 (그림 1)의 정확한 조립에 의존하고있다. 직경 튜브하기 전에 배양 한 후 챔버 유동 저항 및 후속 압력 강하를 감소시키는 큰 직경 어셈블리에서 중요한 선택이다. 의도 압력 및 유속을 보장하기 위해 의도 된 튜빙 실험 전에 유량계 시스템을 조립한다. 실리콘 가스켓 (사진 없음)에 절취선이있는 문화 챔버 진공 채널 (그림 2)의 정렬, 흐름...

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In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

이 프로토콜은 질환 병상의 세포 응답을 결정하는 데에 도움이 시험관 내에서 생리 학적 또는 병리학 적 혈류를 복제. 혈액 펌프의 하류 챔버 압력 감쇠를 도입하여, 맥관 걸쳐 혈류량 효과적으로 요약 될 수 있고, 혈관 내피 또는 유사체 공동 배양 단층 부과.

혈관 세포 리모델링의 조사에 생리의 체외 모델 및 응용 프로그램과 함께 병리학 혈액 흐름

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

9.5K 조회수.  University of Colorado at Boulder.  이 프로토콜은 질환 병상의 세포 응답을 결정하는 데에 도움이 시험관 내에서 생리 학적 또는 병리학 적 혈류를 복제. 혈액 펌프의 하류 챔버 압력 감쇠를 도입하여, 맥관 걸쳐 혈류량 효과적으로 요약 될 수 있고, 혈관 내피 또는 유사체 공동 배양 단층 부과. 

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Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

방법 혈액 - 뇌 장벽의 인간 세포 기반의 연락 모델의 준비를 위해 개선

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

연구

생체공학

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

생리 흐름 조건에서 순환 세포의 케모카인 - 감독 넘쳐을 연구하는 소설 입체 흐름 챔버 장치

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Shock Wave Application to Cell Cultures

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to target cells or tissue without any subsequent damage. Therefore, in vitro experiments are of increasing interest. Various methods of applying shock waves onto cell cultures have been described. In general, all existing models focus on how to best apply shock waves onto cells.
However, this question remains: What happens to the waves after passing the cell culture? The difference of the acoustic impedance of the cell culture medium and the ambient air is that high, that more than 99% of shock waves get reflected! We therefore developed a model that mainly consists of a Plexiglas built container that allows the waves to propagate in water after passing the cell culture. This avoids cavitation effects as well as reflection of the waves that would otherwise disturb upcoming ones. With this model we are able to mimic in vivo conditions and thereby gain more and more knowledge about how the physical stimulus of shock waves gets translated into a biological cell signal (&#8220;mechanotransduction&#34;).

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Therefore in vitro experiments are of increasing interest. We therefore developed a model for in vitro shock wave trials (IVSWT) that enables us to mimic in vivo conditions thereby avoiding distracting physical effects.

문화를 셀에 충격파 응용 프로그램

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

암 세포의 침략에 응용 프로그램을 사용하여 종양의 기질 미시의 조직 공학

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to model well differentiated human airway epithelium and heart muscle cells. This could be an invaluable tool to study the deleterious effects of toxic inhaled chemicals, such as chlorine, that can normally interact with the cell surfaces, and form various byproducts upon reacting with water, and limiting their effects in submerged cultures. Our model using well differentiated human airway epithelial cell cultures at air-liqiuid interface circumvents this limitation as well as provides an opportunity to evaluate critical mechanisms of toxicity of potential poisonous inhaled chemicals. We describe enhanced loss of membrane integrity, caspase release and death upon toxic inhaled chemical such as chlorine exposure. In this article, we propose methods to model chlorine exposure in mammalian heart and airway epithelial cells in culture and simple tests to evaluate its effect on these cell types.

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

This protocol is designed to demonstrate exposure method of cell cultures to inhaled toxic chemicals. Exposure of differentiated air-liquid&#160;interface (ALI) cultures of airway epithelial cells provides a unique model of airway exposure to toxic gases such as chlorine. In this manuscript we describe effect of chlorine exposure on air-liquid&#160;interface cultures of epithelial cells and submerged culture of cardiomyocytes. In vitro exposure systems allow important mechanistic studies to evaluate pathways that could then be utilized to develop novel therapeutic agents.

독성 흡입 화학 시험에 대한 시험 관내 세포 배양 모델에서

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

매트릭스 수정에 의해 유도 된 세포 접착 및 탈 부착의 실시간 변화를 측정 셀 기판 임피던스와 라이브 세포 이미징을 사용하여

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

미세 유체 흐름 챔버 지혈 및 혈소판 수혈을 모델링하기 위해 재구성 된 혈액을 사용하여<em&gt; 체외</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

혈소판 수혈 및 지혈을위한 미세 유체 유량 용기 모델은 실시간으로 혈소판 증착 및 섬유소 형성을 측정합니다

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

<em&gt; 체외</em쥐의 추간판의&gt; 장기 문화 모델

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...