저자는 (중량 HL097246 및 HL119371) AHA (중량 13GRNT16990019) 및 NHLBI을 포함하여 자금 출처를 인정하고 싶습니다.

1. 실란 화 및 슬라이드의 생체 분자 기능화 또는 폴리 카보네이트 막 참고 :이 프로토콜 내에서 화학 물질 및 솔루션의 대부분은 높은 증발 속도 (에탄올 (EtOH로), 아세톤 등)이있다. 다른 단계 낮은 증발 속도에 대한 긴 배양 시간을 수반한다. 파라핀 필름 용기를 밀봉하는 것이 좋습니다. 주의 : (포함 : 황산, 아세톤, (3- 아미노 프로필) 트리에 톡시 실란, 글루 타르 알데히드, EtOH로) 화학 물질의 대부분은 위험, 또는 휘발성 간주됩니다. 사용하기 전에 적절한 보관, 취급 및 폐기에 대한 각 물질의 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. <ol><li> 전체 침수를 보장 방향에 관계없이 깨끗한 유리 슬라이드 염색 접시에 1mm에 의해 50mm로 75mm를 측정하는 새로운 유리 슬라이드를 놓습니다. 단계 1.1-1.12에 대한 용기를 사용할 것. 주 : 모든 후속 인트 들면 50mm로 75mm의 크기로 잘라 0.4 미크론 기공 크기의 공동 배양에, 폴리 카보네이트를 포함한다 (PC) 막,PC의 작용과 EC 파종을위한 PS. </li><li> 황산 (20 %), O / N에서 슬라이드를 담가. 주의 : 사용하기 전에 황산에 대한 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. </li><li> 5 분, 3 회 탈 이온수 (DI)를 침지마다 DI를 ​​변경하여 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 30 분 동안 아세톤에 슬라이드를 담가. 주의 : 사용하기 전에 아세톤에 대한 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. </li><li> 6 % (3- 아미노 프로필) 트리에 톡시 실란 / 아세톤 용액의 O / N에 슬라이드를 담가. 주의 : 사용하기 전에 (3- 아미노 프로필) 트리에 톡시 실란 및 아세톤에 대한 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. </li><li> 아세톤마다 변경, 5 분, 3 회 아세톤 슬라이드 담가. 주의 : 사용하기 전에 아세톤에 대한 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. </li><li> 5 분, 3 회 DI에 담가 때마다 탈을 변경하여 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 60 분 동안 1.5 % 글루 타르 알데히드 / DI 솔루션에 슬라이드를 담가. 주의 : 사용하기 전에 글루 타르 알데히드에 대한 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. </li><li> 5 분, 두 번 DI에 담가 때마다 탈을 변경하여 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 장소 슬라이드멸균 층류 후드에서 30 분 동안 70 % 에탄올 (EtOH 중)로 S. </li><li> 의 EtOH를 제거하고 증발 잔류 남아 있습니다. 슬라이드를 재수하기 위해 멸균 DI와 드레인에 슬라이드를 담가. 참고 : 슬라이드 또는 PC 막 1 주일까지 4 ° C에서 유리 슬라이드 홀더에 밀봉 저장 될 수있다. 세포 배양에 대한 사용하면, 반복 1.10 및 1.11 단계를 반복합니다. </li><li> 슬라이드 홀더에서 슬라이드를 제거하고 층류 후드에 100mm 광장 페트리 접시에서 100mm로 배치합니다. 참고 :이 컨테이너는 나머지 모든 단계에 사용됩니다. <ol><li> 단종 실험에 대한 내피 세포 시드를위한 슬라이드 또는 PC를 준비합니다. <ol><li> 코트 기능화 슬라이드 또는 PC 한쪽에 1 ml의 피브로넥틴 용액 (25 μg의 / ㎖)과 함께 (단계 1.11), 세포 배양 챔버에 노출 근사 면적. </li><li> 1 ~ 2 시간 동안 37 ℃로 설정 무균 인큐베이터에서 슬라이드 나 PC를 품어. </li><li> 배양 후, GLA를 사용하여 남아있는 용액을 대기음진공에 접속 SS 흡인기 피펫. 참고 : 슬라이드는 이제 향후 사용을 위해 4 ° C에서 O / N을 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 단지 EC / SMC 공동 문화의 제조 1.12.2 단계를 수행합니다. 제조와 공동 배양 실험 평활근 세포 (SMC) 배양을 시드. <ol><li> 흐름 챔버 진공에 맞춰 50mm 외경 30mm로 50mm의 내경, 두께 0.5 mm로 75mm의 크기와 구멍과 슬라이드 (단계 1.11)의 상단에 배치 실리콘 가스켓. </li><li> 10 % FBS / DMEM 서스펜션에 1 ml의 SMC를 준비합니다. 7 %의 NaHCO3 및 7.4의 pH를 0.1 M NaOH 용액으로 2 ㎎ / ㎖의 콜라겐 타입 I의 1 ml의 용액을 중화하고, 2 × 106 세포 / ml의 최종 세포 밀도와 SMC 현탁액과 혼합한다. </li><li> 가스켓 내에 SMC 용액을 확산하고, 30 분간 CO 2, 37 ℃에서 슬라이드를 배양하고 5 %. </li><li> 배양 후, 수정 된 둘 베코 혼합 25 ㎖, 0.1 % 소 태아 혈청 (FBS)과 슬라이드 커버72 시간 동안 독수리 중간 (DMEM). </li></ol></li></ol></li><li> 유리 슬라이드 / 폴리 카보네이트 막에 문화 내피 세포되는 EC (). <ol><li> 시드 유리 슬라이드 또는 폴리 카보네이트 막의 피브로넥틴 표면에 6.0 × 105 세포 / ml 농도의 초기와 10 % FBS / DMEM에서 한 ML되는 EC. </li><li> 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 배양 한 세포, 및 10 % FBS 120 분. </li><li> 37 ° C에서 인큐베이터에서 추가로 10 % FBS / DMEM으로 세포 및 장소를 포함하는 커버 슬라이드, 5 % CO 2 O / N, 70 % -80 %의 합류까지. </li></ol></li></ol> 유체 점도 및 체적 유량 2. 결정 참고 : 회전 점도계 민감한 장비, 그리고 점도계 사용자 설명서는, 교정 제로, 또는 측정을 수행하기 전에 참고해야한다. <ol><li> 실험의 대상으로 혈관의 문학에서 원하는 유체 전단 (τ)를 결정합니다. </li><li> 지표 성과회전 점도계를 사용하여 E 1 % FBS / (μ) DMEM 점도. </li><li> Poiseuille 식으로부터 필요한 체적 유량 (Q)을 결정 : <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/53224/53224eq1.jpg" /> , 여기서 τ = 유체 전단, μ = 점도, Q = 권. 유량, W = 챔버 폭, H = 챔버 높이). </li><li> 설정 펌프는 단계 2.3에서 파생 된 유량, 이후의 모든 단계에 사용하는. </li></ol> 박동 지수 3. 결정 주 : 시스템 내의 모든 연결 포트는 적절한 크기의 로크 링 투 미늘 또는 암형 루어 투 미늘 연결부와 연결되어야한다. 연결 PVC 튜빙은 미늘 이음쇠에 접속 될 수 있고, 회로는 완성했다. <ol><li> 올바른 흐름 방향 챔버 (그림 3) 초음파 유량계를 감쇠와, 그림 2에서와 같이 흐름 회로를 연결합니다. 초음파 유량계는 장비의 중요한 부분이며, 참고사용자 설명서는 사용하기 전에 참고해야한다. </li><li> 저장 볼륨 내에서 침수 (펌프하기 위해) 저수지 배출 튜브를 보장함으로써, DI 물 흐름 회로와 저수지를 입력합니다. 유량계를 사용하여 흐름 파형을 시각화. </li><li> 댐핑 챔버에 야외 방출 밸브는 유체 / 풍량 비율을 변경합니다. 가까이 다른 오일 레벨 간격으로 공기 방출 밸브 및 계산 박동 지수 (PI = (V 맥스 - V 최소) / V 평균) 흐름 파형 피크 (V 최대), 통 (V 최소)를 사용하여, 그리고 의미 (V 평균). 노트북에 기​​록 PI 값. </li><li> 마크는 향후 사용을 위해 팁 펠트, 영구적 인 잉크 펜을 사용하여, 댐핑 챔버에 오일 레벨 및 PI를 결과. 병리 문학 (11)에서 원하는 PI 수준을 결정합니다. </li><li> 실리콘 튜브 Formation- 선택, 제어 박동의 더 진보 된 방법 <ol><li> 예 (BAS을 다른 비율로 실리콘 엘라스토머 기재와 경화제를 혼합1-36 : 10의 전자 - 투 - 가교제 비율. 1) 변경 대상 탄성 계수를 들어, 이전에 도시 한 바와 같이 2 </li><li> 간단히 소정의베이스 - 가교제 비율로 실리콘 프리폴리머 혼합물에 강 캐 뉼러 (14 G)에 침지 반복 침지 처리에 의해 경화 실리콘 튜브를 제작. </li><li> 경화 공정의 중간에 방향 전환, 캐 뉼러 상에 폴리머 코팅을 경화시키기 4 시간 동안 60 ℃에서 오븐 세트로 예비 코팅 된 캐 뉼러를 배치했다. </li><li> 같은 실리콘 엘라스토머 혼합물로 침지 과정을 반복 0.3 ~에 mm 두께의 튜브 결과 추가로 4 시간에 대해 다시 오븐에 넣습니다. </li><li> 스테인레스 스틸 정맥에서 얇은 실리콘 튜브를 제거합니다. </li><li> 3.3에서와 같이 각 대신 챔버 댐핑 회로 및 테스트 PI를 흐름에 튜브를 연결합니다. </li></ol></li></ol> 4. 펌프 살균 <ol><li> 1에서 유량 용기 (그림 2), PVC 튜브, 가스켓을 담가0 % 과산화수소 (H 2 O 2). 4 단계 전에 멸균 디 씻으시오. </li><li> 예비 보육 선반에 혈액 펌프를 놓습니다. 주 : 인큐베이터 선반 스테인리스, 그리고 전체 유동 회로의 무게를 지탱할 수 있어야한다. </li><li> 저장 볼륨 내에 잠기 저장조 출구 관 (펌핑하기 위해)하도록함으로써 10 % H 2 O 2 유동 회로 및 저장조를 채운다. 에 UV 광으로 층류 후드에서 20 분 동안 회로를 통해 펌핑하여 H 2 O 2를 순환. </li><li> 기음 모든 H 2 O 튜브 2, 및 흐름 회로를 통해 펌핑에 의해 멸균 PBS로 씻는다. </li></ol> 5. 유량 용기 조립 참고 : 유량 용기는 진공 포트와 입구 및 출구 흐름 ​​포트 (그림 2 참조), 아크릴, 사용자 정의 만든 판으로 구성되어 있습니다. 챔버 어셈블리 문화 슬라이드 상단의 유량 용기 및 개스킷을 배치 구성, 프로perly 정렬하고 설명한다. <ol><li> 37 ° C의 물을 욕조에 1 % FBS / DMEM을 따뜻하게하고 유량 용기를 준비합니다. <ol><li> 세포면을 위로하여 상단에 장소 가스켓 (단계 1.13)에서 용지가 EC 슬라이드를 가져 가라. </li><li> (선택 사항) 미디어에서 PC 멤브레인을 가지고 세포면을 위로하여 상단에 장소 가스켓 (단계 1.13에서). PC 막 아래 시드 SMC (단계 1.12.2)와 공동 문화 슬라이드를 놓습니다. </li></ol></li><li> 개스킷의 구멍 (그림 2)와 유량 용기의 진공 채널을 맞 춥니 다. </li><li> 진공에 어떤 미디어 누수를 보장하지 진공 포트 (그림 2)에 진공 튜브를 연결합니다. </li><li> 스프링 클램프, 유량 용기의 각면 (그림 2와 5)에 하나의 유리 슬라이드 클램프 유량 용기 어셈블리 아래 장소의 폴리 카보네이트 시트. </li><li> 장소 흐름 37 ° C에서 인큐베이터 시스템 및 5 % CO 2, 낮은 박동에 가득 저수지에서 펌핑에 의해 미디어와 회로를 입력합니다.세포를 전처리하는 4 시간 동안이 흐름을 유지한다. </li><li> 원하는 시간에 대한 유체 표시된 PI 수준으로 챔버 댐핑에 볼륨과 문화를 조정합니다. </li></ol>

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이 프로토콜은 시험관 내에서 맥동 흐름을 재생하는 방법을 설명하고, 질환 병리에 유동 조건의 기여도를 결정하는 수단이 최초의 단계가 될 수도있다. 이 프로토콜을 사용하여 이전의 연구는이 프로토콜을 경험 연구소를 대상으로, 유동 조건은 또한 혈관 염증 반응. 1, 10에 기여 발견했다. 이와 같이, 어느 깊이 유체 역학 않으며 생화학 분석은 본원에 기재되어있다. 고급 ?...

심혈관 질환의 이환율은 많은 사람들이 건강에 해로운 혈관의 결과로, 미국에서 가장 큰 있습니다. 건강한 동맥 내피 세포 (EC) 단일 층으로 코팅 된 소프트 내강 표면과, 탄성 조직으로 구성되어 있습니다. 동맥 흐름 긍정적 평균 유량을 갖는 진동 파 함수로서 모델링 될 수있다. 박동 지수 (PI)는 진동 크기의 몫과 평균 흐름 (.. (PI) = (최대 - 최소) / 평균)이며, 1 변수 혈관 탄성과 함께 체외에서 모델링 된 2 동맥의 탄력이 흐름의 저장에 중요하다. 심장 수축으로부터 에너지 수축기 압력으로 확장시키고,과 혈류를 PI 조절에 중요​​한 역할을한다. 심장 일관 박동성, 체적 유량을 유지하기 때문에, 동맥의 확장은 혈류 속도, 전단 응력, 및 PI의 흐름을 감소시킴으로써 안정성을 향상 단면적을 증가시킨다. 탄성에 자주, 건강에 해로운 동맥 본 변경또는 규정 준수, 혈관 재, 흉터 조직 또는 석회화 3, 4에서 보강 표시. 또한, 이러한 신생 내막 증식증 (NIH), 5 (6) 동맥류, 고혈압 및 혈관 섬유증 4와 같은 다른 혈관 질환은 혈관 직경을 수축 할 수있다. 그러나, 현재의 약물 치료 및 혈관 질환의 치료 장치들은 종종 용기의 형태 및 성질의 변화에​​ 의해 복잡 혈관 질환에서 혈관 벽 컴플라이언스 또는 혈류 역학의 중요성을 무시. 어느 풍선 혈관 성형술이나 스텐트 벽 탄성 (7)의 합병증에 응답합니다. 따라서, 혈액의 체외 모델링 동맥 질환과 치료에 의한 흐름은 질병의 병리와 치료의 미래 효능을 조사하는 것이 중요하다. 여기서, 우리는 혈관 질환 pathol에서 세포 반응을 판정하기위한 생리 학적 및 병리학 적 혈류를 복제하는 방법을 서술프라 이즈. 유체 유동은 혈관 내의 모든 셀에 영향을주는, 혈관 건강에 중요한 기계적 신호 혈관벽에서 전단 응력을 야기한다. 유체 전단의 혈관 내피 세포에 여러 기계적 센서는 내피 8 mechanosensing에 대한 최근의 연구에서 보여 주 섬모를 포함, 확인되었습니다. 내피 세포 활성 및 형태는 유속, 방향 및 박동에 의해 영향을 받는다. 또한 평활근 세포 (SMC) 마이그레이션 간질 액 (9)을 통해 저속 유동 - 기계 신호에 의해 영향을받을 수 있고, 또한 유동 및 사이토킨 통해 유동 신호 - 기계 형질 그들의 응답을 통해 내피 세포로부터의 분비 신호를 통해 ​​할 수있다 (10)를 놓습니다. 평균 전단, PI 및 분비 신호의 &quot;용량&quot;의존은 상호 의존적 일 수있다. 단층 문화에서이 끝, 다양한 &quot;투여&quot;와 유체 전단에 혈관 세포 반응의 결정에또는 생체 외에서 공동 배양은 혈관 재에 역학적 통찰력을 제공하고, 질병 및 치료의 예측을 개선 할 수있다. 이 실험에 사용 된 유동 시스템은 혈액 펌프, 상류 흐름 댐핑 공기 저장소 만 실험 장치, 하류 세포 배양, 평행 평판 유동 챔버, 및 미디어 저장 기 동안 사용 하류 유량계로 구성된다. , 유속 의미 같은 혈관 흐름의 제어 변수는 분당 비트 및 PI는 제어 유량, 펄스 주파수, 압력 도입 댐핑을 통해 달성 될 수있다. 박동성 혈액 펌프는 체적 유량, 및 펄스 주파수를 의미하는 직접 관련 제어 스트로크 주파수에서, 가변 스트로크 변위 가능하다. 흐름 회로 내의 공기 저장소의 도입 유량 진동 크기를 감소 압력 댐핑을 허용한다. 댐핑 챔버 내의 공기가 유동 될 파의 과도한 압력을 허용하면서 압축 가능 매체는 비압축성 유체압축 공기에 의해 흡수. 미디어 비율 공기는 많은 감쇠가 발생하는 방식을 제어 할 수 있습니다. 폭 50mm로 길이가 75mm 사용자 정의 세포 배양 흐름 챔버는 아크릴로 만들어졌습니다. 흐름은 유입구를 통해 유입 및 유동 챔버의 전체에 걸쳐 일관된 유동을 제공하는 입구 매니 폴드를 통해 확장된다. 유사한 흐름과 구조는 챔버 출구에 존재한다. 세포가 기능화 된 슬라이드 상에 접종하고,이어서 유동 챔버에 부착된다. 이것은 쉽게 연구 한 후 검색된 큰 인구 수 있습니다. 공동 배양 실험 사이토킨 / 플로우 전송을 허용하면서 문화 간의 세포 간 접촉을 제거하는 다공성 폴리 카보네이트 멤브레인을 사용할 수있다. 이 시스템은 이전에, 높은 PI 흐름 및 내피 단층 배양 및 EC / SMC 공동 배양 1, 10에 미치는 영향을 모델링하기 위해 세포 반응에 병리학 PI 높은 질환을 조사하는데 사용되었다. 이러한 플로우 콘을 모델링하는 데 사용되는 프로토콜을 기술함으로써ditions, 우리는 응답을 셀에 흐름 신호 기여를 결정하는 다른 사람을 도울 수 있도록 노력하겠습니다.

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Glass Slide (70&amp;#160;mm x 50&amp;#160;mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonate Membrane</td><td>Millipore Corp.</td><td>HTTP09030</td><td></td></tr><tr><td>Silicone Gasket</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>RD 475464</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin (25 &amp;mu;g/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type-I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka</td><td>36486</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Damping Chamber</td><td></td><td></td><td>This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of &lt;strong&gt;Figure 3&lt;/strong&gt;.</td></tr><tr><td>Blood Pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>529552</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Vinyl Carbonate Tubing</td><td>US Plastic</td><td>65066, 65063, 65062</td><td>Various sizes may be required</td></tr><tr><td>Luer Connections</td><td>Nordson Medical</td><td>Various</td><td>Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use.</td></tr><tr><td>Culture Chamber</td><td>Machined in-house</td><td>Custom</td><td>Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in &lt;strong&gt;Figure 2&lt;/strong&gt; may be used to recreate this chamber.</td></tr><tr><td>Square Petri Dish</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-14007-10</td><td></td></tr><tr><td>Glass Slide Holder</td><td>Capitol Scientific</td><td>WHE-900303</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Flow Meter</td><td>Sonotec, GmbH</td><td>Sonoflow co.55/060</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Elastomer Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036-5EA</td><td></td></tr><tr><td>14 G Steel Cannula</td><td>General Laboratory Supply</td><td>S8365-1</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro model of physiological and pathological blood flow with application to investigations of vascular cell remodeling

혈관 질환은 미국 내 사망의 흔한 원인이다. 여기서, 우리는 혈관 질환의 병리 향해 유동 역학의 기여를 조사하는 방법을 제시한다. 보강 벽, 흉터, 또는 모든 유체의 유량에 영향을 미칠 수있는 부분 협착증 및 유량 맥동의 크기, 또는 박동성 지수 종종 본 해로운 동맥. 다양한 유동 조건의 복제는 혈액 펌프의 하류 챔버 댐핑 유동 압력 조정의 결과이다. 압축성 매체 펌프로부터의 압력 맥동을 흡수하므로 박동 지수를 변화시키기 위해 닫힌 유동 시스템 내에서 공기의 도입은 허용한다. 본원에 기술 된 방법은 매우 간단하게 제어 가능한 입력하고 쉽게 측정 결과와 함께 재생된다. 몇 가지 제한 사항은 시스템에 의해 근사 복잡한 생리 펄스 파형, 레크리에이션이다. 내피 세포, 평활근 세포, 섬유 아세포 및 혈류 THR 의해 영향동맥을 깨닫지 못하고 있거나 남의. 혈류의 다이내믹 성분은 심 박출량 및 동맥벽의 준수에 의해 결정된다. 유동 역학의 혈관 세포 - 기계 전달은 사이토 카인의 방출과 동맥 내 세포 유형 사이의 크로스 토크를 트리거 할 수 있습니다. 혈관 세포의 공 배양은 혈관벽과 혈관 기계적 시그널링 응답에 대한보다 정확한 그림 반사 세포 - 세포 상호 작용이다. 흐름의 동적 및 평균 (또는 정상) 성분 세포 반응을 포함 유동 역학의 기여는, 따라서 질병 병리 및 치료 효능을 결정하는 중요한 메트릭이다. 시험 관내 공동 배양 모델을 도입하고, 압력 모의 심 박출량을 생성 혈액 펌프의 하류 댐핑 통해, 각종 동맥 질환의 병리 상태를 조사 할 수있다.

유동 조건의 유지 보수 흐름 회로 (그림 1)의 정확한 조립에 의존하고있다. 직경 튜브하기 전에 배양 한 후 챔버 유동 저항 및 후속 압력 강하를 감소시키는 큰 직경 어셈블리에서 중요한 선택이다. 의도 압력 및 유속을 보장하기 위해 의도 된 튜빙 실험 전에 유량계 시스템을 조립한다. 실리콘 가스켓 (사진 없음)에 절취선이있는 문화 챔버 진공 채널 (그림 2)의 정렬, 흐름...

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In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

이 프로토콜은 질환 병상의 세포 응답을 결정하는 데에 도움이 시험관 내에서 생리 학적 또는 병리학 적 혈류를 복제. 혈액 펌프의 하류 챔버 압력 감쇠를 도입하여, 맥관 걸쳐 혈류량 효과적으로 요약 될 수 있고, 혈관 내피 또는 유사체 공동 배양 단층 부과.

혈관 세포 리모델링의 조사에 생리의 체외 모델 및 응용 프로그램과 함께 병리학 혈액 흐름

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

9.6K 조회수.  University of Colorado at Boulder.  이 프로토콜은 질환 병상의 세포 응답을 결정하는 데에 도움이 시험관 내에서 생리 학적 또는 병리학 적 혈류를 복제. 혈액 펌프의 하류 챔버 압력 감쇠를 도입하여, 맥관 걸쳐 혈류량 효과적으로 요약 될 수 있고, 혈관 내피 또는 유사체 공동 배양 단층 부과. 

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Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

Hematologic 질환의 Microvascular 상호 작용 유학을위한 Endothelialized Microfluidics

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

연구

생체공학

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent endothelial progenitors (EPs), which can differentiate into the cell types necessary to assemble mature, functional vasculature, have been derived from both embryonic and induced pluripotent stem cells. However, these cells have not been rigorously evaluated in three-dimensional environments, and a quantitative measure of their vasculogenic potential remains elusive. Here, the generation and isolation of iPSC-EPs via fluorescent-activated cell sorting are first outlined, followed by a description of the encapsulation and culture of iPSC-EPs in collagen hydrogels. This extracellular matrix (ECM)-mimicking microenvironment encourages a robust vasculogenic response; vascular networks form after a week of culture. The creation of a computational pipeline that utilizes open-source software to quantify this vasculogenic response is delineated. This pipeline is specifically designed to preserve the 3D architecture of the capillary plexus to robustly identify the number of branches, branching points, and the total network length with minimal user input.

Endothelial progenitors derived from induced pluripotent stem cells (iPSC-EPs) have the potential to revolutionize cardiovascular disease treatments and to enable the creation of more faithful cardiovascular disease models. Herein, the encapsulation of iPSC-EPs in three-dimensional (3D) collagen microenvironments and a quantitative analysis of these cells&#8217; vasculogenic potential are described.

iPSC 유래 내피 선조의 혈관 전위를 정량화하는 체외 3D 모델 및 전산 파이프라인

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

발생학

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

hiPSC 유래 내피 세포의 분화 및 기계적 자극

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides transporting oxygen and nutrients to ensure fetal growth, fetal circulation controls many crucial developmental events taking place within the endothelial layer through mechanical cues. Biomechanical signals induce blood vessel structural changes, establish arteriovenous specification, and control the development of hematopoietic stem cells. The inaccessibility of the developing tissues limits the understanding of the role of circulation in early human development; therefore, in vitro models are pivotal tools for the study of vessel mechanobiology. This paper describes a protocol to differentiate endothelial cells from human induced pluripotent stem cells and their subsequent seeding into a fluidic device to study their response to mechanical cues. This approach allows for long-term culture of endothelial cells under mechanical stimulation followed by&#160;retrieval of the endothelial cells for phenotypical and functional characterization. The in vitro model established here will be instrumental to elucidate&#160;the intracellular molecular mechanisms that transduce the signaling mediated by mechanical cues, which ultimately orchestrate vessel development during human fetal life.

저자 스포트라이트: 유체 매개 기계적 자극 하에서 배양된 hiPSC 유래 내피 세포 연구 

Described here is a simple workflow to differentiate endothelial cells from human pluripotent stem cells followed by a detailed protocol for their mechanical stimulation. This allows for the study of the developmental mechanobiology of endothelial cells. This approach is compatible with downstream assays of live cells collected from the culture chip after mechanical stimulation.

In Vitro (시험관내) 발달 기계생물학을 연구하기 위한 태아 인간 혈관 온칩 모델

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

면역학 및 감염병학

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current in vitro screening models that have sufficient throughput only have limited physiological relevance, which hinders the translation of findings from in vitro to in vivo. On the other hand, microfluidic cell culture platforms have shown unparalleled physiological relevancy in vitro, but often lack the required throughput, scalability and standardization. We demonstrate a robust platform to study angiogenesis of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC-ECs) in a physiological relevant cellular microenvironment, including perfusion and gradients. The iPSC-ECs are cultured as 40 perfused 3D microvessels against a patterned collagen-1 scaffold. Upon the application of a gradient of angiogenic factors, important hallmarks of angiogenesis can be studied, including the differentiation into tip- and stalk cell and the formation of perfusable lumen. Perfusion with fluorescent tracer dyes enables the study of permeability during and after anastomosis of the angiogenic sprouts. In conclusion, this method shows the feasibility of iPSC-derived ECs in a standardized and scalable 3D angiogenic assay that combines physiological relevant culture conditions in a platform that has the required robustness and scalability to be integrated within the drug screening infrastructure.

This method describes the culture of iPSC-derived endothelial cells as 40 perfused 3D microvessels in a standardized microfluidic platform. This platform enables the study of gradient-driven angiogenic sprouting in 3D, including anastomosis and stabilization of the angiogenic sprouts in a scalable and high-throughput manner.

iPSC 유래 내피 세포의 퍼퓨비드 3D 혈관신생 발아연구를 위한 표준화 및 확장 성 분석

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the initial stage varies dramatically from the following process of neovascularization. Although there are plenty of models to simulate different stages of neovascularization, an in vitro 3D model that capitulates the initial process of neovascularization under the corresponding stimulations of normal vasculature microenvironments is still lacking. Here, we reconstructed an in vitro 3D model that mimics the initial event of neovascularization (MIEN). The MIEN model contains a microfluidic sprouting chip and an automatic control, highly efficient circulation system. A functional, perfusable microchannel coated with endothelium was formed and the process of sprouting was simulated in the microfluidic sprouting chip. The initially physiological microenvironment of neovascularization was recapitulated with the microfluidic control system, by which ECs would be exposed to high luminal shear stress, physiological transendothelial flow, and various vascular endothelial growth factor (VEGF) distributions simultaneously. The MIEN model can be readily applied to the study of neovascularization mechanism and holds a potential promise as a low-cost platform for drug screening and toxicology applications.

Here, we provide a microfluidic chip and an automatically controlled, highly efficient circulation microfluidic system that recapitulates the initial microenvironment of neovascularization, allowing endothelial cells (ECs) to be stimulated by high luminal shear stress, physiological level of transendothelial flow, and various vascular endothelial growth factor (VEGF) distribution simultaneously.

뇌혈관화의 초기 이벤트를 모방하는 미세 유체 모델

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of various important processes in the cardiovascular system. Recently, although several biological studies have been performed using such 3D models of human arteries, they have not been applied to study vascular targeting. This paper presents a new method to fabricate real-sized, reconstructed human arterial models using a 3D printing technique, line them with human endothelial cells (ECs), and study particle targeting under physiological flow. These models have the advantage of replicating the physiological size and conditions of blood vessels in the human body using low-cost components. This technique may serve as a new platform for studying and understanding drug targeting in the cardiovascular system and may improve the design of new injectable nanomedicines. Moreover, the presented approach may provide significant tools for the study of targeted delivery of different agents for cardiovascular diseases under patient-specific flow and physiological conditions.

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Here, we present a new protocol to study and map the targeted deposition of drug carriers to endothelial cells in fabricated, real-sized, three-dimensional human artery models under physiological flow. The presented method may serve as a new platform for targeting drug carriers within the vascular system.

유동 하에서 혈관 약물 표적화 연구를 위한 체외 3D 세포 배양 동맥 모델

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

혈관 세포 리모델링의 조사에 생리의 체외 모델 및 응용 프로그램과 함께 병리학 혈액 흐름

요약

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Hematologic 질환의 Microvascular 상호 작용 유학을위한 Endothelialized Microfluidics

iPSC 유래 내피 선조의 혈관 전위를 정량화하는 체외 3D 모델 및 전산 파이프라인

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

In Vitro (시험관내) 발달 기계생물학을 연구하기 위한 태아 인간 혈관 온칩 모델

In Vitro (시험관내) 발달 기계생물학을 연구하기 위한 태아 인간 혈관 온칩 모델

In Vitro (시험관내) 발달 기계생물학을 연구하기 위한 태아 인간 혈관 온칩 모델

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

iPSC 유래 내피 세포의 퍼퓨비드 3D 혈관신생 발아연구를 위한 표준화 및 확장 성 분석

뇌혈관화의 초기 이벤트를 모방하는 미세 유체 모델

유동 하에서 혈관 약물 표적화 연구를 위한 체외 3D 세포 배양 동맥 모델