이 프로토콜은 폴 마틴과 안토니오 하신토의 연구소와 시간 및 공동 작업을 통해 우리의 개발되었습니다. 우리는 플라이 라인을 공유하는 지속에 대한 훌륭한 서비스와 Drosophila 커뮤니티에 대한 블루밍턴 주식 센터 주셔서 감사합니다. BS는 현재 BBSRC 프로젝트 부여하여 자금이다. WW는 웰컴 트러스트 경력 개발 원정대에 의해 후원됩니다.

준비 <ol><li> hemocyte 특정 Gal4 드라이버 (예 : SRP - Gal4 2)와 UAS 통제 (예 : UAS - GFP)에서 유전자 인코딩 형광 기자를 포함하는 적절한 Drosophila 라인을 구합니다. SRP - Gal4, UAS - GMA 3 crq - Gal4, UAS - GFP 4, 5 homozygous 파리 이미징을 위해 (NB GMA가 moesin의 굴지 바인딩 도메인에 융합 GFP)을 특히 유용합니다;의 토론 아래 참조 Gal4 드라이버와 UAS의 범위가 (블루밍턴 증권 센터는 다양한 포함) 사용할 수 구성. </li><li> 일반적으로 유전 십자가는 그러한 것을 돌연변이 대립 유전자가 Gal4 드라이버 및 대체 상동 염색체에서 실시 UAS 구조와 형광 balancers CTG TTG 또는 6을 사용 균형 아르 실시하고 있습니다. 이것은 가능한 CTG / TTG - 관련 GFP 형광 (이것이 단계에서 이루어집니다 2.11)의 부재에 기초하여 homozygous 돌연변를 선택할 수 있습니다. </li><li> 사과 쥬스 한천 플레이트 7 누워있는 새장에 주식 및 장소 파리 증폭. 파리 충분 배아는 여유로운으로 시작하기 전에 누워있는 케이지에 순응하기 위해 최소한 이틀은 필요합니다. 일반적으로 각 성별 스무 파리 이미징 충분히 배아를 생성하기 위해 충분해야하지만, 그것은 다른 라인이 다산의 학위를 서로 다른 것을인지해야합니다. 우리는 공기 흐름을 허용하도록 바닥에 구멍을 플라스틱 비커의 바닥에 맞도록 55mm 페트리 요리를 사용합니다. 배아 모음의 정확한 의미는 중요하지만 타이밍이 배아를 개최 정확하게 수집하기 위해 중요합니다. </li><li> 25 ° C 또는 초과 접시에서 유지 하룻밤 사과 쥬스 한천 플레이트에서 배아를 수집합니다. 후자의 경우 우리는 일반적으로 파리는 접시를 제거하고 이전 배아의 장착에 15~16시간 18 ° C에서 그것을 배치하기 전에 4 시간 동안 미리 예열 접시에 누워 수 있도록,이 늦게 단계 12을 통해 배아를 제공합니다 개발의 15 단계. 하룻밤 접시 단계의 큰 다양성을 포함하지만, 25 시간의 긴 기간으로 인해 hemocytes에서 형광 리포터 표현의 높은 수준의 장점을 제공 ° C의 Gal4 - UAS 시스템으로 온도를 구분합니다. </li></ol> 절차 <ol><li> 물을 소량과 부드러운 밀고 페인트를 사용하여 사과 주스 한천 플레이트에서 배아를 이동시키다. Dislodged 태아는 육안으로 쉽게 볼 수 있습니다. </li><li> 셀 스트레이너 (피셔) 또는 집에서 만든 폐수를 수집하는 비커를 통해 개최되는 바구니에 사과 쥬스 한천 플레이트에서 물을 붓는하여 바구니 7.하는 배아를 전송 </li><li> 당신이 당신이 사과 쥬스 한천 플레이트의 양도 충분 배아를 만족할 때까지 단계 2.2를 반복합니다. </li><li> 물을 사용하여 셀 스트레이너 / 바구니에 배아를 씻으십시오. </li><li> 플레이스 셀 스트레이너 / 사과 주스 한천 플레이트의 페트리 접시 뚜껑에 바구니와 셀 스트레이너 / 바구니에 배아를 중지할 정도로 깔끔한 표백제를 추가합니다. </li><li> 브라이트 아래 해부 현미경에서 배아의 dechorionation를 따르십시오 dechorionation은 2 분 이내에 발생해야하는, 등의 부속 물에있을 때 완료됩니다. </li><li> 표백제에서 셀 스트레이너 / 바구니 포함하는 배아를 제거하고 물을 사용하여 잔류 표백제를 씻어. 표백제의 모든 흔적은 2.8 단계로 진행하기 전에 제거되어야합니다. 잔류 표백제 파란색이 분홍색 / 흰색 표백 수가있다면 - 모든 표백제가 제거되었는지 여부를 평가하는 하나의 트릭은 파란 색 실험실 조직에 잔류 물을 떨어져 얼룩하는 것입니다. </li><li> 셀 스트레이너 / 바구니의 아래쪽에 적용 실험실 조직 / mediwipes를 사용하여 남은 물을 내려 점이 되리. </li><li> 페트리 접시 뚜껑에 물을 비말를 놓습니다. 고급 페인트로 배아 바구니에서 모든 dechorionated 배아를 수집하고 비말에서 그들을 resuspend. 다음 micropipette를 사용하여 물을 aspirating하거나 신중 실험실 조직 / mediwipes 그것을 흡수하여 배아를 건조. </li><li> 배아가 건조되고 나면, 모든 배아를 충당하기 위해 voltalef 기름 한 방울을 추가합니다. 태아가 들어있는 비말에 인접한 기름의 두 번째 작은 방울을 넣어. NB 우리는 voltalef 기름의 영국 기반의 공급 업체를 찾을 수 없습니다되었습니다, 할로 카본 오일 700 (시그마)를 대신 사용할 수 있습니다. </li><li> 형광 해부 현미경에서 적절하게 기름 비말에서 시계 포셉 한 쌍의 (5 번)를 사용하여 원하는 유전자형의 배아를 개최 선택합니다. 이 집게는 vitelline 막을 펑쳐링없이 배아를 쓸어 담은하기 위해 구부러진 안쪽 (그림 1)되어야합니다. 두 번째 석유 비말로 선정 배아를 전송합니다. 당신은 공촛점 현미경 (그림 2)에 좋은 이미지를 수집할 수하기 위해 해부 현미경에 형광 hemocytes을 볼 수있는 것이 중요합니다. 우리는 일반적으로 복부 정중선 또는 단계 15 배아에서 hemocytes의 이미지 측면 마이 그 레이션 단계 14분의 13 배아를 탑재합니다이미지 배아를 통해 분산에 따라 hemocytes의 운동성를. </li><li> 그들 (그림 3) 사이에 약 1cm 떠나는 voltalef 오일 2 작은 방울을 사용하여 Petriperm / Lumox 요리 (Sarstedt)의 아래쪽 두 coverslips (18x18mm, 두께 1), 스틱, 이러한 이상 배치 coverslip을 지원하는 데 사용됩니다 배아은 너무으로 그들을 부수기 위해서는 없습니다. Petriperm 요리 (50mm 직경)는 소수성, 가스 투과 막가 포함되어 있습니다. 우리는 요리들이 (요리는 70 % 에탄올로 닦아하고 재사 용할 수 있습니다) 여러 번 사용되었습니다 일단 사용하기 쉽게 될 것을 압니다. </li><li> 해부 현미경에서 브라이트에서 벤트 포셉 및 회선 그들에게 복부 측면을 함께 선택 태아에게 하나씩 픽업 및 병렬 coverslips의 가장자리 (그림 3). 당신의 손재주와 인내에 따라이 방법으로 15 배아까지 정렬하는 것이 가능합니다. 배아 및 Petriperm 요리 막 모두되기 쉽게 파열 수 있듯이 그것은 부드럽게 배아를 조작하는 것이 중요합니다. </li><li> 일단 배아는 기름의 작은 방울을 추가하고 두 coverslips 사이에 동질적인 계층을 형성 확산하게 정렬됩니다. 기름 확산되면 (이것은 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다) 배아가 여전히 복부쪽에 있는지 확인하십시오. 배아 조금 압연있다면, 포셉와 함께 그들을 다시 변경합니다. </li><li> 마지막으로, 족집게 (번호 3) 장소 두 이전 준수 coverslips시 휴식 배아 통해 coverslip (18x18mm, 두께 1) 사용. 접착제 coverslip이 coverslip는 매니큐어를 (그림 3)를 사용하여 지원합니다. </li><li> 공촛점 또는 넓은 분야 현미경을 장착 태아와 Petriperm 요리를 가지고 적절한 어댑터를 사용하여 무대에서 Petriperm 요리를 탑재합니다. 직립하거나 거꾸로 현미경은 coverslip (로 세포막을 통해 반대)을 통해 초점을 목적 렌즈와 함께 사용할 수 있습니다 어느. </li></ol> 대표 결과 : 이 프로토콜은 배아의 복부 측면에 hemocytes 라이브 영상에 대한 Drosophila의 배아를 탑재하는 방법에 대해 설명합니다. 제대로한다면 그것은 hemocytes의 스틸이나 영화 중 하나를 생성하기 쉬운 것입니다. 주요 결정자 이미지 hemocytes를 (특정 목적 렌즈)에 사용되는 현미경이지만, 구입한 이미지의 특성도 개발 단계에 따라 달라집니다, 온도는 배아가에서 제기되고 Gal4와 UAS 라인 사용되었습니다. 형광 단백질의 표현보다 높은 수준 hemocytes가보다 편리하게 몇 군데있을 수있게, 따라서 그것은 태아의 프로토콜 (그림 2로 찍은 배아 이내에 취소 hemocytes의 예제를 포함의 단계 2.11에있을 때 hemocytes를 볼 수 있도록 중요합니다 카메라)는 해부 현미경에 장착되어. Gal4와 UAS 구조의 따라서 증가 숫자는 큰 신호 대 잡음 비율을 설정합니다. 또한 이것은 차례로 hemocyte 동작을 가능하게 영상은 시간의 긴 기간 동안 따라야 높은 레이저 농도 또는 증가 노출 시간에 대한 필요성을 줄여줍니다. GFP의 표현의 매우 높은 수준의 원형 세포 몸 (그림 4A - B)를 둘러싼 특히 얇은 시트 같은 lamellae을 hemocyte 형태의 세밀한 부분을 표시합니다. GFP를 제외 순환 지역 phagosomes를 (그림 4A - C) 나타냅니다. filopodia 같은 손가락도 lamellae (그림 4B)에서 새로운 모습을 볼 수 있습니다. 두 Gal4 드라이버가 하나 이상이 SRP - Gal4 특히 경우 (토론 참조) 이러한 프로세스 (그림 4C)을 볼 수있는 충분한 남아 있지만 공촛점 현미경에 느린 스캔 속도 이상의 레이저 전원이 필요할 수 있습니다. 표현의 수준 저하로 이미지 hemocytes의 라고나할까요를 더 어려워집니다, 그럼에도 불구하고 그것은 라고나할까요은 (그림 4D) 덜 명확한 경우에도 셀 몸이 분명 남아있는 이러한 조건 hemocytes의 마이 그 레이션을 추적 볼 수 있습니다. 개발의 초기 단계 (최대 13 단계)에서 hemocytes가 서로 가까이 접촉하는 마이 그 레이션하고 개별 세포를 구별하는 것이 어렵습니다. 무대의 말까지 13 hemocytes은 복부 정중선 (그림 5A) 아래 하나의 라인을 형성하고, 더 많은 운동성이있는지고, 복부 신경 코드 (그림 5B)의 가장자리에 옆으로 마이 그 레이션. hemocytes의 동적 라고나할까요 내에서 굴지의 cytoskeleton 직접 GMA (그림 5C) 또는 벚꽃 - moesin 표현을 통해 볼 수 있습니다. 이 방법으로 배아를 장착하면 가스 교환을 허용하고 탈수 방지와 태아가 가능한 다음 이미징 남아 있습니다. 배아는 배아 내용은 vitelline 막 통해 누출되므로 그것이 일반적으로 분명 설치하는 동안 손상된 경우. 배아는 다음 탈수 시작 않으면 이것은 종종 vitelline 막에 deformations하여 볼되어 있습니다. 가끔 배가 timelapse 영화의 과정 중에 롤 것입니다 그러나 이것은 더 이상 timescale 영화 문제가되는 경향이있다. LastlY는 한 번에 여러 배아를 장착하면 experimentalist들에게 실험을위한 완벽한 방향으로 배아를 얻는 최고의 기회를 제공합니다. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. dechorionated 배아의 조작을위한 포셉. 시계 포셉 (크기 번호 5)의 도움말은 패션을 위해 여기에 같이 배아를 치우도록 도구를 구부러진 안쪽에 있어야합니다. 그들이 소중히 배아를 수있는 더 날카로운 모서리를 가지고 있는것처럼 구부 러 지역의 외부 표면은 또한 Petriperm 막에 위치하면 배아를 조작하는 데 유용합니다. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 좋은 라이브 이미징 결과를 얻을 것입니다 배아 대표 이미지. voltalef 기름에 dechorionated 배아 (프로토콜의 무대 2.11에서)의 이미지는 형광등 해부 현미경에서 찍은. crq - Gal4, UAS - GFP의 배아, 스테이지 13 (A) 무대 15 일 (B) SRP - Gal4, UAS - GFP의 측면 전망. 무대 15 SRP - Gal4, UAS - GFP / +의 래터럴보기, crq - Gal4, uas-GFP/uas-N17Rac의 배아는 (C)하는 hemocytes 때 hemocytes 생겼는지 보여주는 태아의 머리를 밖으로 마이 그 레이션 실패 자신의 철새 경로를 따라 명확하지 않습니다. 개발 (D)이 단계에서 창자의 뒤얽힌 구조를 보여주는 crq - Gal4, UAS - GFP의 배아,, 무대 17 SRP - Gal4, UAS - GFP의 측면 볼 근육 수축의 증상이없는 태아의 라이브 영상을 방지 개발 단계. 단계 13 (E) 무대 14 복부 전망 (F) SRP - Gal4, 찬란 표시된 핵 함께 hemocytes의 분산을 보여주는 UAS - 레드 스팅거의 배아. 프로토콜의 무대 2.11에서 형광에 의해 hemocytes 관찰 우수한 이미지를 얻을 수있는 조건이며 앞쪽에 모든 이미지에 대한 권리입니다. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. Petriperm / Lumox 접시에 배아의 장착. 두 18x18mm coverslips (두께 1) 그림과 같이 약 1cm로 구분하여 기름의 작은 방울을 사용하여 Petriperm 요리의 하단 얼굴에 붙어있다. 배아는 다음 coverslips의 가장자리에 긴 (앞쪽에 - 후부) 축 평행와 복부 쪽을 줄지어 기름의 작은 방울로 덮여있다. 일단 기름 세 번째 coverslip (18x18mm 두께 1) 부드럽게 해결해되는 배아를 방지하기 위해 다리로 두 이전 준수 coverslips를 사용하여 석유 적용 배아의 상단에 위치 두 coverslips 사이의 간격을 채우기 위해 보급하고 있습니다. 이 coverslip 그 다음 매니큐어의 두 작은 방울을 사용하여 두 coverslip 다리에 붙어있다. 일단 설정 배아는 coverslip (로 Petriperm 막 통해 반대)을 통해 아래로 집중 목적 렌즈 직립하거나 거꾸로 현미경에 몇 군데 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. GFP 분류 hemocytes의 라이브 영상에서 대표 발생합니다. crq - Gal4, UAS - GFP의 배아 (AB), 무대 14 SRP - Gal4, UAS - GFP의 복부 측면에 hemocytes의 Z - 계획안. (A) timelapse 영화에 hemocyte 발달 마이 그 레이션을 모니터링하는 데 사용되는 같은 낮은 배율 이미지입니다. (B) 그들의 형태의 세밀한 부분을 보여주는, 배면의 정중선에서 hemocytes의 여전히 높은 배율입니다. (C) 무대 14 SRP - Gal4, UAS - GFP / +에서 복부 정중선에서 hemocytes의 단일 1m 슬라이스이며 crq - Gal4, UAS - GFP / + 배 (胚)가 공개되는 Gal4 드라이버와 UAS의 낮은 사본 번호 구조는 또한 좋은 이미지를 생성하기에 충분합니다. (D) 단계 14 crq - Gal4, UAS - GFP의 배아에서 hemocytes의 Z - 프로젝션을 표시합니다. 여기 hemocyte 라고나할까요 인해 GFP 낮은 표현 적은 분명 있지만 그것은 영화를 만들어 Gal4 드라이버와 UAS의 조합 구조와 hemocyte 마이 그 레이션을 추적 볼 수 있습니다. 이미지 Leica LSM510 공촛점 현미경에서 찍은 사진, 앞쪽에 모든 이미지에서이며 이미지의 주변에있는 반지는 vitelline 막 autofluorescence로 인해 발생합니다. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. GMA 표현 hemocytes의 라이브 영상에서 대표 발생합니다. 복부 단계 13 정중선 (A) 무대 14 hemocytes의 Z - 계획안 (B) SRP - Gal4, UAS - GMA의 배아는 hemocytes의 발달 마이 그 레이션을 보여주 timelapse 영화에서 가져온. 굴지 역학에 대한 자세한 정보는 GMA 표현 hemocytes (C)보다 높은 배율 영상으로 얻을 수 있습니다. GMA는 moesin 및 라벨 굴지의 필라멘트의 굴지 바인딩 도메인에 융합 GFP로 구성되어 있습니다. 앞의 모든 이미지에서이며 이미지가 공촛점 현미경에서 찍은.

<ol>
	<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PDGF/VEGF+receptor+controls+blood+cell+survival+in+Drosophila.">The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila.</a> Dev Cell. 7, 73-84 (2004).</li><li>Dutta, D., Bloor, J. W., Ruiz-Gomez, M., VijayRaghavan, K., Kiehart, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+morphogenetic+movements+in+Drosophila+using+Gal4-UAS-driven+expression+of+GFP+fused+to+the+actin-binding+domain+of+moesin.">Real-time imaging of morphogenetic movements in Drosophila using Gal4-UAS-driven expression of GFP fused to the actin-binding domain of moesin.</a> Genesis. 34, 146-151 (2002).</li><li>Stramer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+wound+inflammation+in+Drosophila+embryos+reveals+key+roles+for+small+GTPases+during+in+vivo+cell+migration.">Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration.</a> J Cell Biol. 168, 567-573 (2005).</li><li>Wood, W., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+embryonic+haemocytes:+masters+of+multitasking.">Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 542-551 (2007).</li><li>Halfon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+fluorescent+protein+reporters+for+use+with+the+Drosophila+Gal4+expression+system+and+for+vital+detection+of+balancer+chromosomes.">New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes.</a> Genesis. 34, 135-138 (2002).</li><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila protocols. , (2000).</li><li>Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origin+of+hemocytes+and+their+relationship+to+cell+death+in+Drosophila.">Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila.</a> Development. 120, 1829-1837 (1994).</li><li>Millard, T. H., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+filopodial+interactions+during+the+zippering+phase+of+Drosophila+dorsal+closure.">Dynamic analysis of filopodial interactions during the zippering phase of Drosophila dorsal closure.</a> Development. 135, 621-626 (2008).</li><li>Doerflinger, H., Benton, R., Shulman, J. M., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+PAR-1+in+regulating+the+polarised+microtubule+cytoskeleton+in+the+Drosophila+follicular+epithelium.">The role of PAR-1 in regulating the polarised microtubule cytoskeleton in the Drosophila follicular epithelium.</a> Development. 130, 3965-3975 (2003).</li><li>Olofsson, B., Page, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensation+of+the+central+nervous+system+in+embryonic+Drosophila+is+inhibited+by+blocking+hemocyte+migration+or+neural+activity.">Condensation of the central nervous system in embryonic Drosophila is inhibited by blocking hemocyte migration or neural activity.</a> Dev Biol. 279, 233-243 (2005).</li><li>Paladi, M., Tepass, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+Rho+GTPases+in+embryonic+blood+cell+migration+in+Drosophila.">Function of Rho GTPases in embryonic blood cell migration in Drosophila.</a> J Cell Sci. 117, 6313-6326 (2004).</li><li>Vlisidou, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+embryos+as+model+systems+for+monitoring+bacterial+infection+in+real+time.">Drosophila embryos as model systems for monitoring bacterial infection in real time.</a> PLoS Pathog. 5, e1000518-e1000518 (2009).</li><li>Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+actin-based+epithelial+adhesion+and+cell+matching+during+Drosophila+dorsal+closure.">Dynamic actin-based epithelial adhesion and cell matching during Drosophila dorsal closure.</a> Curr Biol. 10, 1420-1426 (2000).</li><li>Wood, W., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cell+movement+during+dorsal+closure+in+Drosophila+embryos.">Imaging cell movement during dorsal closure in Drosophila embryos.</a> Methods Mol Biol. 294, 203-210 (2005).</li><li>Kunwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tre1+GPCR+initiates+germ+cell+transepithelial+migration+by+regulating+Drosophila+melanogaster+E-cadherin.">Tre1 GPCR initiates germ cell transepithelial migration by regulating Drosophila melanogaster E-cadherin.</a> J Cell Biol. 183, 157-168 (2008).</li></ol>

이 절차의 가장 중요한 요소는 명확하게 표시된 hemocytes과 건강한 태아의 선택이며, 그들을 손상하지 않고 신중하게 그들을 마운트합니다. 배아는 할로 카본 오일에 일단 그들이 탈수에 강한 있으며, 한번 장착은 몇 시간 동안 몇 군데하실 수 있습니다. 우리의 손에 우리는 40X 목적으로 매 삼분의 자이스 혈구 LSM510 공촛점 현미경에 이미지의 Z - 스택을 복용 배아 또는 사진 손상 분명 무시할 수 탈?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352350</td>
<td>70&mu;m pores</td>
</tr>
<tr>
<td>Halcarbon oil 700</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H8898</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lumox/Petriperm dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>96077305</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations

사용하는 많은 연구 주소 셀 마이 그 레이션<em&gt; 체외에서</em&gt; 방법은 생리학 관련 환경 반면 유기체 자체이다. 여기서 우리는 장착의를위한 프로토콜을 제시<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; 배아 및 찬란 분류 hemocytes의 후속 라이브 영상이 유기체의 배아 macrophages. Gal4 - UAS 시스템을 사용<sup&gt; 1</sup&gt; 우리는 배아를 통해 자신의 발달 분산에 따라 hemocytes에서 유전자 인코딩, 찬란 태그 마커의 다양한 표현을 운전. 개발의 원하는 단계에서 배아의 다음 컬렉션, 바깥쪽 chorion이 제거되고 배아는 다음 소수성, 가스 투과 막과 라이브 영상을위한 유리 coverslip 사이 할로 카본 기름에 마운트됩니다. 같은 속도와 방향, F - 굴지와 microtubules이 cytoskeletal 구성 요소의 역학에 관한 자세한 정보를 제공할 수의 형광 기자의 사용과 함께 높은 해상도의 영상으로 총 철새 매개 변수 이외에.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations at JoVE.com

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

live-imaging-of-drosophila-melanogaster-embryonic-hemocyte-migrations

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

15.6K 조회수.  University of Bath. Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

비디오: Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Drosophila Melanogaster에서 애벌레 CNS의 해부

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

연구

생물학

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

성인에서 Oenocytes의 해부 Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

의 분리 Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

개별 준비 Drosophila</em라이브 이미징을위한> 계란 회의소

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

에 GFP-라벨 단백질의 영상을 라​​이브<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocytes

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

의 수명 측정<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

의 번데기 케이스를 통해서 영상<em&gt; 초파리</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...