여기에 제시 된 프로토콜은 성인과 노화 마우스 해마 슬라이스의 준비 중에 과도한 저산소 손상을 감소시켜 성숙하고 노화하는 신경 회로의 기능을 연구하기위한 주요 장애물을 제거합니다. 나트륨 프리 솔루션에 저체온증의 도입은 절단 후 최대 10 시간 동안 건강하고 장기 현장 기록 및 패치 클램프 연구 모두에 적합한 해마 슬라이스를 초래합니다. 해마 슬라이스를 준비하는이 방법은 정의에 따라 노화 뇌 준비를 필요로하는 신경 퇴행성 질환의 동물 모델에 특히 관련이있을 수 있습니다.
이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 얼음 차가운 용액을 가진 경내 풍부를 통해 저체온증을 도입하는 것입니다. 몇 가지 연습을 통해 연구자들은 이 단계를 안정적으로 실행할 수 있습니다. 먼저 복구 챔버 및 후속 레코딩을 위해 aCSF 솔루션 1리터를 준비합니다.
그런 다음 경내 증식 및 절단 단계를 위해 300 밀리리터의 NMDG-aCSF를 준비합니다. 진동하는 미세 토메 절단 트레이와 장착 디스크를 영하 20도 냉동고에 놓습니다. 복구 챔버를 준비하려면 메시를 들고 있는 슬라이스 바로 위에 채우고 실온에서 챔버를 벤치에 보관하는 버블러를 시작합니다.
얼음 결정이 표면과 병의 벽에 형성되기 시작할 때까지 냉동고에서 NMDG-aCSF의 전체 300 밀리리터를 식힙니다. 차가운 병과 NMDG-aCSF를 얼음위에 놓고 거품을 내고 용액을 섭씨 0도에서 2도 사이로 유지합니다. 티슈 마운팅 디스크를 냉동고에서 꺼내 필요한 경우 건조시 닦아냅니다.
마우스 뇌의 크기에 대한 5 %의 천 블록을 잘라 시아노아크라일트 접착제의 얇은 층을 사용하여 디스크의 중심에 접착제. 디스크에 붙어 있는 한천을 얼음 위에 놓고 사용할 준비가 될 때까지 종이 타월로 덮습니다. 절단 트레이를 냉동고에서 꺼내 마이크로톤에 넣은 다음 얼음으로 둘러싸고 블레이드를 적재합니다.
뇌 해부에 대한 모든 도구를 미리 준비합니다. 경동맥 관류용 연동 펌프를 설정합니다. 아이스 NMDG-aCSF로 펌프 튜브의 한쪽을 병에 넣고 27 게이지 바늘로 다른 쪽에 맞습니다.
펌프 속도를 분당 약 3.5 밀리리터로 설정합니다. 이 속도로 NMDG-aCSF의 유출은 연속 흐름이 아니라 빠른 여행입니다. 마우스를 뒷면에 기저귀에 놓습니다.
계속하기 전에 마우스가 발가락 핀치를 수행하여 마취의 수술 비행기에 있음을 확인했습니다. 마우스는 응답하지 않아야하며 가슴과 복부가 노출되도록 앞다리와 뒷다리를 테이프로 두어야합니다. 흉골 아래에서 목구멍까지 가는 가슴에 있는 피부의 큰 패치를 잘라냅니다.
흉골을 집게로 잡고 부드럽게 들어 올리고 가슴 구멍이 노출 될 때까지 양쪽의 늑골 케이지를 절단하십시오. 다이어프램을 잘라내어 얇은 근육을 통해 갈비뼈가 부착된 상태로 둡시합니다. 노출된 가슴 구멍에 다시 떨어지지 않고 따로 설정할 수 있어야 합니다.
심장이 여전히 뛰고 있는지 확인하고 대부분의 간이 보이는지 확인하십시오. 바늘을 왼쪽 심실에 삽입하면 오른쪽보다 색상이 밝아 보입니다. 바늘을 안정시키기 위해 신체의 왼쪽에 남아있는 갈비뼈를 통해 운전하십시오.
어두운 붉은 색 오른쪽 아트리움을 찾아 작은 가위로 잘라냅니다. 피가 흘러나오기 시작해야 합니다. 펌프를 시작하고 빨간색에서 갈색으로 색상을 변경하는 간을 관찰합니다.
간 색상을 모니터링하고 간이 옅은 갈색으로 변할 때까지 관류를 계속합니다. 펌프를 몇 분 더 실행합니다. 동물의 체온은 섭씨 28~29도로 떨어지고 코가 차가워야 합니다.
큰 참수 가위로 마우스를 참수한 다음 숫자 10 블레이드가있는 메스를 사용하여 두개골 위에 피부를 열어 두습니다. 작은 각진 가위로, 미드라인에서 두개골을 잘라. 다음으로, 두개골의 오른쪽과 왼쪽 절반을 멀리 캐비 번호 세 개의 집게를 사용하여, 그것으로 멀리 두라를 가지고조심.
주걱으로 떠서 흰색색이 되어야 하는 뇌를 제거하고 얼음 위에 있는 NMDG-aCSF 솔루션에 넣습니다. 최대 1분 동안 그대로 둡니다. NMDG-aCSF에서 뇌를 꺼내 필터 용지에 놓습니다.
전뇌의 로스트랄 끝에서 중간선을 중심으로 60도 도구를 사용하여 60도 의 조직 웨지를 잘라 제거합니다. 마마 조각에 적합한 각도를 제공하기 때문에 마운팅 표면의 절단 면을 사용합니다. 반구를 미드라인 아래로 메스로 분리하고 장착 디스크에 붙입니다.
얼음에서 장착 디스크를 가지고 필요한 경우 건조 닦아. 그런 다음 한천 블록 앞에 각 반구를 붙이면 측면을 줄입니다. 양 반구의 복부 면이 한천 블록을 만지고 있고 양 반구의 등쪽이 블레이드를 향하고 있는지 확인합니다.
절단 측에 접착할 때, 각 반구는 그 점에서 등쪽 해마의 횡방향 조각을 보장하는 방식으로 블레이드를 기준으로 지향되어야 합니다. 반구와 디스크를 얼음 차가운 발보성 NMDG-aCSF를 포함하는 절단 챔버로 잠급한다. 400 마이크로미터 섹션을 잘라낸 다음 컷오프 팁이 있는 일회용 이송 파이펫을 사용하여 실온에서 이보게겐화된 NMDG-aCSF를 포함하는 복구 챔버로 슬라이스를 전송합니다.
나머지 부분을 절단하고 회생실로 옮기는 데 10분이 지나지 않고 등해학 부위에서 총 8~10개의 슬라이스를 자르십시오. 기록하기 전에 실온에서 슬라이스를 약 2 시간 동안 배양합니다. 이 프로토콜은 성인 마우스에서 해마 조각을 생성하는 데 사용되었다.
CA1 필드와 체증에 있는 피라미드 세포의 다수는 적외선 차등 대조 현미경검사의 밑에 관찰될 때 건강한 세포의 특징인 낮은 대비에서 나타납니다. 패치 클램프 레코딩은 생후 6개월 이상인 마우스의 CA1 뉴런으로부터 얻을 수 있다. 본 예실험에서, NMDA-LTD가 제어 조건에 따라 유도된 후 소형 흥분절기 전류의 주파수를 측정하였다.
소형 흥분성 포스트 냅 스 전류의 주파수는 NMDA-LTD 유도 후 뉴런에서 낮았다, CA1에서 시놉시스의 활동에 의존적인 가지치기를 나타내는. 진폭의 변화는 감지되지 않았다. mEPSC 기록 동안, CA1 세포는 또한 생물시틴과 그대로 수지상 식소 및 피라미드 뉴런의 건강한 세포 습관이 채워져 여기에서 볼 수 있다.
세포 전체에 형광 염료의 강력한 분포는 다른 조건하에서 수선화및 수지상 척추의 분석을 허용합니다. 약 170%의 CA3-CA1 시냅스의 장기 전위성 또는 LTP가 관찰되었으며, 이는 LTP에 필요한 신호 캐스케이드의 유지 보수가 성인 마우스로부터 제조된 슬라이스에 존재한다는 것을 시사한다. 견고한 현장 흥분성 포스트냅틱 잠재적 신호는 네트워크 연결도 보존되었음을 시사합니다.
프로토콜의 두 가지 중요한 측면은 저체온증을 유도하는 얼음 감기 용액을 가진 경동맥 풍부유와 세포 독성 부종을 방지하기 위한 용액의 나트륨 이온 대체물로 NMDG를 도입하는 것입니다. 이러한 예방 조치를 사용하여 급성 슬라이스는 뇌 영역에서 준비 될 수 있습니다. 또한, 이러한 방식으로 제조된 슬라이스는 2광자 또는 와이드필드 현미경 검사를 사용하여 칼슘 및 전압 이미징에 사용될 수 있다.
이 프로토콜은 노화 동물에서 급성 해마 슬라이스에 대한 표준화 된 준비를위한 기초가 될 수 있으므로 신경 퇴행성 질환 메커니즘의 맥락에서 연구 전반에 걸쳐 비교를 용이하게 할 수 있습니다.
