이 연구는 유럽 혈액학 협회(European Hematology Association)의 2021년 연구 고급 보조금(Research Advanced Grant 2021), 미국 혈액학회(American Society of Hematology)의 2021년 글로벌 연구상(Global Research Award 2021), 웰컴 트러스트(Welcome Trust)와 에든버러 대학교(University of Edinburgh)가 자금을 지원하는 내부 전략 지원 기금 ISSF3의 지원을 받았습니다. 유세포 분석 분석을 지원해 주신 유세포 분석 시설의 Fiona Rossi에게 감사드립니다. 오픈 액세스를 위해, 저자는 이 제출물에서 발생하는 모든 저자 수락 원고 버전에 크리에이티브 커먼즈 저작자표시(CC BY) 라이선스를 적용했습니다.

hiPSC 유래 내피 세포의 분화 및 기계적 자극

<ol>
	<li>Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+before+birth:+clues+from+gene+knockouts+and+mutations.">Death before birth: clues from gene knockouts and mutations.</a> Trends in Genetics. 11 (3), 87-93 (1995).</li><li>Ji, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+cardiac+function+during+early+mouse+embryogenesis+coincides+with+entry+of+primitive+erythroblasts+into+the+embryo+proper.">Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper.</a> Circulation Research. 92 (2), 133-135 (2003).</li><li>Peacock, H. M., Daems, M., Jones, E. A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+control+of+endothelial+cell+fates+in+development.">Hemodynamic control of endothelial cell fates in development.</a> Cardiac and Vascular Biology. 8, 127-166 (2021).</li><li>Chong, D. C., Koo, Y., Xu, K., Fu, S., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+arteriovenous+fate+acquisition+during+mammalian+vasculogenesis.">Stepwise arteriovenous fate acquisition during mammalian vasculogenesis.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2153-2165 (2011).</li><li>Jaffredo, T., Gautier, R., Eichmann, A., Dieterlen-Li&#232;vre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraaortic+hemopoietic+cells+are+derived+from+endothelial+cells+during+ontogeny.">Intraaortic hemopoietic cells are derived from endothelial cells during ontogeny.</a> Development. 125 (22), 4575-4583 (1998).</li><li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+Tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells.">Fate Tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).</li><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development.">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).</li><li>Boisset, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+haematopoietic+cells+emerging+from+the+mouse+aortic+endothelium.">In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium.</a> Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).</li><li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+forces+promote+embryonic+haematopoiesis.">Biomechanical forces promote embryonic haematopoiesis.</a> Nature. 459 (7250), 1131-1135 (2009).</li><li>Diaz, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+forces+promote+blood+development+through+prostaglandin+E2+and+the+cAMP-PKA+signaling+axis.">Biomechanical forces promote blood development through prostaglandin E2 and the cAMP-PKA signaling axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 212 (5), 665-680 (2015).</li><li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+development+is+dependent+on+blood+flow.">Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow.</a> Cell. 137 (4), 736-748 (2009).</li><li>Lundin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP+regulates+hematopoietic+stem+cell+formation+in+response+to+the+biomechanical+forces+of+blood+flow.">YAP regulates hematopoietic stem cell formation in response to the biomechanical forces of blood flow.</a> Developmental Cell. 52 (4), 446.e5-460.e5 (2020).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicry+of+embryonic+circulation+enhances+the+hoxa+hemogenic+niche+and+human+blood+development.">Mimicry of embryonic circulation enhances the hoxa hemogenic niche and human blood development.</a> Cell Reports. 40 (11), 111339 (2022).</li><li>Azzoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+onset+of+circulation+triggers+a+metabolic+switch+required+for+endothelial+to+hematopoietic+transition.">The onset of circulation triggers a metabolic switch required for endothelial to hematopoietic transition.</a> Cell Reports. 37 (11), 110103 (2021).</li><li>Li, Y. S. J., Haga, J. H., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+the+effects+of+shear+stress+on+vascular+endothelial+cells.">Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells.</a> Journal of Biomechanics. 38 (10), 1949-1971 (2005).</li><li>Batsivari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+hematopoietic+stem+cell+development+through+functional+correlation+of+their+proliferative+status+with+the+intra-aortic+cluster+architecture.">Understanding hematopoietic stem cell development through functional correlation of their proliferative status with the intra-aortic cluster architecture.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1549-1562 (2017).</li><li>Canu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endothelial-to-haematopoietic+transition+at+the+single+cell+level+identifies+cell+cycle+regulation+as+a+driver+of+differentiation.">Analysis of endothelial-to-haematopoietic transition at the single cell level identifies cell cycle regulation as a driver of differentiation.</a> Genome Biology. 21 (1), 157 (2020).</li><li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterialization+requires+the+timely+suppression+of+cell+growth.">Arterialization requires the timely suppression of cell growth.</a> Nature. 589 (7842), 437-441 (2020).</li><li>Yang, C. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+KLF1+enhances+the+differentiation+and+maturation+of+red+blood+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Activation of KLF1 enhances the differentiation and maturation of red blood cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).</li><li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+iPSC+line+capable+of+differentiating+into+functional+macrophages+expressing+ZsGreen:+A+tool+for+the+study+and+in+vivo+tracking+of+therapeutic+cells.">A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170219 (2018).</li><li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+characterization+of+human+macrophages+from+pluripotent+stem+cells.">Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 2020 (158), (2020).</li><li>Fidanza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analyses+and+machine+learning+define+hematopoietic+progenitor+and+HSC-like+cells+derived+from+human+PSCs.">Single cell analyses and machine learning define hematopoietic progenitor and HSC-like cells derived from human PSCs.</a> Blood. 136 (25), 2893-2904 (2020).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+development+is+dependent+on+blood+flow.">Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow.</a> Cell. 137 (4), 736-748 (2009).</li><li>Nguyen, J., Lin, Y. Y., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next+generation+of+endothelial+differentiation:+Tissue-specific+ECs.">The next generation of endothelial differentiation: Tissue-specific ECs.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1188-1204 (2021).</li><li>Petazzi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+cells+support+the+development+of+human+hematopoietic+progenitors+in+vitro+via+secretion+of+IGFBP2.">Arterial cells support the development of human hematopoietic progenitors in vitro via secretion of IGFBP2.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Crosse, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-layered+spatial+transcriptomics+identify+secretory+factors+promoting+human+hematopoietic+stem+cell+development.">Multi-layered spatial transcriptomics identify secretory factors promoting human hematopoietic stem cell development.</a> Cell Stem Cell. 27 (5), 822 (2020).</li><li>Calvanese, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+human+haematopoietic+stem+cells+from+haemogenic+endothelium+to+birth.">Mapping human haematopoietic stem cells from haemogenic endothelium to birth.</a> Nature. 604 (7906), 534-540 (2022).</li><li>Zeng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+first+hematopoietic+stem+cell+generation+in+human+embryo+by+single-cell+RNA+sequencing.">Tracing the first hematopoietic stem cell generation in human embryo by single-cell RNA sequencing.</a> Cell Research. 29 (11), 881-894 (2019).</li><li>Hwa, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+arterial-venous+fusions+and+fate+specification+in+mouse+embryos+lacking+blood+flow.">Abnormal arterial-venous fusions and fate specification in mouse embryos lacking blood flow.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11965 (2017).</li></ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

여기에서 설명하는 프로토콜은 인간 만능 줄기 세포로부터 기계에 민감한 내피 세포를 생성하고 제어된 전단 응력에 의해 매개되는 기계적 자극에 대한 반응을 연구할 수 있도록 합니다. 이 프로토콜은 완전히 사이토카인 기반이며 세포 치료용 세포 생산으로 전환될 수 있는 GMP 시약과 완벽하게 호환됩니다.
hiPSC의 유도는 과학자들에게 배아 발달의 초기 단계를 위한 도구 모델을 제공하여 생체 내에서 연구하기 어려운 과정을 연구할 수 있도록 합니다 24. 사실, 연구에 사용할 수 있는 인간 배아 조직은 순환이 부족한 배아에서 수집되며, 이는 기계적 신호에 의해 제어되는 분자 서명에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 여기에 설명된 접근 방식을 통해 전단 응력에 대한 세포 반응의 실시간 이미징 및 실시간 연구가 가능합니다. hiPSC와 유체 공학의 조합은 순환 개시가 심혈관 및 혈액 시스템의 확립을 리모델링하고 제어할 때 발달 중인 태아 조직의 제한된 가용성과 접근 불가능성을 극복하는 연구 모델을 제공합니다 3,9,10,25.
프로토콜의 한계는 이 프로토콜로부터 유도된 내피 세포가 발달 조직에 존재하는 상이한 내피 세포의 다양한 정체성을 반영하지 않을 수 있다는 것이다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 원하는 동일성 또는 조직-특이적 표현형을 얻기 위해 유체 자극에 선행하는 분화 과정 동안 사이토카인의 특정 조합이 필요할 수있다 26. 내피 서브세트의 분리는 분리 단계 동안 보다 정제된 면역표현형을 사용하여 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 CD34의 발현만을 기반으로 내피 세포를 분리하여 형광 활성화 세포 분류(FACS) 대신 컬럼 분리를 허용합니다. 이를 통해 세포 사멸과 오염 위험을 줄일 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 층류에 의해 매개되는 전단 응력의 역할을 연구하기 위해 특별히 설계되었습니다. 스트레칭 또는 압축과 같은 다른 기계적 단서 또는 교란 또는 교란된 흐름과 같은 다른 유형의 흐름의 영향을 연구하기 위해 대체 유체 접근 방식을 사용해야 합니다.
우리는 이전에 iPSC-유래 내피 세포가 태아 등쪽 대동맥(28,29,30)에서 관찰된 것과 유사한 이질적인 동정맥 세포 정체성(27)을 모방한다는 것을 보여주었다. 이는 혈관 발달 및 세포 사양의 맥락에서 특히 중요하며, 혈액 순환에 의해 조절되는 것으로 알려져 있습니다. 다른 모델에 대한 연구는 순환 부족으로 인해 동정맥 사양이 변경된다는 것을 보여주었습니다11,14,31. 기계적 단서와 세포 사양을 연결하는 메커니즘은 아직 알려지지 않았으며 여기에 설명된 파이프라인을 통해 생체 내에서 테스트할 수 없는 정교한 기능 연구를 수행할 수 있습니다.
이 파이프라인은 상업적으로 이용 가능한 유체 채널을 사용하여 hiPSC로부터 유래된 내피 세포의 생산 및 자극을 설명하며, 널리 사용되는 폴리디메틸실록산(PDMS) 장치(12)와 같이 장치를 주조할 필요가 없습니다. 또한 PDMS 칩을 사용하면 자극된 세포를 수집하기가 특히 까다로워지는 반면, 이 프로토콜을 사용하면 채널에서 세포를 쉽게 검색할 수 있습니다. 이를 통해 분석 성능이 크게 향상되어 단백질체 및 전사체 분석, 유세포 분석 및 기능 분석과 같은 후속 분석이 가능하며, 추가 배양 또는 생체 내 분석이 필요할 수 있습니다.

배아 발달 과정에서 심장은 기능을 확립하는 첫 번째 기관이며1, 심내막 형성 초기 단계부터 수축이 감지된다2. 혈액 순환은 혈관 내 혈액 흐름에 의해 매개되는 기계적 신호와 함께 초기 발달의 많은 중요한 측면을 제어합니다. 태아 순환 확립 전에 혈관 조직은 1 차 모세 혈관 신경총으로 구성됩니다. 심장 기능에 따라 이 신경총은 정맥 혈관과 동맥 혈관으로 재편성된다3. 동정맥 사양에서 기계적 단서의 역할은 혈류가 시작되기 전에 동맥 및 정맥 표지자의 범내피 발현에 의해 반영된다4.
혈류역학적 힘은 혈관 자체의 발달을 제어할 뿐만 아니라 혈액 세포 형성을 제어하는 데 근본적인 역할을 합니다. 조혈모세포 와 전구세포(HSPC)는 혈원성 내피 5,6,7,8이라고 하는 특수 내피 세포에서 나오며, 발달 초기 단계에서만 배아의 다른 해부학적 영역에 존재합니다. 심장 결핍 모델은 체외 모델과 함께 기계적 단서가 혈구 내피 9,10,11,12,13,14에서 HSPC 생성을 지시하고 증가시킨다는 것을 입증했습니다.
상이한 유형의 유동 역학은 세포 주기(15)를 차등적으로 제어하는 것으로 나타났으며, 이는 혈원성 내피(16,17) 및 동맥 세포 사양(18) 모두에서 중요한 것으로 알려져 있다. 전체적으로, 기계적 신호는 발달 중 세포 정체성과 기능을 결정하는 중요한 요소입니다. 새로운 체외 유체 장치를 통해 생체 내 인간 혈액 발달 중 발달 역학 연구와 관련된 한계를 극복할 수 있습니다.
이 원고에 있는 프로토콜의 전반적인 목표는 인간 유도만능줄기세포(hiPSC)에서 체외 에서 유래한 인간 내피 세포에 대한 전단 응력의 영향을 연구하기 위한 실험 파이프라인을 단계별로 설명하는 것입니다. 이 프로토콜에는 hiPSC를 내피 세포로 분화하고 자극 프로토콜을 위해 유체 칩으로 후속 파종하는 방법에 대한 자세한 지침이 포함되어 있습니다. 이를 사용하여 다양한 체외 유래 내피 세포가 흐름에 반응하여 방향을 분석하여 전단 응력을 감지하는 능력을 테스트할 수 있습니다. 이를 통해 다른 실험실에서는 전단 응력에 대한 반응과 다양한 내피 세포 식별에 대한 기능적 결과에 대한 질문을 해결할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6 Luer uncoated slide</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>IB-80186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% BSA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10008-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cited as Dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspiration pipette</td>
			<td>Sardtedt</td>
			<td>86.1252.011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Cited as Neuronal cell culture supplement (50x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS DIVA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Version 8.0.1</td>
			<td>Cited as flow cytometry software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa 5 Laser</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 Microbead kit</td>
			<td>Miltenyil Biotec</td>
			<td>30-046-702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 PE clone 4H11</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12-0349-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 PerCP-eFluor 710 clone 4H11</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>44-0349-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar cell-repellent surface 6-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657970</td>
			<td>Cited as cell-repellent plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Cayman Chemicals&#160;</td>
			<td>13122-1mg-CAY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10&#160; cell cryopreservation</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C2874-100ML</td>
			<td>Cited as Cryopreservation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>200-664-3</td>
			<td>Cited as DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPB Ca2+ Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14080055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY Strainer 40 &#956;m</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>542040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent</td>
			<td>Miltenyil Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.53c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Jo</td>
			<td></td>
			<td>Version 10.7.1</td>
			<td>Cited as flow cytometry sanalysis oftware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLT3L</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19-10uG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic unit</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Cited as L-glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham F-12&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferrin</td>
			<td>Merk</td>
			<td>T0665-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin</td>
			<td>Fujifilm UK LTD</td>
			<td>9988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Pump system</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td>Cited as Pump system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ioLight/Thisle Scientific</td>
			<td>IOL-IO-INVERT</td>
			<td>Cited as inverted in-incubator microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilised BSA&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Separator</td>
			<td>Miltenyil Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td>Cited as Magnetic separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td>Miltenyil Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>Cited as Magnetic column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M6145-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notebook for pump system</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 37-41%</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>F/1501/PB15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pastette</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>612398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set YELLOW/GREEN: 50 cm, ID 1.6 mm, 10 mL reservoirs</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>IB-10964</td>
			<td>Cited as Perfusion set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round Bottom Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td>Cited as Flow cytometry tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td></td>
			<td>Verison 9.4.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump control software</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>version 1.6.1</td>
			<td>Cited as Pump software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stem cell tecchonologies</td>
			<td>5872</td>
			<td>Cited as Detaching solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhBMP4</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>314-BP-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhEPO</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>287-TC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIGF1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11-100uG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIL11</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-11-10uG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIL3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-03-10uG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIL6</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>206-IL-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhLaminin-521</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A29248</td>
			<td>Cited as Laminin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhSCF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHC2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhTPO</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>288-TPN-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhVEGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>293-VE-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Lysis Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serial Connector for &#181;-Slides: Sterile, Sterile</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>IB-10830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro-CD34 SFM media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10639011</td>
			<td>Cited as Serum-Free media for CD34+ cells (SFM-34)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro-CD34 Nutrient Supplement&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10641-025</td>
			<td>Cited as 34 nutrient supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro hESC SFM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1000701</td>
			<td>Cited as Culture media&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10006-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin (VTN-N) recombinant human protein, truncated</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A31804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>Cited as iRock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of fetal human vessel on-chip to study developmental mechanobiology

심장은 발달 과정에서 기능적으로 확립되는 첫 번째 기관으로, 임신 초기에 혈액 순환을 시작합니다. 태아의 성장을 보장하기 위해 산소와 영양분을 운반하는 것 외에도 태아 순환은 기계적 신호를 통해 내피층 내에서 발생하는 많은 중요한 발달 사건을 제어합니다. 생체역학적 신호는 혈관 구조 변화를 유도하고, 동정맥 사양을 확립하며, 조혈모세포의 발달을 조절합니다. 발달 중인 조직에 접근할 수 없다는 것은 초기 인간 발달에서 순환의 역할에 대한 이해를 제한합니다. 따라서 in vitro 모델은 혈관 기계생물학 연구를 위한 중추적인 도구입니다. 이 논문은 내피 세포를 인간 유도 만능 줄기 세포와 구별하고 기계적 신호에 대한 반응을 연구하기 위해 유체 장치에 파종하는 프로토콜을 설명합니다. 이 접근법은 기계적 자극 하에서 내피 세포를 장기간 배양한 후 표현형 및 기능적 특성 분석을 위해 내피 세포를 회수할 수 있습니다. 여기에서 확립된 시험관 내 모델은 궁극적으로 인간 태아의 생애 동안 혈관 발달을 조율하는 기계적 신호에 의해 매개되는 신호를 전달하는 세포 내 분자 메커니즘을 설명하는 데 중요한 역할을 할 것입니다.

During embryonic development, the heart is the first organ to establish functionality1, with detectable contractions from the earliest stage of endocardial tube formation2. Circulation, along with the mechanical cues mediated by the flow of blood within the vessel, controls many crucial aspects of early development. Prior to fetal circulation establishment, the vasculature is organized into a primary capillary plexus; upon cardiac functioning, this plexus reorganizes into venous and arterial vasculature3. The role of mechanical cues in arteriovenous specification is reflected by the pan-endothelial expression of arterial and venous markers before blood flow initiation4.
Hemodynamic forces not only control the development of the vasculature itself but also play a fundamental role in the control of blood cell formation. Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) emerge from specialized endothelial cells called hemogenic endothelium5,6,7,8, present in different anatomical regions of the embryos exclusively in the early stage of development. Heart-deficient models, together with in vitro models, have demonstrated that mechanical cues instruct and increase HSPC production from the hemogenic endothelium9,10,11,12,13,14.
Different types of flow dynamics have been shown to differentially control the cell cycle15, known to be important in both hemogenic endothelium16,17 and arterial cell specification18. Altogether, mechanical cues are critical determinants of cell identity and function during development. Novel in vitro fluidic devices allow us to overcome the limitations involved with studying developmental mechanobiology during human blood development in vivo.
The overall goal of the protocol in this manuscript is to describe, step-by-step, the experimental pipeline to study the effect of shear stress on human endothelial cells derived in vitro from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). This protocol contains detailed instructions on the differentiation of hiPSCs into endothelial cells and their subsequent seeding into fluidic chips for the stimulation protocol. Using this, different in vitro-derived endothelial cells can be tested for their ability to sense the shear stress by analyzing their orientation in response to the flow. This will allow other laboratories to address questions about the response to shear stress and its functional consequences on different endothelial cell identities.

저자 스포트라이트: 유체 매개 기계적 자극 하에서 배양된 hiPSC 유래 내피 세포 연구 

In Vitro (시험관내) 발달 기계생물학을 연구하기 위한 태아 인간 혈관 온칩 모델

Our research explores how mechanical cues instruct the fate of endothelial cells during development, for which we combine human-induced pluripotent stem cell differentiation with fluidic-mediated mechanical stimulation. Endothelial cells are constantly exposed to the movement of blood, so important signals are missed out in static culture, which makes this the main challenge in studying endothelial cell biology using traditional culture systems. Mechanical cues, in fact, activate many crucial signaling pathways that might be overlooked in cells cultured in static conditions.Our protocol provides an easy, step-by-step guide on how to differentiate and mechanically stimulate induced pluripotent stem-cell-derived endothelial cells. This will help many laboratories in adopting a thermic culture to easily address questions about endothelial cell behavior while under flow.

여기서는 기계적 신호에 대한 반응을 연구할 수 있는 hiPSC에서 유래한 내피 세포의 분화 및 기계적 자극을 위한 프로토콜을 설명합니다(그림 1). 이 프로토콜은 기능적으로 기계에 민감한 내피 세포를 생산합니다. 여기에 대표적인 결과를 제공하고 분화 중에 세포가 사이토카인 자극에 어떻게 반응하는지 평가하기 위해 예상되는 표현형을 설명합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig01v2.jpg"> 그림 1: 차별화 및 기계적 자극 프로토콜의 개략도. 사이토카인의 다양한 혼합물, CD34+ 세포 분리, 유체 칩 파종 및 기계적으로 자극된 세포의 최종 분석의 타이밍을 보여주는 분화 프로토콜의 개략도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig01largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
hiPSC의 배양 자가 갱신 조건에서 올바르게 성장하는 hiPSC에서 프로토콜을 시작하는 것이 중요합니다. 문화의 질을 나타내는 좋은 지표는 성장 속도입니다. 해동 후 세포는 좋은 분화를 보장하는 올바른 성장 단계에 도달하는 데 2-3주가 필요할 수 있습니다. 세포가 일주일에 두 번 1:6의 비율로 거의 완전한 밀도에 도달하여 통과할 수 있을 때, 이것은 세포가 통과해야 하는 당일에 분화할 준비가 된 시간입니다.
hiPSC를 내피세포로 분화 배아체(EB)의 형성으로 구성된 분화의 첫 번째 단계는 세포주에 따라 다르며 사용 중인 특정 세포주에 대해 약간의 최적화가 필요할 수 있습니다. 프로토콜 단계 1.3.2.2-1.3.2.4에 설명된 해리는 해리 시약을 사용한 배양을 줄이거나 연장하고 파스퇴르 피펫을 사용한 후속 해리를 통해 수정할 수 있습니다. 또한, 절삭 공구 또는 P100 피펫 팁을 사용한 콜로니의 물리적 해리 외에도 다른 해리 시약을 이 단계에 사용할 수 있습니다. 좋은 품질의 EB는 분화 2일차에 정의된 가장자리를 나타내며 현미경을 사용하여 관찰할 때 선명하고 밝게 나타납니다. 어두운 영역은 EB 내의 세포 사멸을 나타낼 수 있습니다(그림 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig2v3.jpg"> 그림 2: 배아체 형태. (A) 잘 정의된 바깥쪽 가장자리와 일관된 크기를 보여주는 2일차 배아체. (B) 구조의 분해를 초래하는 광범위한 세포 사멸을 보여주는 품질이 좋지 않은 2일차 배아체. 스케일 바 = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
2일째에 EB에 CHIR99021을 추가하면 GSK-3 단백질이 억제되어 Wnt 경로가 활성화됩니다. 세포주마다 CHIR 처리에 대한 반응이 다르기 때문에 다른 농도를 사용하여 8일째에 얻은 CD34+ 세포의 수를 정량화하여 테스트해야 합니다(그림 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig3v3.jpg"> 그림 3: 다양한 CHIR 처리를 사용한 내피 세포 분화. CD34 막 발현에 의한 분화 8일차에 유세포 분석으로 정량화한 내피 세포 투입, (A) 3μM, (B) 5μM 및 (C) 7μM에서 2일차에 CHIR 처리 후. 유세포 분석 데이터는 5개의 레이저 유세포분석기와 전용 소프트웨어를 사용하여 획득했습니다( 재료 표 참조). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
CD34+ 세포 분리 마그네틱 비드를 사용한 CD34+ 농축이 컬럼 용출 후 최소 80%의 CD34+를 제공하는지 검증하는 것이 중요합니다. 충분한 순도를 보장하기 위해 자기 분리에서 얻은 세포의 부분 표본을 유세포 분석으로 분석하여 자기 농축에 사용된 것과 다른 항체 클론을 사용할 수 있습니다. 여기서, 4H11 클론을 사용하였고 농축 후 ~85%의 순도를 달성하였다(도 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig4v3.jpg"> 그림 4: 자기 분류에 의한 농축 전후의 CD34 막 발현. 8일째 해리된 배아체(회색)와 자기 농축 후 세포(녹색)를 CD34 발현을 위해 염색하고 유세포 분석으로 분석하여 성공적인 농축 후 분류를 보여주었습니다. 유세포 분석 데이터는 5개의 레이저 유세포분석기와 전용 소프트웨어를 사용하여 획득했습니다( 재료 표 참조). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
유체 채널에 세포 파종 유체 채널에서 세포를 파종할 때 내피 세포의 접착 및 증식을 추적하는 것이 중요합니다. 파종 후 세포가 채널에 완전히 부착되는 데 ~5시간이 걸립니다(그림 5A). 이 단계에서 접착력을 향상시키기 위해 대체 코팅 용액을 테스트할 수도 있습니다. 테스트된 세포가 기계에 민감하여 기계적 자극에 반응할 수 있는지 확인하기 위해 시간이 지남에 따라 세포 방향을 테스트할 수 있습니다. 자극 전의 세포는 무작위 배향을 나타내고(그림 5A 및 그림 5C) 흐름 방향과 평행하게 방향을 바꿉니다(그림 5B, C). 여기에 설명된 프로토콜은 채널에서 세포를 수집하여 막 면역표현형을 연구하기 위한 다운스트림 분석(예: 유세포 분석)을 수행할 수 있도록 하여 자극된 세포의 내피 식별을 제공합니다(그림 5D,E).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig5v3.jpg"> 그림 5: hiPSC 유래 내피 세포의 기계적 반응성 . (A) 파종 후 48시간 동안 분리된 CD34+ 세포의 합류층. (B) 동적 배양 하에서 3일 동안 내피 세포의 방향 전환된 층. (C) 동적 배양 5일 후 내피 세포의 방향 분석. (D) 5일 동안 유동 상태에서 배양된 세포의 CD34 발현 프로파일. (E) 유체 채널에서 회수된 세포 집단의 CD34+ 세포의 백분율. 이미지는 도립된 인큐베이터 현미경을 사용하여 촬영되었습니다. 유세포 분석 데이터는 5개의 레이저 유세포분석기와 전용 소프트웨어를 사용하여 획득했습니다( 재료 표 참조). 스케일 바 = 100 μm (A,B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>시약</td>
			<td>재고 집중</td>
			<td>볼륨 추가됨</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>Iscove의 수정된 Dulbecco's Medium(IMDM)</td>
			<td>-</td>
			<td>333 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>함의 F-12 영양 혼합물 (F-12)</td>
			<td>-</td>
			<td>167 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>N-2 서플리먼트(×100)</td>
			<td>100 배</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1배</td>
		</tr><tr><td>B-27 서플리먼트(×50)</td>
			<td>50 배</td>
			<td>10mL</td>
			<td>1배</td>
		</tr><tr><td>아스코르브산</td>
			<td>10mg/mL</td>
			<td>1.25 mL</td>
			<td>25μg/mL</td>
		</tr><tr><td>α-모노티오글리세롤(MTG)</td>
			<td>11.5 미터</td>
			<td>19.5 μL</td>
			<td>448.5 마이크로미터</td>
		</tr><tr><td>인간 혈청 알부민</td>
			<td>100mg/mL</td>
			<td>2.5 mL</td>
			<td>0.5mg/mL</td>
		</tr><tr><td>홀로-트랜스페린</td>
			<td>100mg/mL</td>
			<td>0.75 mL</td>
			<td>150μg/mL</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 500mL의 무혈청 분화(SFD) 배지의 조성 및 제조법.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>차별화의 시대</td>
			<td>사이토카인 믹스</td>
			<td>사이토카인(Cytokine)</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>0 - 2일차</td>
			<td>믹스 1</td>
			<td>BMP4 시리즈</td>
			<td>20ng/mL</td>
		</tr><tr><td>2일차</td>
			<td>믹스 2</td>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>7 μM의</td>
		</tr><tr><td>3일차부터</td>
			<td rowspan="2">믹스 3과 4</td>
			<td>베지에프</td>
			<td>15ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>bFGF (비FGF)</td>
			<td>5ng/mL</td>
		</tr><tr><td>6일째부터</td>
			<td rowspan="8">믹스 4</td>
			<td>IL6 시리즈</td>
			<td>10ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>FLT3L 시리즈</td>
			<td>10ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IGF1 (IGF1)</td>
			<td>25ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IL11 시리즈</td>
			<td>5ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>증권 시세 표시기</td>
			<td>50ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>유럽 특허청(EPO)</td>
			<td>3 U/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>TPO (TPO)</td>
			<td>30ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>일리노이3</td>
			<td>30ng/mL</td>
		</tr></tbody></table>표 2: 내피 세포 분화에 사용되는 사이토카인의 혼합물, SFD 배지에 첨가된 일수 및 최종 농도.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>전단 응력(dyn/cm2)</td>
			<td>시간(h)</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>1.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>2.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>3.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>실험이 끝날 때까지</td>
		</tr></tbody></table>표 3: 동적 배양 및 적용 길이에 대한 전단 응력 값.
보충 그림 S1: 이 프로토콜에 사용되는 칩 및 튜브의 형상 및 치수. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/SF1.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S2: 각 단계에 대한 설명과 함께 공기 펌프를 제어하는 소프트웨어에 대한 단계별 가이드입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492_Supp%20Figure%20S2%20FINAL.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S3: FIJI를 사용한 방향 분석 가이드는 셀 모양, 타원 피팅 및 최종 측정의 도면을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492_SF3.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충표 S1: 분화 프로토콜에 사용되는 사이토카인에 대한 단위 크기, 재현탁 부피 및 스톡 농도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/Ventura%20et%20al,%202023%20-%20Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Studying hiPSC-Derived Endothelial Cells Cultured Under Fluidic-Mediated Mechanical Stimulation at JoVE.com

여기에는 내피 세포와 인간 만능 줄기 세포를 구별하는 간단한 워크플로우와 기계적 자극에 대한 자세한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이를 통해 내피 세포의 발달 역학을 연구할 수 있습니다. 이 접근법은 기계적 자극 후 배양 칩에서 수집된 살아있는 세포의 다운스트림 분석과 호환됩니다.

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

우리의 연구는 발달 과정에서 기계적 단서가 내피 세포의 운명을 어떻게 지시하는지 탐구하며, 이를 위해 인간 유도 만능 줄기 세포 분화와 유체 매개 기계적 자극을 결합합니다. 내피 세포는 혈액의 움직임에 지속적으로 노출되기 때문에 정적 배양에서는 중요한 신호를 놓치기 때문에 전통적인 배양 시스템을 사용하여 내피 세포 생물학을 연구하는 데 있어 주요 과제가 됩니다. 실제로 기계적 신호는 정적 조건에서 배양된 세포에서 간과될 수 있는 많은 중요한 신호 전달 경로를 활성화합니다.당사의 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포 유래 내피 세포를 분화하고 기계적으로 자극하는 방법에 대한 쉬운 단계별 가이드를 제공합니다. 이는 많은 실험실에서 열 배양을 채택하여 유동 중 내피 세포 거동에 대한 질문을 쉽게 해결하는 데 도움이 될 것입니다.

in-vitro-model-fetal-human-vessel-on-chip-to-study-developmental

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

749 조회수.  University of Edinburgh. 우리의 연구는 발달 과정에서 기계적 단서가 내피 세포의 운명을 어떻게 지시하는지 탐구하며, 이를 위해 인간 유도 만능 줄기 세포 분화와 유체 매개 기계적 자극을 결합합니다. 내피 세포는 혈액의 움직임에 지속적으로 노출되기 때문에 정적 배양에서는 중요한 신호를 놓치기 때문에 전통적인 배양 시스템을 사용하여 내피 세포 생물학을 연구하는 데 있어 주요 과제가 됩?...

비디오: 저자 스포트라이트: 유체 매개 기계적 자극 하에서 배양된 hiPSC 유래 내피 세포 연구 

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides transporting oxygen and nutrients to ensure fetal growth, fetal circulation controls many crucial developmental events taking place within the endothelial layer through mechanical cues. Biomechanical signals induce blood vessel structural changes, establish arteriovenous specification, and control the development of hematopoietic stem cells. The inaccessibility of the developing tissues limits the understanding of the role of circulation in early human development; therefore, in vitro models are pivotal tools for the study of vessel mechanobiology. This paper describes a protocol to differentiate endothelial cells from human induced pluripotent stem cells and their subsequent seeding into a fluidic device to study their response to mechanical cues. This approach allows for long-term culture of endothelial cells under mechanical stimulation followed by&#160;retrieval of the endothelial cells for phenotypical and functional characterization. The in vitro model established here will be instrumental to elucidate&#160;the intracellular molecular mechanisms that transduce the signaling mediated by mechanical cues, which ultimately orchestrate vessel development during human fetal life.

Described here is a simple workflow to differentiate endothelial cells from human pluripotent stem cells followed by a detailed protocol for their mechanical stimulation. This allows for the study of the developmental mechanobiology of endothelial cells. This approach is compatible with downstream assays of live cells collected from the culture chip after mechanical stimulation.

연구

발생학

﻿Differentiation of hiPSCs into Endothelial Cells

Differentiation of hiPSCs into Endothelial Cells  

To begin, on day zero, pre-warm serum-free differentiation medium or SFD medium containing Mix 1 cytokine to 37 degrees Celsius. Then, under a sterile tissue culture hood, add the Mix 1 cytokine-supplemented medium to each well of a cell repellent six-well plate. To prepare the cells, aspirate the culture medium from a six-well plate containing human-induced pluripotent STEM cells or human IPS cells.Wash them with DPBS followed by aspirating the DPBS. Then, add the dissociation reagent to the cells and incubate them at room temperature for a minute. After aspirating this dissociation reagent, incubate the cells for another three minutes at room temperature.Then, tap the plate containing the cells 10 times on each side to detach the cell clusters. Add one milliliter of pre-warmed Mix 1 cytokine-supplemented SFD medium to the cells per well. Using a pasture pipette, transfer the cell clusters from each well to one well of the cell repellent plate containing the medium with Mix 1 cytokine.After introducing the plate into the incubator, move it back and forth, as well as side to side, to disperse the content evenly and incubate it for embryoid bodies, or EB, formation. The next day, swirl the cell repellent plate containing the EBs to collect them into the center of the wells. Using a pasteur pipette, transfer the EB suspension from the wells to a 15-milliliter centrifuge tube.Wait five to 10 minutes for the EBs to settle at the bottom of the tube. Meanwhile, wash the cell repellent plates with sterile water or DPBS to remove single cells or debris. Add two milliliters of Mix 1 cytokine-supplemented SFD medium to each well of the plate.Now, gently aspirate the supernatant from the centrifuge tube without dislodging the EBs. Resuspend the EBs in the calculated volume of SFD medium containing Mix 1 cytokine. Add one milliliter of EB suspension to each well of the washed cell repellent plate already containing two milliliters of medium.Incubate the plate after dispersing the EBs by gently moving the plate as mentioned before. After gathering the EBs at the center of the wells, add the chiron on the side of each well, avoiding direct contact with the cells, Incubate the wells as demonstrated previously. On days three and six of differentiation, collect the EBs and perform media changes as demonstrated previously for day one.Use SFD medium supplemented with Mix 3 cytokines on day three and use SFD medium supplemented with Mix 4 cytokines on day six. After collecting and settling the EBs from the cell repellent plate into a 15-milliliter centrifuge tube, as demonstrated previously, aspirate the supernatant, then add one milliliter of cell dissociation reagent per well of EB collected in the tube to resuspend the EBs. Next, transfer one milliliter of this EB suspension to each well of the cell repellent plate washed with water.After incubating the plate for 10 minutes in the incubator, use a P1000 pipette to dissociate the EBs in each well by gently pipetting up and down no more than 10 times. Then, add five milliliters of washing buffer per well of dissociated EBs. Collect the cells into a 50-milliliter centrifuge tube by passing them through a 40-micron strainer.After counting the cells in the filtered suspension, spin the cells down for 10 minutes at 300g. Resuspend the cells in 300 microliters of washing buffer by gently pipetting a few times, ensuring no clumps are present. Proceed to isolate the CD34-positive cells using a CD34 microbead kit per the manufacturer's instructions.EBs of good quality showed a defined edge by day two of the differentiation and appeared clear and bright when observed under a microscope. The presence of darker areas indicated cell death within the EBs. Following chiron treatment with varying concentrations on day two, quantifying the number of CD34-positive cells at day eight of differentiation revealed the response of the cell line to the treatment.Flow cytometry showed that the CD34-positive enrichment using the magnetic beads provided about 85%CD34-positive cells.

hiPSC를 내피세포로 분화

Seeding CD34+ Cells into Fluidic Chips

Seeding CD34+ Cells into Fluidic Chips  

To begin, centrifuge the isolated CD34-positive cells and resuspend the cell pellet in 300 microliters of pre-warmed SFM-34 medium that is supplemented with mixed 4 cytokines, and count the cells using 10 microliters of the cell suspension. After counting and resuspending the cells in a final volume of 150 microliters cytokine-supplemented SFM-34, add 0.5 microliters of ROCK inhibitor to it. Slowly aspirate the laminin from fluidic chips by placing the tip of a P200 pipette inside the reservoir on the edge of the channel.Then add the cell suspension into the channel consistently, ensuring no bubbles are formed. Incubate the chip overnight at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide to attach the cells to the channel completely. When the endothelial cells are fully attached, aspirate the medium as described previously.Add 200 microliters of cytokine-supplemented SFM-34 into the chip. Replace the medium daily until the cells reach 90 to 100%confluency.

CD34+ 세포를 유체 칩에 파종

Application of Continuous Flow to Endothelial Cells: Aorta-on-a-Chip

Install the perfusion set into the unit per the manufacturer's protocol. Inside a hood, attach an empty fluidic chip to it and add cytokine supplemented SFM-34 medium to fill both reservoirs under sterile conditions. Transfer the fluidic unit to the incubator, connecting it to the pump for bubble removal and calibration.Carefully remove the fluidic unit with the connected set from the incubator and transfer it into the hood along with the chips containing the cells. Clamp the tubing on both sides of the test chip. Remove the clamped tubing from the test chip and connect the chip containing the cells to the tubing.After removing or opening the clamps, transfer the system to the incubator and connect the air pump to the fluidic unit. Remove the fluidic unit from the pump and move it into the hood. Clamp the tubing on both sides of the chip and remove the tubing from the reservoirs on the chip.After gently removing the medium from the chip, Wash the cells with Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline or DPBS. Add 150 microliters of dissociation buffer and incubate for three minutes at 37 degrees Celsius. When the cells are detached, collect the dissociation buffer from one reservoir and wash the channel once with DPBS.Wash the reservoir with the washing buffer to collect the remaining cells from the chip. Finally, add one milliliter of washing buffer to the collected cells before using 10 microliters from it to count the cells. Before the stimulation, cells showed random orientation, but with stimulation, they reoriented parallel to the direction of the flow.CD34 expression profile of cells cultured under flow for five days and percentage of CD34 positive cells retrieved from the fluidic channel, showed the effectiveness of the protocol.