우리는 기술 지원 버나드 Foucart 감사합니다. 이 작품은 과학 연구를위한 벨기에 기금 (FRS-FNRS)에 의해 의료 연구를위한 엘리자베스 여왕 기금에 의해 지원되었다. 아녜스 빌러는 과학 연구를위한 벨기에 기금의 연구원입니다.

모든 동물의 절차는 연구에 동물의 관리 및 사용에 대한 보건 규정의 국립 연구소에 따라 그리고 지역 윤리위원회의 계약을 수행 하였다. 1. 인공 세리 - 척수의 준비 동일한 매체가, 해부 잘라 휴식 기간 전기 생리학 녹음하는 동안 조각 (1 ML / 분) 붓는다하는 데 사용됩니다. 이 매체는 124 mM의 NaCl을 4.4 mM의 KCl을 26 mM의 NaHCO3를, 1 ㎜의 NaH 2 PO 4, 2.5 MM의 염화칼슘, 1.3 mM의 황산 마그네슘 및 10 MM D-포도당으로 구성되어 있습니다. <ol><li> (1 M) 용액에 이미 황산 마그네슘을 제외한 ACSF 2 L에 대해 서로 다른 구성 요소를 무게. 분말 황산 마그네슘이 높은 흡습성 + 때문에 표준 용액을 사용하여 마그네슘 2의 정확한 농도를 확인 할 수 있습니다. 칼슘 2 + : 마그네슘 2 + 비율이 크게 LTP 유도 및 유지에 영향을14 따라서 ​​그들의 비율은 항상 존중되어야합니다. </li><li> 유리에 염화칼슘을 제외한 모든 구성 요소를 넣어 실린더를 졸업하고 증류수 H 2 O 2 L에 가져다 </li><li> 적극적으로 약동하십시오. 모든 것을 녹일 때, 탱크 (95 % O 2, 5 % CO 2)에 부착 된 수족관 버블과 튜브를 통해 carbogen을 추가합니다. 몇 분 기다린 후 pH를 중탄산염 버퍼의 작용에 의해 7.4로 고정되어 염화칼슘을 추가합니다. </li><li> 냉장 사각 유리 접시에 600 mL를 유지하고 ° C 접시 주위에 얼음을 4로 냉각. 이 매체는 해마 해부에 사용됩니다. </li><li> 나머지 1,400 mL를 필터링하고 삼각 플라스크에 유의하십시오. </li></ol> 2. 전기 생리 조작과 뇌 슬라이스 녹음 챔버의 준비 관류 회로는 2 연동 펌프, 예비 탱크에서 신선한 액체를 펌핑 하나 t에서 다른 펌핑 사용되는 액체로 만든다그는 빈에 챔버를 기록. 신선한 유체는 다시 산소와 중력 (그림 1A)에 의해 인터페이스 녹음 챔버에 도달하기 전에 따뜻하게 집에서 만든 관류 시스템에 추가됩니다. 인터페이스 녹음 챔버는 FST (파인 과학 도구, 밴쿠버, 캐나다, 그림 1B)에 의해 설계되었습니다. 조직 슬라이스는 이동식 잘 링에 부착하고 지속적으로 잘 바늘 흡인의 높이를 조정하여 인터페이스 상태에서 유지 될 수 짠 그물 필터에 배치됩니다. 그 말과 (0.5 mm) 옆 구멍에서 차단 집에서 만든 플라스틱 관은 챔버 수준의 안정성을 높이기 위해 흡입 바늘로 고정됩니다. 기록 헤드는 기록 헤드 (물방울 형성​​을 감소하는)의 편향 포트를 통해 습한 공기를 전달하여 습한 환경을 유지하는 데 도움 가스 분산 돌을 포함하는 물을 욕조에 장착됩니다. 목욕 및 중간 온도는 지속적으로 DC 전류 일의 수준을 변화시킴으로써 제어거친 실리콘 고무가 내장 된 수조에 히터 요소입니다. 물 목욕 및 녹음 우물 서미스터 챔버 온도는이 사이트에 설정하고 정확하게 모니터링 할 수 있습니다. 실의 난방 시스템은 전체 장비의 온도를 제어하는​​ 글로벌 난방 시스템에 의해 완료됩니다. 에든버러 대학 (연구자에 의해 개발 된 소프트웨어 <a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com는</a> ) 산소 공기의 온도, 뇌 슬라이스, 전극 및 장기 레코딩 (그림 1C)를위한 안정적인 환경을 제공하는 나머지 장비를 모니터링하고 이퀄라이제이션 . 마우스 해마 슬라이스에 사용되는 온도는 28 ° C.이다 <ol><li> 20 분의 최소 증류수 H 2 O와 모든 관류 회로를 헹구고 난방 시스템을 시작합니다. </li><li> 회로의 carbogen 버블 링을 시작합니다. Carbogen f를 통해 집에서 만든 관류 관에 도착ilter 초 및 기록 챔버 아래에 목욕한다. 물 목욕 유량은 유량계에 의해 제어됩니다. 흐름 속도가 너무 느린 경우, 조직 저산소증 될 수 있습니다. 유량이 너무 높으면 반대로, 가스는 충분히 따뜻하게하고 조직의 건조로 이어지는 습기를하지 않을 수 있습니다. 높은 가스 유량은 삼투 충격을 선도 아래에 목욕에서 조직에 살포 물의 가능성을 높일 수 있습니다. 이 편향 포트의 출구 나일론 메쉬 비트 (100 μM)을 첨가하여 방지 할 수 있습니다. </li><li> 회로를 배수하고 필터링 ACSF와 입력하십시오. </li><li> 보유 챔버에서 슬라이스를 지원하는 반지를 넣어. 500 ~ 750 μm의에 이르기까지 메쉬 개구부 짠 그물 필터는 두 부분 에폭시 수지 접착제로 뻗어 고리에 연결되어 있습니다. 짠 그물 필터는 87 % 폴리 아미드와 13 % 스판덱스 (팬티 15 덴)로 만든다. 접착제 린의 표면 릴리프의 형성을 피하기 위해 신중하게 적용해야g. </li><li> 회로에서 모든 공기 방울을 조심스럽게 제거합니다. </li><li> 흡입 바늘의 나사를 기록 챔버에서 ACSF의 레벨을 조정합니다. 연동 펌프의 속도는 유입 펌프 1 ML / 분에 5 ML / 콘센트 펌프 분으로 조정됩니다. </li></ol> 관류 시스템은 엄격한 내진 테이블에 배치하고 패러데이 케이지에 의해 둘러싸여 있습니다. 3. 해부 영역의 준비 수술기구 : # 11 블레이드 스탠다드 해부 가위, 봄, 가위, 곡선 포셉, 두 HEIDEMANN spatulae와 숟가락 메스. 보충 자료 : 단두대,있는 underpad, 면도날 맥일 웨인 조직 헬기, 필터 종이, 고무 젖꼭지와 유리 파스퇴르 피펫, 2 플라스틱 파스퇴르는 넓은 입, 페트리 접시의 금속 실린더 중 하나를 피펫 7mm 직경 (그림 2A). <ol><l난&gt; 차가운 ACSF (단계 1에서 제조) 가득 해부 접시에 필터 종이에 싸서 염색 접시에서 냉장 유리 뚜껑을 담그지. 조심스럽게 수족관 버블 (그림 2A)를 통해 기포 및 산소 ACSF를 제거합니다. </li><li> 사용 순으로 악기를 배치. 조직 헬기 플레이트와 증류수와 에테르 (그림 2B)로 세척 새로운 면도날에 필터 종이의 세 가지 레이어를 추가합니다. 이 종이에 닿을 때 면도날은 수평이어야한다. 블레이드 힘은 최대 값의 약 삼분에 최대 값과 속도의 절반으로 조정됩니다. </li><li> 당신이 나중에 시간이 없기 때문에 모든 (악기, 온도 ...) 준비가되어 있는지주의 깊게 확인합니다. </li><li> 차가운 ACSF 가득 파스퇴르 피펫과 절개를 살포 사람을 부탁드립니다. </li><li> 잘린 전에 Nembutal IP (100 ㎎ / ㎏)로 마우스를 마취. 할로 탄 마취도 사용할 수 있습니다. 우리는 방법과 obta을 모두 비교 한동일한 결과를 ined. 잘린 마취하에 수행해야하지만 자궁 경부 전위도 사용할 수 있습니다. 그러나 자궁 경부 전위 동물의 고통을 피하기 위해 매우 좋은 연습이 필요합니다. </li><li> 추운 ACSF 연속에서 샤워 가능한 한 빨리있는 underpad에 해부. </li></ol> 4. 뇌 제거 <ol><li> 총구에 한 손의 검지 손가락과 엄지 손가락으로 여전히 머리를 들고있는 동안, 단두대 컷의 가장자리에서 시작하여 정면 뼈 rostrally 실행하는 머리의 상단 중앙을 따라 해부 가위로 절개를 . </li><li> 완전히 두개골 판을 노출하고 머리의 꼬리 측에 근육을 제거하는 머리의 각 측면에 피부 근육을 잘라. </li><li> 해부 가위, 각 측면에 측두근 근육을 잘라 측두근 판을 따라, 그 횡단, 중앙에 정면 플레이트를 잘라. 그런 다음 두 개의 PL 사이의 후두 뼈에 약간의 상처를 만들ATES. </li><li> 각 측면에 대해, 후두 격판 덮개의 꼬리 기지에서 잘라. </li><li> 스프링 가위로 시상 봉합을 따라 잘라. </li><li> 포셉, 서로를 멀리 확산에 의해 두개골 반쪽을 제거합니다. </li><li> 메스, 단지 후각 망울 후 횡단 잘라 소뇌는 차가운 ACSF과 해부 접시에 추출 된 뇌 자녀들의 나이를 직전. </li></ol> 5. 해마 해부 <ol><li> 뇌 해부 접시에 immerged되면​​, 중간에 삽입 메스 서로의 두 반구를 절단. </li><li> 해마의 박리는 양안 수술 현미경 (X25, 그림 2A)를 통해 시각적으로 제어 spatulae으로 수행됩니다. 하나의 반구에 신중 측면 뇌실을 볼 구조를 확산. 뇌간과 간뇌를 제거합니다. 이 한 쪽 전두엽 피질에 spatulae을 적용하고에 간뇌에 이루어집니다다른 측면. spatulae와 해마를 만지지하고 조직 절편 동안 그것을 스트레칭하지 않도록주의하십시오. </li><li> 원개 다음 부드럽게 뇌실에 주걱을 삽입하여 피질 (굴러)의 해마를 밀어 절단. </li><li> 해마가 추출 될 때, 과도한 피질 조직과 남아있는 혈관을 제거합니다. </li></ol> 6. 조각의 절단 <ol><li> 넓은 입 플라스틱 파스퇴르 피펫으로, 그 알 비어 표면 위쪽 (볼록면)와 숟가락 해마를 전송합니다. </li><li> 표준 플라스틱 파스퇴르 피펫과 초과 액체를 제거합니다. </li><li> 수직으로 거의 헬기의 필터 용지 (그림 2B)를 터치 숟가락을 기울 빠르게 필터 종이를 만져, 숟가락 해마 내려 다음 숟가락을 다시 이동합니다. </li><li> 해마의 방향 및 (hippocam의 방향에 대한 그림 2C를 참조 헬기와 400 μm의 횡단을 슬라이스면도날을 기준으로 고름). 가능한 한 빨리 역할을합니다. </li><li> 슬라이스 해마와 필터 용지를 제거하고 조각 조금을 확산하기 위해 금속 실린더 주위를 감 쌉니다. 그런 다음, 무료 표준 플라스틱 파스퇴르 피펫과 차가운 ACSF 가득 페트리 접시에 그들을 수집을 사용하여 ACSF의 스프레이 조각. </li></ol> 7. 인터페이스의 조각의 배양 <ol><li> 표준 플라스틱 파스퇴르 피펫 조각을 선택하고 빠르게 녹음 챔버에 배치합니다. 조각은 28에서 인터페이스에서 직접 녹음 챔버 해부 외상 복구 ° C. </li><li> 슬라이스는 대부분 싱크됩니다. 슬라이스 수준에 도달하기 위해 유체 수준을 낮 춥니 다하고 그것을 떠 있도록 할 올립니다. </li><li> 레벨을 낮추면서 올바른 위치에 조각을 켭니다. 조각 CA1 영역에서 전극의 위치 (2 자극 한 기록 전극)을 용이하게하기 위해 같은 방법으로 항상 지향합니다. </li><li> 시 정지유체 인터페이스입니다. 슬라이스 주위 매체의 &quot;초승달은&quot;매체의 충분한 수준을 나타내는 것입니다. 넷 필터는 미디어 포화는하지만, 완전히 침수되지해야합니다. </li><li> 구멍 뚜껑 위에 배치 여과지로 덮여 챔버를 유지합니다. </li><li> 28 적어도 1.5 시간 동안 슬라이스 나머지를하자 ° C. </li></ol> 8. 시냅틱 응답의 기록 <ol><li> 전극 기록 : ACSF 가득 할 때 유리 모세관 MΩ 2-5의 팁 저항을 얻기 위해 뽑아됩니다. 필터 종이의 작은 조각은 전극의 끝 부분 주위에 배치되어 뼈 왁스 응축을 줄이기 위해 말단에 적용됩니다. 자극 전극 : 12.5 μm의 직경 백금 - 이리듐 바이폴라 클러스터 전극 FHC (USA)에서 구입. 적절한 치료와 함께, 각 전극은 최소 30 시간 (그림 1B)를 사용할 수 있습니다. </li><li> CA1 지역의 지층 radiatum에 전극을 놓고, 모든 전극 지어최대 (그림 3A). 전극은 Narishige의 미세 조작기와 조각의 표면 아래 75-150 μm의 하향 조정됩니다. 두 자극 전극은 샤퍼 담보의 두 가지 번들을 자극하는 배치됩니다. 전극 슬라이스로 내려 할 때, 여과지주의 깊게 챔버를 닫 모든 주위에 배치됩니다. </li><li> 바이 페이 자극 (반 파장 당 0.08 밀리 초 펄스 지속 시간) SIU-V 절연 장치에 연결된 잔디 자극과 일정한 전압에서 수행됩니다. 최대 응답은 12 V. 필드 EPSPS는 WPI ISO-80 앰프와 1000 배 증폭, 10 Hz에서 10 kHz에서 필터링 최대 2 V에서 자극 강도를 증가에 의해 확인된다. 신호는 국립 악기 A / D 변환기를 통해 PC로 전송됩니다. 자극, 데이터 수집 및 분석 WinLTP 프로그램 (사용하여 수행됩니다 <a href="http://www.winltp.com">www.winltp.com을</a> ). 필드 EPSPS는 입력 아웃에서 얻은 최대 진폭의 40 %에 기록됩니다곡선을 넣어. 각 조각, fEPSP 슬로프는 LTP 유도 앞에 30 분 동안의 평균 기울기에 대한 정규화됩니다. </li><li> LTP는 두 번째 경로는 제어 역할을하면서 하나의 통로에 테스트 강도 자극 한 열차 (100 Hz에서)을 적용하여 트리거됩니다. </li></ol> 9. 설치 청소 <ol><li> 적어도 10 분 동안 과산화수소 (H 2 O 2)의 3 % 용액으로 모든 회로를 씻어 후, 드레인. 회로는 조심스럽게 실험을 시작하기 전에 증류수로 세척한다. 다른 실험실 청소 만 증류수를 사용하지만 물을 사용할 때 우리는 튜브 시스템의 어두운 잔류의 증착을 발견했습니다로서 H 2 O 2를 사용 절대적으로 필요하지 않습니다. </li><li> 녹음 챔버 아래의 물을 욕조에 물을 교체합니다. </li><li> 5 분 알코올 목욕은 자극 전극 팁. </li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 우리의 실험실에서 개발 LTP 녹음 11,17에 큰 전문 지식을 가진 다른 실험실에서 사용되는 방법의 조합에 따른 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 성인 쥐 해마에 적응하고 모든 연령 및 배경 유전자형의 동물에 사용할 수 있습니다. 또한 알츠하이머 병 18,19 같은 neurodegenerative 질병을 개발하는 형질 전환 생쥐에서 LTP의 분석을 할 수 있습니다. 쥐?...

요즘 복잡한 메모리를 저장하고 신경 회로 수준에서 호출하는 방법의 제한으로 이해가있다. 그러나 메모리 스토리지의 통합 가설이 가능하고 광범위하게 허용됩니다 : 메모리는 중추 신경계의 뉴런 사이의 시냅스 연결의 강도의 변화로 저장됩니다. 자신에 시냅스 가소성에 대한 연구는 크게 두 가지 획기적인 발견의 혜택을 받았다. (1)에서 그대로 마취 토끼를 사용하여 정액 실험, 행복과 로모 1, 짧은 높은 주파수 (1 초, 100 Hz에서) 해마의 perforant 경로에 자극의 전달이 오랫동안 (몇을 일으키는 원인 발견 시간) 관련 시냅스 연결의 증가. 이 매혹적인 현상 1975 2 더글러스 고다드에 의해 &quot;장기 상승 작용&quot;또는 LTP를 불렀습니다. (2) 나중에, 그것은 유사한 현상 (0.4 mm) 뇌 조각에서 트리거 될 수있는 것으로 나타났습니다 인위적으로 체외에서 살아 유지 </eM&gt;. 가장 널리 연구 LTP는 소위 CA1 영역의 피라미드 신경 세포에서 유발의 결과 필드 흥분성 시냅스 전위를 기록하는 동안 축삭 (소위 샤퍼의 담보)의 번들로 하나 또는 여러 tetani에 전달하여 체외에서 관찰되었다. LTP 유도의 메커니즘은 크게 공개되었다. AMPA 수용체의 인산화 (효율성 증가)과 시냅스 막 3 여분의 AMPA 수용체의 결합 : 기본적으로, NMDA 수용체를 통한 칼슘 2 + 유입은 두 가지 결과를 초래 효소를 활성화합니다. 이 실험적으로 훨씬 더 어려운 30 ~ 60 분보다 몇 시간 동안 건강한 슬라이스를 유지하는 것입니다 특히 때문에 대조적으로, LTP의 유지 보수 단계의 메커니즘은 대부분 알 수 있습니다. 연구의 많은 LTP 메커니즘과 흥미로운 이론의 이해에 전념 한이 년 4-11에 정교하고있다. 그러나 유엔틸 지금, 시냅스 강도 안정적인 증가를 기본 정확한 분자 메커니즘이 밝혀되지 않았습니다. 이 준비를 위해 서로 다른 기술을 사용하여 서로 다른 실험실에서 이전 결과를 재현하는 어려움과 해마 슬라이스의 유지에 부분적으로 인해 수 있습니다. 자신의 방법론 논문에서는 Sajikumar 등. 12 쥐의 해마 슬라이스와 안정 LTP의 기록의 준비를 위해 실험 조건의 중요성을 강조했다. 이 비디오에서 우리는 쥐 해마 슬라이스에 매우 안정적인 LTP를 기록 할 수 년 동안 우리 실험실에서 개발 된 모든 최적화 단계를 제시한다. 이 최적화는 쥐 13 쥐 11 LTP 메커니즘을 연구 다른 실험실에서 개발하고 성공적으로 사용되는 프로토콜에서 변경되었습니다. 그것은 경험이 풍부한 연구자 유도하고 성공의 높은 속도를 가진 성인 마우스에서 매우 오래 지속 LTP를 기록 할 수 있습니다. P유도 된 LTP의 hysiological 기준은주의 깊게 검사하고 14 증명되었다. 이 방법론의 논문에서, 우리는 해부 절차 깊이 슬라이스 흥분을 수정할 수 있지만 온도 나 산소와 같은 실험 조건의 수정, LTP 유지에 지대한 영향을 미칠 수 있음을 보여줍니다. 또한 이러한 모든 매개 변수의 정밀 제어가 초보 학생들을위한 몇 개월의 교육을 필요로하는 강조해야합니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 1M</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>63126</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen</td>
			<td>Air Liquide (Belgium)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries</td>
			<td>WPI, Inc. (UK)</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulating Electrodes</td>
			<td>FHC (USA)</td>
			<td>CE2B30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td>FST (Germany)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper 84 g/m2</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>FT-3-105-110</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh</td>
			<td>Lycra</td>
			<td>15 den</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>UHU</td>
			<td>plus endfest300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>WPI, Inc. (UK)</td>
			<td>ISO-80</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface recording chamber</td>
			<td>FST (Germany)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pumps</td>
			<td>Gilson (USA)</td>
			<td>Minipuls 3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>University of Edinburgh</td>
			<td><a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a></td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Chopper</td>
			<td>Mcllwain</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulators</td>
			<td>Grass (USA)</td>
			<td>S88X + SIU-V</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Program analysis</td>
			<td>WinLTP</td>
			<td><a href="http://www.winltp.com" target="_blank">www.winltp.com</a></td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MM-3 and MMO-220A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A/D converter</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NIPCI-6229 M-series</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved preparation and preservation of hippocampal mouse slices for a very stable and reproducible recording of long-term potentiation

장기 상승 작용 (LTP)는 시냅스 강도의 증가에 의해 특징 시냅스 가소성의 한 종류이며 메모리 인코딩에 관련된 것으로 믿었다. LTP는 광범위하게 연구되어왔다 급성 해마 슬라이스의 CA1 지역에 이끌려. 그러나이 현상의 유지 보수 단계의 기초가되는 분자 메커니즘은 여전히​​ 제대로 이해하고 있습니다. 이 서로 다른 실험실에서 사용하는 다양한 실험 조건에 부분적으로 인해 수 있습니다. 사실, LTP의 유지 보수 단계는 산소, 온도 및 습도 등 외부 변수에 크게 의존한다. 또한 절개 후 슬라이스 평면과 조각 생존의 방향이 같은 내부 파라미터에 따라 달라집니다. 이러한 모든 매개 변수의 최적화는 매우 재현성이 매우 안정적인 장기 상승 작용을 유도 할 수 있습니다. 이 방법은 더 안정적인 증가에 관련된 분자 메커니즘을 탐구 할 수있는 가능성을 제공합니다해마 슬라이스 시냅스 강도를합니다. 또한 신경 생리 학적 현상의 체외 조사에서의 실험 조건의 중요성을 강조한다.

이 방법은 성인 C57BL/6J 마우스 (잰 비어 SAS, 프랑스)의 14에서 급성 해마 슬라이스에 유도 오래 지속되는 장기 상승 작용의 특성을 분석하는 데 사용되었습니다. 놀랍게도, 실험 조건의 개선은 LTP를 바라 보는 새로운 방식을 주도하고있다. 우리는 시냅스 강도의 지속적인 증가는 새로운 단백질의 합성을 요구하지 않은 것으로 나타났다. 여기, 우리는 LTP 유도가 슬라이?...

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Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

이 논문은 준비하고 유지하는 완벽한 방법을 제공합니다<em&gt; 체외에서</em성인 생쥐&gt; 급성 해마 조각. 이 프로토콜은 95 %의 성공률로 8 시간 이상 아주 안정되어 오래 지속되는 장기 potentiation (LTP)의 녹음을 할 수 있습니다.

장기 상승 작용으로 매우 안정하고 재현성 기록을위한 향상된 준비 및 해마 마우스 조각의 보존

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

improved-preparation-preservation-hippocampal-mouse-slices-for-very

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.6K 조회수.  University of Mons. 이 논문은 준비하고 유지하는 완벽한 방법을 제공합니다 체외에서 급성 해마 조각. 이 프로토콜은 95 %의 성공률로 8 시간 이상 아주 안정되어 오래 지속되는 장기 potentiation (LTP)의 녹음을 할 수 있습니다.

비디오: Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

β - 아밀로이드 Oligomeric의 준비 1-42</subHippocampal 조각에 시냅틱 소성 장애의>와 유도

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

연구

신경과학

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

노화와 아밀로이드 병리 동안 시냅틱 얼터 레이션의 연구에 대한 고양이와 트렌스 제닉 마우스의 급성 Hippocampal 조각의 준비

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

전체 마운트 근육 분석에 의한 재현성 마우스 좌골 신경 크러시와 중생의 후속 평가

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

마우스 뇌의 장기 이미징을위한 세련된와 철근 Thinned-해골 창

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13. In the auditory system, fundamental response properties of brainstem neurons including threshold, frequency specificity, and inhibitory sidebands are altered in significant ways under anesthesia1-2. These observations prompted physiologists to seek ways to record from single neurons without the contaminating effects of anesthesia. One result was a decerebrate preparation, where the brainstem was completely transected at the level of the midbrain4. The drawbacks of this preparation are a formidable surgery, the elimination of descending projections from the forebrain, and an inability to use sensory stimulation to examine structures above the midbrain. A different strategy has been to implant electrode arrays chronically to record from single neurons and multiunit clusters while the animal is awake and/or behaving5,6. These techniques however are not compatible with injecting tracer dyes after first electrophysiologically characterizing a brain structure. To avoid altering neural response properties with anesthetics while recording electrophysiological response properties from single neurons, we have adapted a head restraint technique long used in bats7-9 to mouse10-12. Using this method, we are able to conduct electrophysiological recordings over several days in the unanesthetized mouse. At the end of the recording sessions, we can then inject a dye to reconstruct electrode positions and recording sites or inject a tracer so that pathways to and from the recording loci can be determined. This method allows for well isolated single neuron recordings over multiple days without the use anesthetics.

Electrophysiological characterization of neuronal responses is important for understanding brain function and for guiding the placement of dyes for pathway tracing. However, many studies are performed in anesthetized animals. To understand brain function without anesthetics, we developed a method to record neuronal response properties and inject dyes in awake mouse.

신경 응답을 녹음하고 추적하는 주사에 대한 깨어 마우스의 작성

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

의 장기 강한 적응의 분자 판독<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

해마의 Organotypic 조각의 쌍으로 전체 셀 녹음

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

마우스 인공 와우의 Explants의 장기 시간 경과 영상

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

매우 낮은 밀도에 대한 단순화 된 방법, 장기 차 해마 신경 세포 문화

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...