Ernst H. K. Stelzer'e, kaynaklarını kullanma fırsatının yanı sıra el yazması ile ilgili değerli yorumları için, Tribolium canlı görüntüleme desteği için Anita Anderl'e, teknik destek için Sven Plath'a ve Bloomington Stock Center aracılığıyla transgenik Drosophila hatlarını paylaştıkları için Ilan Davis, Nicole Grieder ve Gerold Schubiger'e teşekkür ederiz.

1. Hazırlık çalışmaları
<ol><li>LSFM için bilimsel soruya uygun bir aydınlatma lensi/algılama lensi/kamera kombinasyonu seçin ve mikroskobu ayarlayın. Görüş alanının boyutu, kamera yongası boyutunun bölümü ve algılama lensinin büyüttürüdür. Aydınlatma lensi seçilmelidir, böylece tüm görüş alanı kabaca düzlemsal bir ışık levhası ile kaplanır34. Önerilen üç kombinasyon Tablo 1'de listelenmiştir.</li>
	<li>Agarose aliquots ve alma yemekleri hazırlamak için, 200 mL otomatik kapalı musluk suyuna 2 g düşük eriyik agarose ekleyin ve karışımı tüm agarose parçacıkları çözünene kadar mikrodalga fırında 600-800 W'da ısıtın. 1,5 mL veya 2 mL reaksiyon tüplerinde birkaç 1 mL agarose aliquot hazırlayın, ardından 3-5 mm yüksekliğinde birkaç 90 mm Ø Petri kabını agarose ile doldurun. Katılaştırılmış aliquots ve yemekleri 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Drosophilaiçin : Taze yetiştirme şişeleri hazırlamak için, yeterli miktarda özel yapım veya ticari olarak mevcut Drosophila ortamını pişirin, 5-15 mL'yi geniş şişelere aktarın ve 4 ° C'de saklayın. Yumurtlama yemekleri hazırlamak için, 50 mL otomatik kapatılmış musluk suyuna 1 g düşük eriyik agarose ekleyin ve karışımı tüm agarose parçacıkları çözünene kadar mikrodalga fırında 600-800 W'da ısıtın. Karışımın 45 °C'ye kadar soğumasını bekleyin, ardından 50 mL meyve suyu (tercihen elma veya kırmızı üzüm) ekleyin ve iyice karıştırın. Karışımı 35 mm Ø Petri kaplarına dökün ve katılaşmış yumurtlama kaplarını 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Triboliumiçin : Büyüme ortamını hazırlamak için, tam buğday ununun yanı sıra aktif olmayan kuru mayayı 710 μm örgü büyüklüğünde bir elekten geçirin, ardından elenmiş unu% 5 (w / w) elenmiş maya ile tamamlayın. Yumurtlama ortamını hazırlamak için, ince buğday ununun yanı sıra aktif olmayan kuru mayayı 250 μm örgü büyüklüğünde bir elekten geçirin, ardından elenmiş unu% 5 (w / w) elenmiş maya ile tamamlayın.</li>
</ol>2. Floresan mikroküreçler kullanılarak numune odası bazlı LSFM'lerin kalibrasyonu
NOT: Kalibrasyonun amacı, aydınlatma ve algılama lenslerinin odak noktalarını hizalamaktır (Şekil 2A), net görüntüler için öncüldür. LSFM'ler düzenli olarak, en az 3-4 haftada bir kalibre edilmelidir.
<ol><li>Bir agarose aliquot'u 80 °C'de kuru blok ısıtıcı / karıştırıcıda yeniden sıvılandır, ardından agarose aliquot'un 35 ° C'ye kadar soğumasını bekleyin.</li>
	<li>50 μL agarose'yi 1,5 mL reaksiyon tüpüne aktarın ve 0,5 μL floresan mikrokürez çözeltisi ekleyin. 1 dakika boyunca 1.400 rpm'de karıştırın.</li>
	<li>Örümcek ağı tutucusunun oluklu deliğini 10 μL agarose / floresan mikrokürez çözeltisi karışımı ile doldurun, ardından sadece ince bir agarose filmi kalana kadar mümkün olduğunca çok agarose emiş edin. Katılaşma için 30-60 s bekleyin.</li>
	<li>Numune haznesini otomatik kapatılmış musluk suyu ile doldurun. Örümcek ağı tutucusunu yavaşça numune odasına yerleştirin ve oluklu deliği algılama lensinin önündeki mikrotransilasyon aşamalarıyla hareket ettinin.</li>
	<li>Örümcek ağı tutucusunu döndürme aşamasıyla aydınlatma (x) ve algılama (z) eksenlerine göre 45° konuma getirin. Örümcek ağı tutucusu iletim ışığı kanalında görünmemelidir.</li>
	<li>İlgili floresan kanalına geçin ve lazer gücünü ve pozlama süresini floresan mikrokürecilerin uygun sinyali sağlaması için ayarlayın.</li>
	<li>Şimdi enine yönelimli agarose filmini tamamen kapsayan bir görüş hacmi belirtin. İlgili aydınlatma lensi/algılama lens kombinasyonu34için mümkün olan maksimum eksenel çözünürlüğü hesaplayarak z aralığını tanımlayın. Alternatif olarak, yanal çözünürlüğün 4 katı kaba bir yaklaşım olarak kullanılabilir.</li>
	<li>Floresan mikrokürelerin üç boyutlu test z yığınını kaydedin ve x, y ve z maksimum projeksiyonlarını kalibrasyon grafiğiyle karşılaştırın (Şekil 2). Mikroküreler bulanık, bulanık ve/veya bozuk görünüyorsa (Şekil 2B,C), aydınlatma ve/veya algılama lensinin konumlarını ayarlayın.</li>
</ol>3. Drosophila embriyolarının toplanması
<ol><li>Drosophila serisinin 100-200 yetişkinini, bir yumurta toplama kültürü oluşturmak için görüntüleme testten 2-3 gün önce taze bir yetiştirme şişesine aktarın. Henüz mevcut değilse, bir soy kültürü başlatmak için eski yetiştirme şişesini kullanmayı düşünün. Yetişkinlerin en fazla iki haftalık olmasını sağlamak için embriyo toplama kültürünü zamanla soy kültürü ile değiştirin.</li>
	<li>Bir yumurtlama kabını oda sıcaklığına ısıtın ve agarın üzerine bir damla maya ezmesi ekleyin.</li>
	<li>Yetişkinleri yumurta toplama kültüründen boş bir dar şişeye aktarın ve yumurtlama kabının üzerine yerleştirin. Yumurta toplama kurulumunu oda sıcaklığında 15 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Mümkünse bu adım sırasında anesteziden (soğuk, CO2)kaçının.</li>
	<li>Yetişkinleri yetiştirme şişesine geri döndürün. Yumurtlama kabını uygun bir sıcaklık / zaman kombinasyonunda kuluçkaya yatırın, ardından yumurta döşeme kabından küçük bir boya fırçası ile 10-20 embriyoyu 100 μm örgü büyüklüğünde bir hücre süzgecine aktarın. Yumurtlama kabını atın.</li>
	<li>Her Drosophila satırı için 3,1 ile 3,4 olan adımları yineleyin.</li>
</ol>4. Tribolium embriyolarının toplanması
NOT: Kolaylık sağlamak için, tribolium yumurta toplama prosedürünün bir şeması sağlanmaktadır (Şekil 3A) bu adımdaki braketlerdeki sayıların da atıfta bulunduğu.
<ol><li>Tribolium hattının 200-300 yetişkinini (yaklaşık 400-700 mg) bir yumurta toplama kültürü oluşturmak için görüntüleme testten 2-10 gün önce boş bir 1 L cam şişeye aktarın(Şekil 3A_01). Şişeyi 50-100 g taze büyüme ortamı ile doldurun. Henüz mevcut değilse, mevcut larvaları ve pupaları kullanarak bir soy kültürü başlatmayı düşünün. Yetişkinlerin en fazla 3 aylık olmasını sağlamak için, yumurta toplama kültürünü zamanla soy kültürü ile değiştirin.</li>
	<li>Yumurta toplama kültürünü 800 μm örgü boyutunda bir elekten geçirin(Şekil 3A_02). Sahnelenmemiş embriyolar içeren büyüme ortamını ilk şişeye(Şekil 3A_03)iade edin ve yetişkinleri boş bir 1 L cam şişeye aktarın (Şekil 3A_04). 10 g yumurtlama ortamı ekleyin (Şekil 3A_05) ve yumurta toplama kurulumunu oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın (Şekil 3A_06,07).</li>
	<li>Yumurta toplama kurulumunu 800 μm örgü boyutu elekten geçirin(Şekil 3A_08). Yetişkinleri ilk şişelerine geri döndürün (Şekil 3A_09). Görüntülenecek gelişimsel sürece bağlı olarak, şu anda yaklaşık 30-100 embriyo içeren yumurtlama ortamını uygun bir sıcaklık / zaman kombinasyonunda kuluçkayayatırın(Şekil 3A_10 ).</li>
	<li>Yumurtlama ortamını 300 μm örgü boyutunda elekten geçirin (Şekil 3A_11) ve embriyoları (Şekil 3A_12) 100 μm örgü büyüklüğünde bir hücre süzgecine aktarın. Elenmiş yumurtlama medyasını atın (Şekil 3A_13).</li>
	<li>Her Tribolium hattı için 4,1 ile 4,4 olan adımları yineleyin.</li>
</ol>5. Sodyum hipoklorit bazlı dekonsiyon
NOT: Hem Drosophila hem de Tribolium embriyoları, embriyolar çıkarıldıktan sonra nemli tutulduğu sürece uygun gelişim için gerekli olmayan koruyucu ve ağır ışık saçan bir protein tabakası olan bir koroyon ile kaplıdır. Her iki türün embriyoları için dekonsiyon protokolü aynıdır.
<ol><li>A1, A2, A3 ve B3 kuyularını 8 mL otoklavlı musluk suyu ve B1 ve B2 kuyularını 7 mL otoklavlı musluk suyu ve 1 mL sodyum hipoklorit (NaOCl) çözeltisi ile doldurarak 6 kuyulu bir plaka hazırlayın (Şekil 3B). İzlenme sürecini stereo mikroskop altında, ideal olarak iletim ışığında gözlemleyin. DİkKAT: Sodyum hipoklorit aşındırıcıdır.</li>
	<li>Embriyo içeren hücre süzgecini (Adım 3.4 ve/veya 4.4) A1 kuyusuna yerleştirin ve embriyoları hafif ajitasyon altında yaklaşık 30-60 s yıkayın.</li>
	<li>Hücre süzgecini B1 kuyusuna taşıyın ve plakaları 30 s boyunca kuvvetlice sallayın, ardından A2 kuyusuna aktarın ve embriyoları hafif ajitasyon altında 1 dakika yıkayın.</li>
	<li>Hücre süzgecini B2 kuyusuna taşıyın ve çoğu embriyo tamamen dekonsiyon olana kadar plakayı kuvvetlice sallayın (Şekil 3C), daha sonra A3 kuyusuna aktarın ve embriyoları nazik ajitasyon altında 1 dakika yıkayın.</li>
	<li>Montaj prosedürüne devam etmeden önce hücre süzgecini B3'te saklayın.</li>
	<li>Her satır için 5,1 ile 5,5 olan adımları yineleyin.</li>
</ol>6. Örümcek ağı tutucusu kullanılarak birden fazla embriyonun montajı
<ol><li>Bir agarose aliquot'u 80 °C'de kuru blok ısıtıcı / karıştırıcıda yeniden sıvılandır, ardından agarose aliquot'un 35 ° C'ye kadar soğumasını bekleyin.</li>
	<li>Örümcek ağı tutucusunun oluklu deliğinin üzerine pipet 10 μL agarose. Pipet ucuyla, agarose'yi oluklu deliğin üzerine yayın, ardından sadece ince bir agarose filmi kalana kadar mümkün olduğunca agarose epire edin. Katılaşma için 30-60 s bekleyin.</li>
	<li>Her satır için, küçük bir boya fırçası ile bir veya daha fazla embriyoyu dikkatlice seçin ve agarose filmine yerleştirin.</li>
	<li>Embriyoları oluklu deliğin uzun ekseni boyunca düzenleyin, ardından ön-arka eksenlerini oluklu deliğin uzun ekseniyle hizalayın (Şekil 3D).</li>
	<li>Embriyolar ve agarose filmi arasındaki boşluğa 1-2 μL agarose pipetleyerek embriyoları dikkatlice stabilize edin. Katılaşma için 30-60 s bekleyin.</li>
	<li>Monte edilmiş embriyoları olan örümcek ağı tutucusunu yavaşça görüntü tampon dolu numune odasına yerleştirin.</li>
</ol>7. Örnek oda bazlı LSFM'lerde karşılaştırmalı canlı görüntüleme
<ol><li>Mikrotransilasyon aşamaları olan embriyolardan birini algılama merceği önünde hareket ettirin. Örümcek ağı tutucusuna aydınlatma (x) ve algılama (z) eksenlerine (cf. Şekil 1C)göre 45° konumda olduğundan emin olun.</li>
	<li>İletim ışığı kanalında embriyoyu görüş alanının ortasına taşıyın. Örümcek ağı tutucusu görünmemelidir.</li>
	<li>Embriyonun orta düzlemi odak düzlemi ile örtüşünceye kadar, yani ana hat keskin görünene kadar, mikrotransilasyon aşamaları ile embriyoyu z içinde hareket ettirin. Floresan kanalına geçmeden, orta düzlemden 250 μm uzağa her iki yöne de hareket ettirerek görüş hacmini belirtin.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, birden fazla yönde görüntüleme gerekiyorsa, embriyoyu uygun şekilde döndürün ve 7.2 ve 7.3 adımlarını tekrarlayın. Örümcek ağı tutucusu 90° adımlarda dört oryantasyona kadar destekler.</li>
	<li>Örümcek ağı tutucusuna monte edilen diğer tüm embriyolar için 7,1 ila 7,3 (veya 7,4) adımlarını yineleyin (Şekil 3E). En alttaki embriyo algılama merceği önündeyken en üstteki embriyonun görüntüleme tamponundan ayrılmadığından emin olun.</li>
	<li>Floresan kanal (lazer gücü, pozlama süresi, algılama filtresi) ve zaman atlamalı (aralık, toplam süre) parametreleri tanımlayın ve görüntüleme işlemini başlatın. Gösterge değerleri için, örnek veri kümelerinin meta veri tablosuna başvurun (Tamamlayıcı Tablo 1). Birkaç gün süren tahliller için, buharlaşmayı azaltmak için numune odası açıklığı en azından kısmen kapatmayı düşünün.</li>
</ol>8. Görüntülenmiş embriyoların geri alınması ve daha fazla yetiştirilmesi
<ol><li>Görüntüleme tahlili sona erdiğinde, örümcek ağı tutucusunu numune odasından dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>Embriyoları agarose filminden küçük bir boya fırçasıyla ayırın ve uygun şekilde etiketlenmiş bir mikroskop kaydırağı ile aktarın. Slaydı bir alma kabına yerleştirin ve ilgili standart yetiştirme koşulları altında kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Deneysel yöntemlerle ilgili olarak, embriyogenezin ne zaman tamamlandığını tahmin edin. Kuluçka zaman noktası yaklaştıkça, alma yemeklerini sık sık kontrol edin ve yumurtadan çıkan Drosophila larvalarını bireysel yetiştirme şişelerine ve Tribolium larvalarını 24 kuyulu bir plakanın bireysel kuyularına aktarın. Kuyuları yarıya kadar büyüme ortamı ile doldurun. İlgili standart yetiştirme koşulları altında kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Gözlemlenen bireyler yetişkin olduktan sonra, onlara uygun bir çiftleşme ortağı sağlayın ve birkaç gün sonra soyları kontrol edin.</li>
</ol>9. Görüntü veri işleme ve meta veri belgeleri
NOT: Görüntü veri işleme için ImageJ türevi FIJI35 önerilir (imagej.net/Fiji/Downloads). FIJI kurulum gerektirmez ve 32 ve 64 bit sürümleri mevcuttur. LSFM verileri için en sık kullanılan biçimlerden biri, görüntü yığınlarının TIFF kapsayıcısı şeklinde depolanmasını sağlayan etiketli görüntü dosyası biçimidir (TIFF).
<ol><li>Tüm z yığınları için z maksimum projeksiyonlarını hesaplama (Resim | Yığınlar | Z Projesi, Maksimum Yoğunluk 'useçin. Maksimum projeksiyonlar, uzamsal boyut sayısını üçten ikiye düşüren veri basitleştirme yaklaşımlarıdır. Toplu işleme için bir FIJI komut dosyası sağlanır (Tamamlayıcı Dosya 1).</li>
	<li>Zaman yığınları (t yığınları) oluşturmak için ilgili z maksimum projeksiyonlarını bir araya getirmek. Bunları tek bir TIFF kapsayıcısında kaydedin. Bunu tüm kayıtlı embriyoların yanı sıra varsa ilgili yönler ve floresan kanalları için yapın.</li>
	<li>Embriyoların ön-arka eksenini x veya y görüntü ekseniyle hizalamak için z ekseninin etrafında z ve t yığınını döndürün (Görüntü | | Dönüştür Döndür). Üç görüntü ekseni boyunca z yığınlarını ve x ve y görüntü eksenlerindeki t yığınını kırpın, böylece embriyonun etrafında yalnızca minimum tampon alanı (x ve y eksenleri boyunca 20-40 piksel, z ekseni boyunca 5-10 görüntü) kalır (Görüntü | | ayarlama x ve y eksenleri için Tuval Boyutu, Görüntü | Yığınlar | Araçlar | z ekseni için Dilim Koruyucu).<ol>
<li>Varsa, tüm kayıtlı embriyolar ve ilgili yönler için bunu ayrı ayrı yapın. Varsa floresan kanalları aynı döndürme ve kırpma parametreleri ile işlenmelidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Meta verileri mümkün olduğunca ayrıntılı olarak belgele. Kılavuz olarak, Temsili Sonuçlar bölümünde yer alan örnek veri kümelerinin meta veri tablosu kullanılabilir (Tamamlayıcı Tablo 1).</li>
</ol>10. Veri görselleştirme
NOT: Bu veri görselleştirme kılavuzu öncelikle birden fazla yön boyunca ve/veya zaman içinde kaydedilmiş birkaç embriyoyu gösteren z maksimum projeksiyon görüntü matrislerinin oluşturulmasına odaklanmaktadır. Aşağıdaki adımlarda, Temsili Sonuçlar bölümünde gösterilen şekillerin ve bağlı videoların oluşturulması için örnek veri kümelerine uygulanan veri görselleştirme yordamı açıklanmaktadır.
<ol><li>Birden çok yön yığınını birleştirme (Resim | Yığınlar | Araçlar | Birden fazla floresan kanallarını birleştirme ve/veya birleştirme (Resim | Renk | Kanalları Birleştir) biyolojik yapıyı ve/veya ilgi sürecini görselleştirmek için.</li>
	<li>T yığınlarının yoğunluklarını ayarlama (Resim | | ayarlama Parlaklık/Kontrast) "Set" işlevini kullanarak gerektiği gibi. Görüntülenen minimum değer arka plan sinyalinin biraz üzerinde ayarlanmalıdır, görüntülenen maksimum değer uygun bir kontrastla sonuçlanmalıdır. İlgili z yığınlarının tutarlı bir şekilde ayarlanmasında kullanılabilecekleri için her iki değeri de belgeleyin. "Uygula" işlevini kullanarak baskı ayarlamaları. Deneysel modalitelere bağlı olarak, kaydedilen tüm embriyoları aynı değerlerde işlemeyi düşünün.</li>
	<li>Yoğunluk ayarlı t yığınlarını ayrı dosyalar olarak kaydedin, ayarlanmamış t yığınlarını geçersiz kılmayın. Özel görüntü seçim işlevleriyle ayarlanmış t yığınlarından uygun alt yığınları derleyin (ör. Görüntü | Yığınlar | Araçlar | Dilim Koruyucu) ve montaj aracını kullanın (Resim | Yığınlar | Make Montage) şekil tasarımı için kullanılabilecek görüntü ızgaraları oluşturmak için kullanılır.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

LSFM'lerin münhasır uygulama alanlarından biri gelişimsel biyolojidir. Bu disiplinde, canlı örneklere bakmak önemlidir, aksi takdirde morfogenetik süreçler dinamik bir şekilde tarif edilemez. Örnek oda bazlı LSFM'lerde eşzamanlı canlı görüntüleme için deneysel bir çerçeve, burada açıklandığı gibi, iki ana nedenden dolayı uygundur.
Sıralı canlı görüntülemede kaçınılmaz olan ortam varyansı pro-aktif olarak ele alınabiliyor. Böcek embriyosu ile ilişkili can...

Floresan mikroskopi, yaşam bilimlerinde, özellikle hücre ve gelişim biyolojisinde en temel görüntüleme tekniklerinden biridir. 1990'larınortalarından beri üç boyutlu floresan görüntüleme için son teknoloji ürünü olan konfokal floresan mikroskoplar 1'de, florofor ekscitasyonu ve emisyon ışığı algılama için aynı lens kullanılır. Aydınlatma lazer ışını, aydınlatma/algılama ekseni boyunca tüm floroforları heyecanlandırır ve ilgili odak dışı sinyal bir iğne deliği tarafından algılanmadan önce ayırt edilir. Bu nedenle, her iki boyutlu görüntü için, tüm örnek aydınlatılır. Sonuç olarak, her üç boyutlu görüntü için, yani, mekansal olarak ardışık iki boyutlu görüntüler yığını, tüm örnek birkaç düzine ila birkaç yüz kez aydınlatılır2, bu da fotobleaching ve fototoksikliği teşvik eder3.
Neredeyse yirmi yıl önce, ışık tabakası tabanlı teknoloji4, üç boyutlu floresan görüntüleme için umut verici bir alternatif olarak ortaya çıktı ve böylece gelişim biyolojisinde değerli bir araç haline geldi5. Bu yaklaşımda aydınlatma ve algılama ayrılmıştır. Aydınlatma lensi, dik olarak düzenlenmiş algılama lensinin odak düzleminde sadece birkaç mikrometre derinliğe sahip bir ışık tabakası oluşturmak için kullanılır. Bu nedenle, her iki boyutlu görüntü için, odak düzleminin etrafında yalnızca ince bir düzlemsel hacim yanar. Sonuç olarak, her üç boyutlu görüntü için, tüm örnek sadece bir kez aydınlatılır, bu da fotobleaching ve fototoksikliği kuvvetle azaltır6. Bu nedenle, ışık tabakası floresan mikroskopları (LSFM'ler) karmaşık süreçleri biyolojik olarak ilgili birden fazla ölçekte incelemek için etkili çözümler sunar ve bu nedenle, birkaç milimetre kadar büyük örneklerin hücre altı düzeyde analiz edilmesi gereken gelişim biyolojisinde özel bir değere sahiptir.
Tarihsel olarak, LSFM'ler örnek oda bazlıolmuştur 7,8. Bu kurulumlarda, aydınlatma (x) ve algılama (z) eksenleri genellikle yerçekimi eksenine (y) dik olarak düzenlenir. Örnek odalar geniş deneysel özgürlük sunar. İlk olarak, çevreyi kontrol etmek için, örneğin belirli bir sıcaklık9'u korumak veya biyokimyasal stresörler uygulamak için bir perfüzyon sisteminin kullanımını kolaylaştıran büyük görüntüleme tampon kapasiteleri sağlarlar. Ayrıca, numunenin üç boyutlu, bazı durumlarda dinamik11 , bütünlüğünü korurken ilgili deneysel ihtiyaçlara göre uyarlanmış özelleştirilmiş montaj yöntemleri10'udesteklerler. Ek olarak, numune odası tabanlı kurulumlar genellikle numuneleri y ekseni etrafında döndürmek ve böylece iki, dört veya daha fazla yön boyunca görüntülemek için kullanılan bir döndürme işlevi ile donatılmıştır. Yaygın olarak kullanılan model organizmaların embriyoları mikroskopi bağlamında, ventral-dorsal, lateral ve/veya ön-arka vücut eksenleri boyunca nispeten büyük, ardışık görüntüleme daha kapsamlı bir temsil sağlar. Bu, örneğin, karmaşık üç boyutlu geçiş yolları12,13boyunca hareket eden hücrelerin uzun süreliizlenmesinisağlar.
Işık tabakası bazlı floresan mikroskopi, Drosophila melanogasterembriyonik morfogenezini incelemek için hem sistematik olarak14,15 hem de gelişimin biyofizik yönlerine özel bir odakla kapsamlı bir şekilde uygulanmıştır. Örneğin, mikrop bandı uzaması16 ve daha fazla sırasında endoderm invaginasyonu ile eksen uzantısı arasında biyomekanik bir bağlantı tespit etmek için yüksek çözünürlüklü morfogenetik verileri toplamak için kullanıldı, karmaşık hücresel akışı gastrülasyon sırasında kuvvet oluşturma desenleri ile ilişkilendirmek için17. Ayrıca, epidermis18'dekiön-arka desenleme sırasında Wnt sinyalinin düzenlenmesini araştırmak için optogenetik gibi diğer son teknoloji tekniklerle birleştirilmiştir.
Bununla birlikte, sadece bir türü incelemek, gelişimin evrimi hakkında fikir vermez. Filogenetik bağlamda embriyogenez anlamak için alternatif böcek modeli organizmalarla yoğun araştırmalar yapılmıştır. En kapsamlı olarak araştırılan türlerden biri kırmızı un böceği Tribolium castaneum, ekonomik olarak ilgili bir depolanmış tahıl zararlısı19Embriyonik morfogenez de LSFM20ile sistematik olarak görüntülenmiştir. Bu iki türün embriyonik morfogenezleri, segmentasyon modu21gibi çeşitli yönlerden ve ekstra embriyonik membranların oluşumu ve bozulması22. İkinci yön zaten LSFM'ler kullanılarak kapsamlı bir şekilde analiz edilmiştir. Örneğin, Tribolium embriyosunu embriyogenezinin daha iyi kısmı için çeşitli tehlikelerden koruyan ekstra embriyonik bir doku olan serosanın23,24, ayrıca dorsal kapatma sırasında kendi çekilme işlemi için morfogenetik "sürücü" görevi aldığı gösterilmiştir25. Ayrıca, gastrülasyon sırasında, blastoderm'in belirli bir bölgesinin asimetrik doku hareketleri oluşturmak için vitellin zarı bağlı kaldığı gösterilmiştir26 ve bu gözlemin ardından, bölgeselleştirilmiş doku akışkanlaştırması, hücrelerin serosa pencere kapanması sırasında sırayla serosa kenarından ayrılmasına izin verir27.
Yukarıda belirtilen tüm Drosophila- ve Triboliumile ilişkili çalışmalarda, örnek oda bazlı LSFM'ler kullanılmıştır. Çoğu zaman, embriyolar örnek dönüş fonksiyonu kullanılarak birden fazla yönde kaydedildi. Açıkça belirtilmemiş olsa da, Tribolium20,28'deki önceki çalışmalarımıza benzer şekilde, sıralı canlı görüntüleme testlerinde tek tek ve böylece birbirlerinden bağımsız olarak kaydedildikleri varsayılabilir. Bazı senaryolarda, böyle bir yaklaşım kabul edilebilir, ancak özellikle nicel karşılaştırmalı yaklaşımlarda ortam varyansı sonuçları bozabilir. Örneğin, böceklerin gelişim hızının sıcaklığa bağlı olduğu uzun zamandır bilinmektedir29, ancak daha yeni bir çalışma drosophila'da sıcaklığın morfojenlerin konsantrasyonu30' u da etkileyebileceğini göstermektedir. Sonuç olarak, embriyogenezin belirli özellikleri, örneğin hücrelerin dinamik oranları, bölünme oranları ve göç hızları tam olarak ölçülmelidir, ortam varyansı olmadan yeterli tekrarlar gereklidir. Bu, standart sapmaları ve standart hataları en aza indirir, bu da diğer, hatta marjinal olarak farklı deneysel koşullarla yan yana gelmeyi kolaylaştırır.
Ancak, örnek oda tabanlı LSFM'ler öncelikle yüksek aktarım hızı tahlilleri yerine yüksek içerik için tasarlanmıştır. Tipik olarak mikroskopi slaytları, Petri kapları ve kuyu plakaları için standart kelepçe mekanizmaları ile donatılmış konfokal mikroskopların aksine, neredeyse tüm numune odası tabanlı LSFM'ler silindir bazlı kelepçe mekanizmaları kullanır. Bu mekanizmalar, rotasyon uyumlu ve invaziv olmayan10olan özel yapım numune tutucular için tasarlanmıştır, ancak genellikle birden fazla örnek20,31,32için tasarlanmamıştır. Örnek oda bazlı kurulumların avantajlarından ödün verilmeyen iki veya daha fazla embriyonun eşzamanlı canlı görüntülenmesi için bir çerçeve, ortam farkı sorununu ele alarak karşılaştırmalı çalışmalar için LSFM'lerin değerini artırır.
Protokolümüzde, embriyoları "istiflemek" için bir seçenek olarak y ekseninin kullanıldığı örnek oda bazlı LSFM'lerde (Şekil 1A)karşılaştırmalı canlı görüntüleme için deneysel bir çerçeve sunuyoruz. İlk olarak, özellikle kalibrasyon asistanı olmayan cihazlar için önemli olan numune odası tabanlı LSFM'ler için floresan mikrokürez bazlı kalibrasyon kılavuzu sunuyoruz. İkinci olarak, örümcek ağı tutucusu28 'e (Şekil 1B) dayanan ve numune rotasyonu ile uyumlu olan ve böylece birden fazla numunenin birden fazla yönde eşzamanlı görüntülenmesine izin veren birden fazla embriyo için bir montaj yöntemi açıklıyoruz (Şekil 1C). Birkaç embriyo ince bir agarose filminin üzerine hizalanır ve örnek odaya yerleştirildikten sonra, üç boyutlu görüntüler elde etmek için ışık tabakasında art arda hareket eder. Üçüncü olarak, Drosophila ve Triboliumiçin üç örnek canlı görüntüleme veri kümesi sunuyoruz. İlki için, transgenik çizgileri floresan etiketli çekirdeklerle yan yana alıyoruz. İkincisi için, aynı transgeneyi taşıyan transgene, ancak farklı genomik konumlarda transgene alt çizgilerinin performansını karşılaştırıyoruz. Son olarak, karşılaştırmalı canlı görüntüleme ve ortam varyansı ile paralelleşmenin önemini tartışıyoruz33Deneysel çerçevemizin aktarım hızı sınırını tartışıyor ve yaklaşımımızın diğer model organizmalara adaptasyonunu değerlendiriyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Orange Scientific</td>
			<td>4430500</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Orange Scientific</td>
			<td>4430300</td>
			<td>Only for live imaging involving Tribolium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm &#216; Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>153066</td>
			<td>Only for live imaging involving Drosophila.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90-mm &#216; Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L9004575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-&#181;m mesh size cell strainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250-&#181;m mesh size sieve</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>200.025.222-038</td>
			<td>Only for live imaging involving Tribolium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300-&#181;m mesh size sieve</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>200.025.222-040</td>
			<td>Only for live imaging involving Tribolium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>710-&#181;m mesh size sieve</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>200.025.222-050</td>
			<td>Only for live imaging involving Tribolium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>800-&#181;m mesh size sieve</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>200.025.222-051</td>
			<td>Only for live imaging involving Tribolium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405 fine wheat flour</td>
			<td>Demeter e.V.</td>
			<td>SP061006</td>
			<td>Only for live imaging involving Tribolium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>commercially available Drosophila medium</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>66-115</td>
			<td>Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent microspheres, 1.0 &#181;m &#216;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T7282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inactive dry yeast</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>62-108</td>
			<td>Only for live imaging involving Tribolium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-melt agarose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6351.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>narrow vials</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-109</td>
			<td>Only for live imaging involving Drosophila</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small paint brush</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>149-2121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9062.3</td>
			<td>Caution: sodium hypochlorite is corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>whole wheat flour</td>
			<td>Demeter e.V.</td>
			<td>SP061036</td>
			<td>Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wide vials</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-110</td>
			<td>Only for live imaging involving Drosophila</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous live imaging of multiple insect embryos in sample chamber-based light sheet fluorescence microscopes

Işık tabakası bazlı floresan mikroskopisi, karmaşık süreçleri biyolojik olarak ilgili birden fazla ölçekte incelemek için verimli çözümler sunar. Numunenin üç boyutlu bütünlüğünü korumak için özel olarak tasarlanmış ve genellikle numune rotasyonu özelliğine sahip numune odası bazlı kurulumlar, gelişimsel biyolojide en iyi seçimdir. Örneğin, meyve sineği Drosophila melanogaster ve kırmızı un böceği Tribolium castaneum'untüm embriyonik morfogenezini belgelemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, mevcut birçok canlı görüntüleme protokolü tek embriyolar için sadece deneysel çerçeveler sağlar. Özellikle karşılaştırmalı çalışmalar için, bu tür yaklaşımlar sakıncalıdır, çünkü ardışık olarak görüntülenmiş örnekler ortam varyansı tarafından etkilenir. Ayrıca, bu, belirli bir süre içinde test edilebilen numune sayısını sınırlar. Numune odası tabanlı kurulumlarda verimi artıran ve böylece tüm numuneler için benzer ortam koşulları sağlayan eşzamanlı canlı görüntüleme için deneysel bir çerçeve sunuyoruz. İlk olarak, ışık tabakası floresan mikroskopları için bir kalibrasyon kılavuzu sunuyoruz. İkincisi, birden fazla embriyo için örnek rotasyonu ile uyumlu bir montaj yöntemi öneriyoruz. Üçüncü olarak, drosophilaörnek üç boyutlu canlı görüntüleme veri kümeleri sağlar Floresan etiketli çekirdekleri ile üç transgenik çizgi yan yana, yanı sıra Tribolium, hangi aynı transgene taşıyan üç transgenik alt çizginin performansını karşılaştırırız, ancak farklı genomik konumlarda. Protokolümüz, sıralı canlı görüntülemede her zaman mevcut olan ortam farkını pro-aktif olarak ele aldığı için karşılaştırmalı çalışmalar için özel olarak tasarlanmıştır. Bu, özellikle, örneğin nakavt deneylerinden kaynaklanan anormal fenotiplerin nicel analizleri ve karakterizasyonu için önemlidir. Ayrıca, ışık tabakası floresan mikroskoplarına erişim sınırlı olduğunda son derece uygun olan genel verimi arttırır. Son olarak, önerilen montaj yöntemi, temel olarak optimizasyon çabası olmadan diğer böcek türleri ve zebra balığı gibi diğer model organizmalar için uyarlanabilir.

Protokolümüz, örnek oda bazlı LSFM'lerde karşılaştırmalı floresan canlı görüntüleme için deneysel bir çerçeveyi tanımlamaktadır. Örneğin, çerçeve (i) iki veya daha fazla türün embriyolarını, (ii) bir veya daha fazla genin nakavt edildiği çizgilerin embriyolarını ve vahşi tip kontrolleri, (iii) aynı transgenik çizgideki birden fazla embriyoyu, (iv) farklı transgenik çizgilerden embriyoları veya (v) aynı transjeni taşıyan alt hatlardan embriyoları yan yana getirmek için kullanılabi...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes at JoVE.com

Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes

Işık tabakası bazlı floresan mikroskopisi gelişim biyolojisinde en değerli araçtır. Karşılaştırmalı çalışmalarda önemli bir konu ortam değişkenliğidir. Protokolümüz, birden fazla örneğin eşzamanlı canlı görüntülenmesi için deneysel bir çerçeveyi açıklar ve bu nedenle bu sorunu pro-aktif olarak ele alıp gidermektedir.

Örnek Oda Bazlı Işık Tabakası Floresan Mikroskoplarında Birden Fazla Böcek Embriyosunun EşZamanlı Canlı Görüntülenmesi

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample ...

simultaneous-live-imaging-multiple-insect-embryos-sample-chamber

Research

JoVE Journal

Biology

2.9K Görüntüleme.  Goethe-Universität. Işık tabakası bazlı floresan mikroskopisi gelişim biyolojisinde en değerli araçtır. Karşılaştırmalı çalışmalarda önemli bir konu ortam değişkenliğidir. Protokolümüz, birden fazla örneğin eşzamanlı canlı görüntülenmesi için deneysel bir çerçeveyi açıklar ve bu nedenle bu sorunu pro-aktif olarak ele alıp gidermektedir.

Video: Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Işık Mikroskobu Binbaşı Bileşenleri

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Biyoloji

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Living Görüntüleme Hücre Şekli Değiştir Drosophila Embriyolar

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Floresan Mikroskobu ile Çoklu Nesiller boyunca Canlı Memeli Hücrelerinde Plazmid Çoğaltma İzlenmesi

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

Çok katmanlı Zebra balığı uzun vadeli Işık Sayfalık Mikroskopi için Montaj

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces photo-bleaching and phototoxic effects compared to confocal microscopy, while providing 3D images with subcellular resolution. Here we present the setup of a light sheet based microscope, which is composed of an upright microscope and a small set of opto-mechanical elements for the generation of the light sheet. The protocol describes how to build, align the microscope and characterize the light sheet. In addition, it details how to implement the method for in toto imaging of C. elegans embryos using a simple observation chamber. The method allows the capture of 3D two-colors time-lapse movies over few hours of development. This should ease the tracking of cell shape, cell divisions and tagged proteins over long periods of time.

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

This protocol describes the setup of a light sheet microscope and its implementation for in vivo imaging of C. elegans embryos.

Için bir Basit Işık Formu Mikroskop Kurma<em&gt; Toto yılında</em&gt; Gürüntülenmesi<em&gt; C. elegans</em&gt; Gelişme

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Zebra balığı Embriyolar Doku spesifik Floresans yarı otomatik Görüntüleme

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...