우리는 깨지기 쉬운 제브라피시 배아의 무제한 성장을 허용하는 동시에 완전히 고정 된 위치에 그들을 유지하는 시간 경과 이미징을위한 장착 방법을 개발했습니다. 이 마운팅 방법은 빠르고 쉽고 저렴하며 반전 된 현미경의 실험실 이미징에 적합합니다. 우리는 살아있는 제브라피시 배아의 화상 진찰을 위한 이 방법을 개발했습니다, 그러나 그밖 작은 수생 동물 모형의 화상 진찰을 위해 수정될 수 있었습니다.
성인 얼룩말 물고기를 사육하여 시작합니다. 오후에는 물고기를 사육 탱크에 넣고 1대 2의 남성 대 여성 비율로 사육합니다. 그런 다음 배아 매체에 1% 낮은 용융 아가로즈의 스톡 용액을 준비하고 전자 레인지에 가열하여 용해하십시오.
아가로즈 용액을 1.5 밀리리터 튜브로 알리쿼트합니다. 증류수에 4%트리카인의 스톡 솔루션을 만들고 아가로즈와 트리카인을 섭씨 4도에 보관하십시오. 트리카인은 독성이 있으며 연기 후드에 무게를 두고 준비해야합니다.
짝짓기 후, 페트리 접시에 E3에서 제브라피쉬 배아를 수확하고 장착하기 전에 약 28 시간 동안 섭씨 26.5도에서 배양하십시오. 0.02%의 트리카인으로 배아를 마취시키고, 조리온을 부드럽게 잡아당겨 배아를 방출함으로써 현미경으로 배아를 비코로 비우게 한다. 장착 직전에 아가로즈 용액을 섭씨 65도로 가열한 다음 약 30°C까지 식히면 배아가 열에 의해 손상되지 않도록 하고 아가로즈 용액에 트리카인을 추가하십시오.
숫자 제로 커버 글래스 바닥35 밀리미터 유리 바닥 접시를 사용합니다. 유리 파이펫이나 마이크로피펫으로 접시 의 바닥쪽으로 측면 중 하나를 가진 비반향 배아를 부드럽게 놓고 마이크로 피펫으로 남은 E3를 조심스럽게 제거합니다. 아가로즈가 작은 우물을 커버하지만 오버플로하지 않도록 배아를 커버하기 위해 접시의 바닥에 부착 된 커버 글래스에 의해 생성 된 작은 우물에 첫 번째 아가로즈 용액을 추가합니다.
커버글래스로 작은 우물을 덮어 두 개의 커버글래스 사이에 배아가 있는 좁은 아가로즈로 채워진 공간을 만듭니다. 커버글래스 의 상단에 1%아가로즈 용액층을 배치하여 커버글래스를 제자리에 고정시합니다. 그런 다음 0.02%의 트리카인을 함유한 E3로 접시의 나머지 부분을 채우고 시스템을 촉촉하게 유지합니다.
1층에 대한 최적의 아가로즈 농도를 식별하기 위해 아가로즈 농도증가에 배아를 장착하고 시간 경과 이미징을 수행하여 배아 왜곡과 운동성을 최소화하는 농도를 확인한 다음 결과에 따라 더 미세한 농도 범위를 테스트합니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 레이어 1에 대한 아가로즈의 최적 농도를 식별하는 것입니다. 0.030%0.032% 등 다양한 나노 농도를 테스트한다.
최적의 농도를 찾을 수 있습니다. 배아의 시간 경과 이미징을 수행하려면 최대 55시간 동안 섭씨 28.5도로 설정된 인큐베이터와 이미지를 사용하여 현미경 단계를 사용하십시오. 여러 배아를 동시에 이미지화하려면 여러 개의 접시를 담고 있는 스테이지 어댑터를 사용하여 배아가 수평으로 배치되도록 접시를 하나씩 회전시합니다.
낮은 배율 목표를 선택한 다음 접안렌즈를 사용하여 배아를 찾아 마지막으로 접시를 회전하여 수평으로 정렬합니다. 소프트웨어에서 배아의 위치를 기록하고 데이터를 자동 저장하기 위한 파일 이름을 만듭니다. 핀홀 크기를 설정하고 속도, 이미지 크기 및 확대/축소를 검사합니다.
그런 다음 이미지 캡처및 이미지형 채널을 캡처하기 위해 더 높은 배율을 선택합니다. 각 채널에 대해 레이저 전력과 검출기 고전압을 조정하여 포화를 피하고 사진 표백을 제한하면서 최상의 동적 범위를 수집합니다. 다음으로, 전체 배아를 10X 목표로 이미지화하기 위해 소프트웨어의 큰 이미지 캡처 설정을 설정하여 여러 시야 필드를 이미지화하고 배아의 위치를 조정하여 이 큰 이미지 영역에 맞는지 확인합니다.
원고 방향에 따라 Z 스택을 캡처하기 위한 설정을 구성합니다. 장기 경과 이미징 동안 여러 배아의 초점을 유지하기 위해 자동화 된 초점을 사용하고 참조 평면에 초점을 각 배아에 대한 개별 오프셋 수준을 조정하십시오. 그런 다음 현미경 소프트웨어의 시간 경과 매개 변수를 1시간 간격으로 55시간 동안 이미지화하도록 설정합니다.
각 주기마다 두 개의 배아 데이터 집합을 순차적으로 캡처하고 데이터를 자동으로 저장합니다. 현미경 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리합니다. 하나 이상의 배아가 이미지된 경우 이미징의 위치를 기반으로 데이터 집합을 분할하여 각 배아에 대해 독립적인 파일을 만듭니다.
최대 강도 투영 또는 유사한 도구를 사용하여 3D 시간 데이터 집합을 2D 시간 데이터 집합으로 변환합니다. 마지막으로 AVI로 저장하고 초당 5프레임의 재생 속도를 위해 200밀리초 간격으로 압축 옵션을 선택하여 동영상 파일을 만듭니다. 이 계층장착 방법을 사용하면 제브라피시 배아를 이미지화하는 동시에 성장을 허용하지만 움직임을 제한하는 동일한 방식으로 이미지를 만들 수 있습니다.
아가로즈 농도가 너무 높으면 배아가 왜곡됩니다. 그러나 너무 낮으면 시간 경과 현미경 검사중에 시야밖으로 이동합니다. 최적 아가로즈 농도는 혈관의 내피 세포에서 전체 배아및 GFP에서 RFP를 발현하는 0.028과 0.034%의 살아있는 형질제 제브라피쉬 사이인 것으로 나타났으며, 그 동안 55시간 동안 혈관간 혈관이 발아되고, 수피장 및 머리 혈관질이 개발되고, 골짜기 와 골병 이 형성되었다.
GFP와 운동 뉴런을 발현하는 배아는 운동 신경 발달을 시각화하기 위해 이미지화되었습니다. 운동 신경 축축은 배아의 복부 측을 향해 소니트 를 통해 복부 신경관에서 새싹. 세그먼트 간 혈관의 위치와 관련하여 모터 뉴런 축종의 등삼 발아의 공동 개발은 더 높은 배율을 사용하여 이미지화되었다.
이를 통해 신경관에서 발아되는 등쪽 축축뿐만 아니라 복부 축축발의 미세한 디테일을 시각화할 수 있게 되었습니다. 소미트 숫자가 증가함에 따라 솜릿도 길이와 너비로 확장됩니다. 이 과정은 근육에서 GFP를 표현하는 형질 전환 배아를 사용하여 이미지화되었다.
아가로즈의 최적 농도는 매우 좁기 때문에 아가로즈의 재고 용액을 준비할 때 측정의 작은 변화에 매우 민감하며 아가로즈 솔루션의 각 새로운 배치에 대해 재정의되어야 합니다. 이미지 크기와 해상도, 스캔 속도, 줌, 검출기 고전압 및 레이저 전력을 포함한 이미징 매개 변수를 신중하게 설정하여 실험 간의 일관성을 보장하고 장기간 경과 하는 동안 사진 독성 및 사진 표백 가능성을 줄이는 것이 중요합니다. 전 유기체의 연장된 시간 경과 화상 진찰에 선행된 형질 전환 제브라피시 배아를 위한 이 마운팅 방법을 사용하여, 우리는 다른 조직이 어떻게 함께 발전하는지 구상할 수 있습니다.
