프랭크 예이츠의 소중한 조언에 감사드립니다. 이 작품은 Sup'Biotech에 의해 지원되었습니다.

1화 이노쿨라 준비
<ol><li>실험 에 앞서 트리코데르마 스프의 5 μL을 놓습니다. SBT10-2018 포자는 감자 덱스트로스 천 배지(PDA)에 4°C에 저장되고 코니아형성을 촉진하기 위해 정기적인 광 노출로 30°C에서 4일 동안 배양한다(도1,패널 A). 참고 : 트리코데르마 sPP. SBT10-2018은 나무에서 분리되어 있으며, 빠르게 성장하고 포자 회복의 용이성을 위해 이 연구의 모델로 사용됩니다. 이 균주는 우리의 실험실에 의해 보존됩니다.</li>
	<li>코니디아 복구(그림 1,패널 A)<ol>
<li>트리코데르마 균셀륨에 0.05% Tween-20의 3mL를 놓습니다.</li>
		<li>갈퀴를 사용하여 conidiophores에서 코니디아를 방출; 최해가 찢어지는 것을 방지하기 위해 균사체를 누르지 마십시오.</li>
		<li>마이크로피펫으로 용액을 빠르게 회수하여 한천 배지에 흡수되는 것을 피하고 15mL 튜브로 이송합니다.</li>
		<li>혈류계를 사용하여 총 포자 수를 계산하고 3 x 106 포자 /mL을 포함하는 솔루션을 준비하십시오. 참고: 이 단계는 최해가 추출되는 것을 방지하기 위해 신중하게 수행해야합니다. 포자 제제는 현미경으로 검사됩니다. 결국, 높은 공중 및 푹신한 균사체를 제시하는 균주의 경우, 40 μM 스트레이너 필터를 사용하여 여과 단계를 추가하여 잔류 균사체 조각을 제거할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 곰팡이 플레이트 준비(그림 1,패널 B)
<ol><li>PDA 배지를 함유한 9cm 직경 페트리 접시에 마이크로파이프로 3 x 106 포자/mL의 100 μL을 4,800 개의 포자 / 5mm 직경 - agar 플러그에 해당하는 4,800 포자 / cm2를 얻습니다.</li>
	<li>멸균 주걱으로 직경 2mm 유리 구슬 10g을 추가하고 작업자의 팔에 평행하고 수직으로 앞뒤로 이동하여 천표면에 포자를 고르게 분배합니다.</li>
	<li>플레이트를 90° 회전시키고 회전 움직임을 반복합니다(섹션 2.2에서와 같이); 플레이트가 완전히 회전할 때까지 이러한 단계를 반복합니다.</li>
	<li>플레이트를 즉시 사용하여 포자를 필요로 하는 실험을 설정하거나 17시간 또는 24시간 동안 30°C에서 플레이트를 배양하여 조기 최해 또는 균사체가 각각 필요할 때. 참고: 균사칼 플러그 이송 및 균사체 디스크 전달 후 측정된 항진균 활성을 비교하려면 멸균 핀셋을 사용하고 멸균 5mm 셀룰로오스 디스크를 포자 확산 후 천자 판 표면에 무작위로 배치합니다.</li>
</ol>3. 항진균 화합물 제제
<ol><li>식물 유래 제품 준비: 마늘 분말 제제<ol>
<li>신선한 마늘의 정향을 껍질을 벗기고 메스 블레이드를 사용하여 2-3mm 너비의 슬라이스로 정향을 자른다.</li>
		<li>40 °C에서 2 일 동안 슬라이스를 공기 건조시십시오.</li>
		<li>미세 한 분말을 얻기 위해 칼 공장을 사용하여 3 x 15 초 동안 슬라이스를 갈아.</li>
		<li>사용 전에 마늘 분말을 50mL 튜브에 4°C로 저장합니다. 참고: 마늘이 오토클레이브되지 않기 때문에(온도에 민감한 항진균 화합물의 분해를 방지하기 위해) 사용 전에 70%의 에탄올로 분쇄기, 메스 및 공기 건조기를 청소합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>에센셜 오일 준비<ol>
<li>0.5%, 1%, 2.5%, 5%, 20% 티무스 불가리스 에센셜 오일 솔루션 0.5% Tween-80을 준비하십시오.</li>
		<li>PDA 매체에 추가하기 전에 에멀젼을 형성하기 위해 잘 섞어 보세요(섹션 4.2 참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>카르벤다짐 준비<ol>
<li>200 mg / L 에탄올 용액을 준비하기 위해 carbendazim 의 무게 (carbendazim은 물에 제대로 용해되지 않습니다).</li>
		<li>PDFA 매체에 추가하기 전에 실온에서 솔루션을 저장합니다(섹션 4.2 참조). 주의: 카르벤다짐은 건강과 환경적 위험을 제시합니다. 이 제품을 취급할 때 장갑과 마스크를 착용하십시오. 통풍이 잘 되는 공간에 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 접촉 억제 분석
<ol><li>마늘 가루를 함유한 한천 접시 준비<ol>
<li>PDA 매체를 준비하고 자동 복제합니다.</li>
		<li>원하는 마늘 분말량을 멸균 주걱을 사용하여 50mL 튜브에 계량하여 일반적으로 0.25 mg/mL에서 16 mg/mL에 이르는 농도를 얻습니다.</li>
		<li>손목 안쪽에 있는 매체의 온도를 확인한 후에 PDA의 10mL를 추가합니다. 온도는 민감한 분자의 저하를 방지하기 위해 가능한 한 낮아야합니다. 이상적으로, 이 온도는 45 °C이어야한다.</li>
		<li>튜브를 거꾸로 뒤집어 서 분말을 PDA 배지로 고르게 분배하여 조심스럽게 균질화합니다. 직경 5cm페트리접시(그림 1,패널 C)에 10mL를 빠르게 붓습니다.</li>
		<li>페트리 접시를 실온에 놓고, 한천이 고화될 때까지 기다립니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>에센셜 오일 또는 카르벤다짐을 함유한 한천 판 준비<ol>
<li>50mL 튜브에 PDA 10mL을 소개합니다. 섹션 4.1.3의 온도를 확인합니다.</li>
		<li>PDA에 Thymus vulgaris 에센셜 오일의 다른 용액의 100 μL을 추가하여 0.005%, 0.01%, 0.025%, 0.2% 용액을 얻습니다(섹션 3.2.1 참조).</li>
		<li>0.0625-2 mg/L에 이르는 솔루션을 얻기 위해 200 mg/L 솔루션에서 카벤다짐의 필요한 볼륨을 추가합니다(섹션 3.3.1 참조).</li>
		<li>튜브를 거꾸로 뒤집어 조심스럽게 균질화하고, 10mL를 직경 5cm의 페트리접시(그림 1,패널 C)로 빠르게 붓습니다.</li>
		<li>페트리 접시를 실온에 놓고, 한천이 고화될 때까지 기다립니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>접촉 억제 분석(도 1)<ol>
<li>직경 5mm의 멸균 스테인리스 스틸 튜브를 사용하면 항진균 화합물을 포함한 PDA 또는 PDA가 포함된 페트리 접시 중앙에 원을 플롯합니다. 멸균 이쑤시개(패널 C)를 사용하여 한천 실린더를 폐기하십시오.</li>
		<li>직경 5mm의 멸균 스테인리스 스틸 튜브를 사용하면 2부에서 곰팡이 판에 무작위로 동그라미를 넣습니다. 플레이트당 15-20 원(패널 B)을 플롯합니다.</li>
		<li>포자, 조기 최해, 또는 멸균 이쑤시개를 함유한 진셀륨으로 덮인 천실린더를 조심스럽게 철회하고 항진균 화합물(panel C)을 포함한 PDA 또는 PDA를 포함하는 페트리 접시의 빈 공간에 플러그를 넣습니다.</li>
		<li>30°C에서 48시간, 31h의 초기 최해를 포함하는 플레이트에 대해, 24h의 균사체(panel C)로 덮인 플레이트에 대해 포자를 함유한 플레이트를 배양한다.</li>
		<li>방사형 성장의 직경을 측정하고 포뮬러 (패널 D)를 사용하여 제어를 통해 곰팡이 성장 억제의 백분율을 계산합니다. % 곰팡이 성장 억제 = (C - A / C)* 100 여기서 C는 PDA 배지및 항진균 화합물을 함유하는 PDA 배지에서 방사형 성장의 직경이다. 참고: 균사형 플러그 이송 및 균사체 디스크 전달 후 측정된 항진균 활성을 비교하기 위해 멸균 핀셋을 사용하여 이전에 진균판 의 표면에 증착된 5mm 직경 디스크(섹션 2 노트)를 PDA 또는 PDA가 함유한 페트리 접시의 중앙에 옮기고 항진균 화합물을 함유한 PDA와 정확히 진행</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 증기 상 억제 분석
<ol><li>마늘 가루를 함유한 한천 접시 준비<ol>
<li>섹션 3.1에서와 같이 진행합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>에센셜 오일 또는 카르벤다짐을 함유한 한천판 준비<ol>
<li>3.2 항 및 3.3 섹션에서와 같이 진행합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>곰팡이 접시의 준비<ol>
<li>섹션 2에서와 같이 진행합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>증기상 항진균 억제 분석(도 1)<ol>
<li>PDA 배지 10mL을 5cm 직경의 페트리 접시뚜껑에 붓고 10mL PDA 배지 또는 10mL의 PDA 배지를 함유하여 항진균 화합물을 접시 의 바닥에 넣습니다. 실온(패널 C)에서 한천을 완전히 응고할 때까지 기다립니다.</li>
		<li>50mL 원심관을 교정 도구로 사용하여 뚜껑 중앙에 PDA 원을 얻는 다; 멸균 주걱 (패널 C)으로 원 주위의 PDA를 제거합니다.</li>
		<li>5mm 직경의 멸균 스테인레스 스틸 튜브로 뚜껑에 배치된 PDA 매체의 중앙에 원을 플롯합니다. 멸균 이쑤시개(패널 C)로 한천 실린더를 폐기하십시오.</li>
		<li>섹션 4.3.2 (패널 B)와 같이 곰팡이 판에 무작위로 5mm 직경의 멸균 스테인레스 스틸 튜브가있는 플러그를 형성합니다.</li>
		<li>멸균 이쑤시개를 사용하여 포자, 조기 최해 또는 진균 판에서 균사체로 덮인 플러그를 분석 판(패널 C)의 뚜껑으로 조심스럽게 옮춥니다.</li>
		<li>섹션 4.3.4 (패널 C)에서와 같이 30 °C에서 배양하십시오.</li>
		<li>방사형 성장의 직경을 측정하고 섹션 4.3.5 (패널 D)에서 수식을 사용하여 곰팡이 성장 억제의 백분율을 계산합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

여기에 제시 된 접근 방식은 최소 가공 식물 유래 제품의 항진균 특성의 평가를 허용합니다. 이 프로토콜에서는 2mm 유리 구슬을 사용하여 천 표면에 포자의 균일한 분포가 달성된다. 이 단계는 제대로 구슬을 배포하고 재현 가능한 결과를 얻기 위해 처리 기술을 필요로, 궁극적으로 곰팡이 성장의 다른 단계에서 항진균 효과의 비교를 허용. 우리는 확산 하는 동안 균질화 하는 동안 5 mm 유리 구슬 ?...

과일과 채소의 글로벌 손실은 생산1의 50 %까지 도달 할 수 있으며 주로 20세기중반 부터 합성 살균제의 광범위한 고용에도 불구하고, 필드 또는 수확 후 저장2,3동안 곰팡이 부패로 인한 식품 부패로 인해 발생할 수 있습니다. 이 물질의 사용은 심각한 환경 및 건강 위험을 나타내기 때문에 재검토되고있다. 이들의 유해한 결과가 생태계 전반에 걸쳐 나타나고 잠재적 건강 영향의증거가 축적됨에 따라5,6,수확 후 치료 전 및 후 예방 전략에 대한 새로운 대안이 개발되고 있다7,8,9. 따라서 우리가 직면하는 도전은 두 배입니다. 새로운 살균 전략은 첫째, 식물 병원균에 대한 식품 보호의 효능 수준을 유지하고 두 번째로 농업 관행의 환경 발자국을 획기적으로 줄이는 데 기여해야합니다. 이 야심찬 목표를 달성하기 위해 식물에서 진화한 자연 방어에서 영감을 얻은 전략은 1000종 이상의 식물종이 항균성질8을강조함에 따라 제안되고 있다. 예를 들어, 식물병원균과 싸우기 위해 천연 살균제를 개발한 식물은 새로운 생물통제 제품2의개발을 탐구하는 새로운 자원이다. 에센셜 오일은 이 유형의 주력 분자입니다. 예를 들어, 오리가눔 에센셜 오일은 온실 10의 회색 곰팡이로부터 토마토 식물을 보호하고, Solidago canadensis L. 및 cassia 에센셜 오일은 수확 후 딸기를 회색 곰팡이 손상11,12로부터보존하는 것으로 나타났다. 이러한 예는 생물 통제와 특히 식물 유래 제품이 생물학적 효능과 환경 지속 가능성을 결합한 솔루션을 나타낸다는 것을 보여줍니다.
따라서, 식물은 작물 보호 산업에 대 한 잠재적인 관심의 분자의 중요 한 자원. 그러나 소수의 식물 제품만이 일반적으로 안전, 비식물독성 및 친환경2로인식되더라도 생물 통제 제품으로 사용할 것을 제안되었습니다. 실험실에서 현장으로의 전치에 대한 몇 가지 어려움이 관찰되었으며, 예컨대 생체 내적용2,9에적용된 효능감소 등이 관찰되었다. 따라서, 더 나은 필드 효능을 예측하는 실험실 테스트의 능력을 개선하는 것이 중요해진다. 이러한 맥락에서 식물 유래 제품에 대한 항진균 검사 방법은 항진균 효능을 평가하고 사용하기 위한 최적의 조건을 정의하는 데 모두 필요합니다. 구체적으로, 바이오컨트롤 제품은 일반적으로 화학 살균제보다 효율이 낮기 때문에, 그들의 행동 모드를 더 잘 이해하는 것이 적합한 제형을 제안하고, 분야에서 적용 모드를 식별하고, 병원균의 발달 단계가 후보 바이오제품에 취약한지를 정의하는 것이 중요하다.
항균 및 항진균 활동을 해결하는 현재 접근법은 한천 디스크 확산, 희석, 생물학적 소학 및 유동 세포측정과 같은 확산 방법을 포함합니다.13. 이러한 기술의 대부분, 그리고 더 구체적으로, 표준 항진균 감수성 테스트 - agar 디스크 확산 및 희석 작용 - 액체 현탁액에서 세균성 및 곰팡이 포자에 용해 화합물의 항균 활성을 평가하기위한 잘 적응된다14. 그러나, 이러한 방법은 일반적으로 건조 된 식물 분말 과 같은 고체 화합물을 테스트하거나 천판에 포자 희석 또는 포자 확산 및 /또는 항진균 화합물의 희석을 필요로하기 때문에 균사 체 성장 중 항진균 활성을 정량화하는 데 적합하지 않습니다.13. 식품 독방법에서 항진균제를 함유한 한천판은 정확한 양의 시동을 고려하지 않고 7일 된 곰팡이 배양에서 샘플링된 5-7mm 직경 디스크로 접종된다. 인큐베이션 후 항진균 활성은 방사형 성장 억제의 백분율로 결정됩니다.17,18,19. 이 접근으로 우리는 근생 성장에 항진균 활동을 평가할 수 있습니다. 대조적으로, agar 희석 방법은 항진균 화합물을 함유하는 천판의 표면에 직접 접종된 포자에 대한 항진균 활성을 결정하기 위해 수행됩니다.13,20,21. 이 두 가지 방법은 항진균 활성에 대한 보완적인 결과를 제공합니다. 그러나 이들은 포자와 균사체에 항진균 화합물의 상대적 효능의 정확한 나란히 비교를 제공하지 않는 병렬로 사용되는 두 개의 독립적 인 기술입니다17,20,22 곰팡이 재료의 시작량이 두 가지 접근 방식에서 다릅니다. 더욱이, 식물 유래 제품의 항진균 활성은 종종 식물에 의해 합성된 항진균 분자의 조합으로부터 병원균을 마주하게 된다. 이 분자는 단백질, 펩티드를 포함합니다23,24, 및 대사 산물은 광범위한 화학적 다양성을 가지며 폴리페놀, 테르펜, 알칼로이드와 같은 다양한 분자 클래스에 속하는 대사산물25, 글루코시올레이트8및 유기황 화합물26. 이들 분자 중 일부는 불안정하거나 병원균 공격 중 휘발성이 됩니다.27. 이 에이전트는 가장 자주 가난한 수용성 및 에센셜 오일로 물 증류를 통해 복구 해야 하는 높은 증기 압력 화합물, 그 중 일부는 잘 설립 되었습니다.28. 증기상 매개 감수성 감수성 작용은 증기상을 통한 증발 및 이동에 따른 휘발성 화합물의 항균 활성을 측정하기 위해 개발되었습니다.29. 이러한 방법은 미생물 배양으로부터 멀리 떨어진 항진균 화합물의 도입에 기초한다.29,30,31,32,33. 일반적으로 사용되는 증기상 한고 분석에서 에센셜 오일은 종이 디스크에 증착되어 포이 배지에 퍼지는 세균또는 곰팡이 포자 현탁액과 멀리 떨어진 페트리 접시의 표지 중앙에 배치됩니다. 성장 억제 영역의 직경은 다음 한천 디스크 확산 방법에 대한 것과 같은 방식으로 측정됩니다.20,24. 다른 접근법은 억제 증기상 매개 항균 활성을 계산한 국물 희석 법에서 유래된 에센셜 오일의 증기상 항진균 감수성의 정량적 측정을 제공하기 위해 개발되었습니다.32또는 한천 디스크 확산 소집에서 파생31. 이러한 방법은 일반적으로 증기상 활성 연구에 특이적이며 접촉 억제 작용에 적합하지 않습니다. 이는 복잡한 생리활성 혼합물의 항진균 활성에 휘발성 및 비휘발성 제제의 상대적 기여의 결정을 배제한다.
우리가 개발한 정량적 방법은 식물15의 감염 시 식물병원균의 공중 성장을 재현하기 위해 천 배지의 표면에 증착된 포자와 재배 된 균사체의 제어량에 대한 건조 식물 분말의 항진균 효과를 측정하는 것을 목표로하고 있으며, 상호 연결된 균사네트워크(16). 접근방식은 동일한 실험 설정에서 휘발성 및 비 휘발성 항진균 대사 산물의 기여도를 나란히 정량화할 수 있는 agar 희석 및 식품 중독 방법에 기초한 변형된 실험 용 설정이다. 이 연구에서는, 이 방법은 잘 특징인 3개의 항진균 제제의 활동에 대하여 벤치마킹되었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave-vacuclav 24B+</td>
			<td>Melag</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbendazim</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>378674-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcons tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>547254</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Five millimeters diameter stainless steel tube</td>
			<td>retail store</td>
			<td></td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food dehydrator</td>
			<td>Sancusto</td>
			<td></td>
			<td>six trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garlic powder</td>
			<td>Organic shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>CLOUP</td>
			<td>65020</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png" /> 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer counting cell</td>
			<td>Jeulin</td>
			<td>713442</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>&#160;UM400</td>
			<td>30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knife mill</td>
			<td>Bosch</td>
			<td>TSM6A013B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual cell counter</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>HCNT-001-001</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring ruler</td>
			<td>retail store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiological safety cabinets</td>
			<td>FASTER</td>
			<td></td>
			<td>FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>17014407</td>
			<td>100 - 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>17014411</td>
			<td>20 - 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>17014412</td>
			<td>2 - 20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82-1194500</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png" /> 55 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82-1473&#160;</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png" /> 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Controllers-EASY 60</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>EASY-P60-001</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>70139-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale-RADWAG</td>
			<td>Grosseron</td>
			<td>B126698</td>
			<td>AS220.R2-ML 220g/0.1mg&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rake</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86-1569001</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse microscope AE31E trinocular</td>
			<td>Grosseron</td>
			<td>M097917</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile graduated pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>1254001</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymus essential oil</td>
			<td>Drugstore</td>
			<td></td>
			<td>Essential oil 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 1000 &#181;L&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.762010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 20 &#181;L&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.760012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 200 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.760002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tooth pick</td>
			<td>retail store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichoderma spp strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Strain of LRPIA laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P1379-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P1754-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>FORS-001-002</td>
			<td>/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring volatile and non-volatile antifungal activity of biocontrol products

설명된 프로토콜은 미생물 수량 및 발달 단계를 정확하게 판단할 수 있는 플러그 전달 기술을 기반으로 합니다. 지정된 수의 포자가 한천 판에 퍼져 있습니다. 이 한천판은 배양이 필요하지 않은 포자를 제외한 곰팡이가 예상되는 발달 단계에 도달할 수 있도록 정의된 기간 동안 배양됩니다. 포자, 최면 또는 균사체로 덮인 한천 플러그는 다음 철회하고 항진균 화합물을 함유한 천매체로 이송되어 곰팡이로부터 멀리 또는 접촉하여 테스트할 수 있습니다. 이 방법은 액체 추출물과 고체 샘플(분말)을 모두 테스트하는 데 적용됩니다. 특히 포자, 조기 최면 및 균사체에 대한 휘발성 및 비휘발성 제제의 상대적 기여를 정량화하고 그 효과를 결정하는 데 특히 적합합니다.
이 방법은 바이오 제어 제품, 특히 식물 유래 제품의 항진균 활성의 특성화와 매우 관련이 있습니다. 실제로, 식물 처리를 위해, 결과는 응용 프로그램의 모드의 선택을 안내하고 트리거 임계 값을 설정하는 데 사용할 수 있습니다.

항진균 화합물의 다른 유형의 작용 모드를 구별하는 정량적 방법의 능력을 평가하기 위해, 우리는 잘 알려진 3개의 항진균제의 효능을 비교했습니다. Carbendazim은식물 39,40에서곰팡이 질병의 넓은 범위를 제어하기 위해 널리 사용되어 온 비 휘발성 합성 살균제입니다. Thymus vulgaris 에센셜 오일은 주로 항균 및 항진균 활성에 대해 설명되어 있으며 ?...

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Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products

식물 유래 제품의 항진균 효과를 정량화하도록 설계된 수정된 한천 기반 방법을 설명합니다. 항진균 활성에 대한 휘발성 및 비휘발성 기여는 모두 이 프로토콜을 통해 평가될 수 있다. 또한, 곰팡이에 대한 효능은 단일 실험 설정에서 주요 발달 단계에서 측정될 수 있다.

바이오 제어 제품의 휘발성 및 비휘발성 항진균 활성 측정

The protocol described is based on a plug-transfer technique that allows accurate determination of microorganism quantities and their developmental ...

measuring-volatile-non-volatile-antifungal-activity-biocontrol

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Environment

6.1K 조회수.  Sup’Biotech. 식물 유래 제품의 항진균 효과를 정량화하도록 설계된 수정된 한천 기반 방법을 설명합니다. 항진균 활성에 대한 휘발성 및 비휘발성 기여는 모두 이 프로토콜을 통해 평가될 수 있다. 또한, 곰팡이에 대한 효능은 단일 실험 설정에서 주요 발달 단계에서 측정될 수 있다.

비디오: Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

방사성 트레이서와 식물에 미네랄 영양 성분 및 독성 물질의 플럭스를 측정

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

연구

환경과학

Measuring Carbon-based Contaminant Mineralization Using Combined CO2 Flux and Radiocarbon Analyses

A method is described which uses the absence of radiocarbon in industrial chemicals and fuels made from petroleum feedstocks which frequently contaminate the environment. This radiocarbon signal &#8212; or rather the absence of signal &#8212; is evenly distributed throughout a contaminant source pool (unlike an added tracer) and is not impacted by biological, chemical or physical processes (e.g., the 14C radioactive decay rate is immutable). If the fossil-derived contaminant is fully degraded to CO2, a harmless end-product, that CO2 will contain no radiocarbon. CO2 derived from natural organic matter (NOM) degradation will reflect the NOM radiocarbon content (usually &#60;30,000 years old). Given a known radiocarbon content for NOM (a site background), a two end-member mixing model can be used to determine the CO2 derived from a fossil source in a given soil gas or groundwater sample. Coupling the percent CO2 derived from the contaminant with the CO2 respiration rate provides an estimate for the total amount of contaminant degraded per unit time. Finally, determining a zone of influence (ZOI) representing the volume from which site CO2 is collected allows determining the contaminant degradation per unit time and volume. Along with estimates for total contaminant mass, this can ultimately be used to calculate time-to-remediate or otherwise used by site managers for decision-making.

Measuring Carbon-based Contaminant Mineralization Using Combined CO2 Flux and Radiocarbon Analyses

A protocol is described wherein CO2 mineralized from organic contaminant (derived from petroleum feedstocks) biodegradation is trapped, quantified, and analyzed for 14C content. A model is developed to determine CO2 capture zone's spatial extent. Spatial and temporal measurements allow integrating contaminant mineralization rates for predicting remediation extent and time.

측정 탄소 기반의 오염 물질 무기화 결합 된 CO를 사용하여<sub&gt; 2</sub&gt; 플럭스 및 방사성 탄소 분석

A method is described which uses the absence of radiocarbon in industrial chemicals and fuels made from petroleum feedstocks which frequently contaminate ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes in elevation are related to changes in near-surface soil carbonate (CaCO3) profiles. The objective is to describe a simple conceptual model and detailed protocol for repeatable field and laboratory measurements of these quantities. Here, accurate elevation is measured using a ground-based differential global positioning system (GPS); other data acquisition methods could be applied to the same basic method. Soil samples are collected from prescribed depth intervals and analyzed in the lab using an efficient and precise modified pressure-calcimeter method for quantitative analysis of inorganic carbon concentration. Standard statistical methods are applied to point data, and representative results show significant correlations between changes in soil surface layer CaCO3 and changes in elevation consistent with the conceptual model; CaCO3 generally decreased in depositional areas and increased in erosional areas. Maps are derived from point measurements of elevation and soil CaCO3 to aid analyses. A map of erosional and depositional patterns at the study site, a rain-fed winter wheat field cropped in alternating wheat-fallow strips, shows the interacting effects of water and wind erosion affected by management and topography. Alternative sampling methods and depth intervals are discussed and recommended for future work relating soil erosion and deposition to soil CaCO3.

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes in elevation are related to changes in near-surface soil carbonates. Repeatable methods for field and laboratory measurements of these quantities and data analysis methods are described here.

측정 및 토양 침식과 토양 탄산 농도 농업 관리에 관련 된 증 착 패턴 매핑

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

The Effect of the Application of Thyme Essential Oil on Microbial Load During Meat Drying

Meat is a high protein meal that is used in the preparation of jerky, a popular food snack, where preservation and safety are important. To assure food safety and to extend the shelf life of meat and meat products, the use of either synthetic or natural preservatives have been applied to control and eliminate foodborne bacteria. A growing interest in the application of natural food additives for meat has increased. Microorganisms, such as Escherichia coli, contaminate meat and meat products, causing foodborne illnesses. Therefore, it is necessary to improve the meat conservation process. However, the use of essential oils when the meat is being dried has not been deeply studied. In this regard, there is an opportunity to increase the value of dried meat and reduce the risk of foodborne illnesses by applying essential oils during the drying process. In this protocol, we present a novel method of applying thyme essential oil (TEO) during meat drying, specifically in vapor form directly in a drying chamber. For evaluation, we use Minimal Inhibitory Concentration (MIC) to detect the number of harmful bacteria in the treated samples compared to raw samples. The preliminary results show that this method is a viable and alternative option to synthetic preservatives and that it significantly reduces microbial load in dried meat.

Microorganisms such as Escherichia coli that contaminate meat products cause foodborne illnesses. The use of essential oils in the meat drying process has not been deeply studied. Here, we present a novel method of applying thyme essential oil to meat during drying to reduce the microbial load in dried meat.

고기 건조 하는 동안 미생물 부하에 백 리 향 에센셜 오일의 응용 프로그램의 효과

Meat is a high protein meal that is used in the preparation of jerky, a popular food snack, where preservation and safety are important. To assure food ...

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran insects account for a number of economically substantial pests of plants that cause damage to crops by feeding on phloem sap. The brown marmorated stink bug (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae) and the Asian citrus psyllid (ACP), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) are hemipteran insect pests introduced in North America, where they are an invasive agricultural pest of high-value specialty, row, and staple crops and citrus fruits, as well as a nuisance pest when they aggregate indoors. Insecticide resistance in many species has led to the development of alternate methods of pest management strategies. Double-stranded RNA (dsRNA)-mediated RNA interference (RNAi) is a gene silencing mechanism for functional genomic studies that has potential applications as a tool for the management of insect pests. Exogenously synthesized dsRNA or small interfering RNA (siRNA) can trigger highly efficient gene silencing through the degradation of endogenous RNA, which is homologous to that presented. Effective and environmental use of RNAi as molecular biopesticides for biocontrol of hemipteran insects requires the in vivo delivery of dsRNAs through feeding. Here we demonstrate methods for delivery of dsRNA to insects: loading of dsRNA into green beans by immersion, and absorbing of gene-specific dsRNA with oral delivery through ingestion. We have also outlined non-transgenic plant delivery approaches using foliar sprays, root drench, trunk injections as well as clay granules, all of which may be essential for sustained release of dsRNA. Efficient delivery by orally ingested dsRNA was confirmed as an effective dosage to induce a significant decrease in expression of targeted genes, such as juvenile hormone acid O-methyltransferase (JHAMT) and vitellogenin (Vg). These innovative methods represent strategies for delivery of dsRNA to use in crop protection and overcome environmental challenges for pest management.

This article demonstrates novel techniques developed for oral delivery of double-stranded RNA (dsRNA) through the vascular tissues of plants for RNA interference (RNAi) in phloem sap feeding insects.

체 관 부 식물 수액 공급 Hemipteran 곤충에 RNA 간섭을 유도 하 이중 가닥 RNA 구두 전달 방법

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

Measuring Stolons and Rhizomes of Turfgrasses Using a Digital Image Analysis System

Length and diameter of stolons or rhizomes are usually measured using simple rulers and calipers. This procedure is slow and laborious, so it is often used on a limited number of stolons or rhizomes. For this reason, these traits are limited in their use for morphological characterization of plants. The use of digital image analysis software technology may overcome measurement errors due to human mistakes, which tend to increase as the number and size of samples also increase. The protocol can be used for any kind of crop but is particularly suitable for forage or grasses, where plants are small and numerous. Turf samples consist of aboveground biomass and an upper soil layer to the depth of maximum rhizome development, depending on the species of interest. In studies, samples are washed from the soil, and stolons/rhizomes are cleaned by hand before analysis by digital image analysis software. The samples are further dried in a laboratory heating oven to measure dry weight; therefore, for each sample, the resultant data are total length, total dry weight, and average diameter. Scanned images can be corrected before analysis by excluding visible extraneous parts, such as remaining roots or leaves not removed with the cleaning process. Indeed, these fragments normally have much smaller diameters than stolons or rhizomes, so they can be easily excluded from analysis by fixing the minimum diameter below which objects are not considered. Stolon or rhizome density per unit area can then be calculated based on sample size. The advantage of this method is quick and efficient measurement of the length and average diameter of large sample numbers of stolons or rhizomes.

A software-based image analysis system provides an alternative method to study the morphology of stoloniferous and rhizomatous species. This protocol permits measurement of the length and diameter of stolons and rhizomes and can be applied to samples with a large amount of biomass and to a wide variety of species.

디지털 이미지 분석 시스템을 사용 하 여 Turfgrasses의 Rhizomes Stolons을 측정

Length and diameter of stolons or rhizomes are usually measured using simple rulers and calipers. This procedure is slow and laborious, so it is often ...

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many countries around the world. Severe yield losses are caused by direct feeding, and even more importantly, also by the transmission of more than 100 harmful plant pathogenic viruses. As for other invasive pests, increased international trade facilitates the dispersal of B. tabaci to areas beyond its native range. Inspections of plant import products at points of entry such as seaports and airports are, therefore, seen as an important prevention measure. However, this last line of defense against pest invasions is only effective if rapid identification methods for suspicious insect specimens are readily available. Because the morphological differentiation between the regulated B. tabaci and close relatives without quarantine status is difficult for non-taxonomists, a rapid molecular identification assay based on the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology has been developed. This publication reports the detailed protocol of the novel assay describing rapid DNA extraction, set-up of the LAMP reaction, as well as interpretation of its read-out, which allows identifying B. tabaci specimens within one hour. Compared to existing protocols for the detection of specific B. tabaci biotypes, the developed method targets the whole B. tabaci species complex in one assay. Moreover the assay is designed to be applied on-site by plant health inspectors with minimal laboratory training directly at points of entry. Thorough validation performed under laboratory and on-site conditions demonstrates that the reported LAMP assay is a rapid and reliable identification tool, improving the management of B. tabaci.

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

This paper reports the protocol for a rapid identification assay for Bemisia tabaci based on loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology. The protocol requires minimal laboratory training and can, therefore, be implemented on-site at points of entry for plant imports such as seaports and airports.

루프-중재 등온 증폭 (램프) 분석 결과 Bemisia tabaci 의 빠른 식별

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into the plant&#39;s genome. Here, we present two transformation systems to genetically modify potato (Solanum tuberosum) plants. In A. tumefaciens transformation, leaves are infected, the transformed cells are selected and a new complete transformed plant is regenerated using phytohormones in 18 weeks. In A. rhizogenes transformation, stems are infected by injecting the bacteria with a needle, the new emerged transformed hairy roots are detected using a red fluorescent marker and the non-transformed roots are removed. In 5-6 weeks, the resulting plant is a composite of a wild type shoot with fully developed transformed hairy roots. To increase the biomass, the transformed hairy roots can be excised and self-propagated. We applied both Agrobacterium-mediated transformation methods to obtain roots expressing the GUS reporter gene driven by a suberin biosynthetic gene promoter. The GUS staining procedure is provided and allows the cell localization of the promoter induction. In both methods, the transformed potato roots showed GUS staining in the suberized endodermis and exodermis, and additionally, in A. rhizogenes transformed roots the GUS activity was also detected in the emergence of lateral roots. These results suggest that A. rhizogenes can be a fast alternative tool to study the genes that are expressed&#160;in roots.

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Here, we present two protocols to transform potato plants. The Agrobacterium tumefaciens transformation leads to a complete transgenic plant while the Agrobacterium rhizogenes produces transgenic hairy roots in a wild type shoot that can be self-propagated. We then detect promoter activity by GUS staining in the transformed roots.

Agrobacterium tumefaciens 및 Agrobacterium rhizogenes-감자의 변환 중재와 거 스 얼룩에 의해 Suberin 유전자의 발기인 활동

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more streamlined herbivory protocols. Perturbations of chewing insects are usually studied in whole plant systems. While this whole organism strategy is popular, it is not necessary if similar observations can be replicated in a single detached leaf. The assumption is that basic elements required for signal transduction are present within the leaf itself. In the case of early events in signal transduction, cells need only to receive the signal from the perturbation and transmit that signal to neighboring cells which are assayed for gene expression.
The proposed method simply changes the timing of the detachment. In whole plant experiments, larvae are confined to a single leaf which is eventually detached from the plant and assayed for gene expression. If the order of excision is reversed, from last in whole plant studies, to first in the detached study, the feeding experiment is simplified.
Solanum tuberosum var. Kennebec is propagated by nodal transfer in a simple tissue culture medium and transferred to soil for further growth if desired. Leaves are excised from the parent plant and relocated to Petri dishes where the feeding assay is conducted with the larval stages of M. sexta. Damaged leaf tissue is assayed for the expression of relatively early events in signal transduction. Gene expression analysis identified infestation-specific Cys2-His2 (C2H2) transcription factors, confirming the success of using detached leaves in early response studies. The method is easier to perform than whole plant infestations and uses less space.

The presented method creates natural herbivore damaged plant tissue through the application of Manduca sexta larvae to detached leaves of potato. The plant tissue is assayed for expression of six transcription factor homologs involved in early responses to insect herbivory.

분리 된 잎 어설아는 곤충 만두카 sexta를 츄잉에 의해 감염 하는 동안 감자에 유전자 발현 연구를 단순화 하기 위해

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water distribution in plant tissues in combination with freeze fixation techniques using liquid nitrogen (LN2). For woody species, however, preparations for observing the xylem transverse-cut surface involve some difficulties due to the orientation of wood fibers. Additionally, higher tension in the water column in xylem conduits can occasionally cause artifactual changes in water distribution, especially during sample fixation and collection. In this study, we demonstrate an efficient procedure to observe the water distribution within the xylem of woody plants in situ&#160;by using a cryostat and cryo-SEM. At first, during sample collection, measuring the xylem water potential should determine whether high tension is present in the xylem conduits. When the xylem water potential is low (&#60; ca. &#8722;0.5 MPa), a tension relaxation procedure is needed to facilitate better preservation of the water status in xylem conduits during sample freeze fixation. Next, a watertight collar is attached around the tree stem and filled with LN2&#160;for freeze fixation of the water status of xylem. After harvesting, care should be taken to ensure that the sample is preserved frozen while completing the procedures of sample preparation for observation. A cryostat is employed to clearly expose the xylem transverse-cut surface. In cryo-SEM observations, time adjustment for freeze-etching is required to remove frost dust and accentuate the edge of the cell walls on the viewing surface. Our results demonstrate the applicability of cryo-SEM techniques for the observation of water distribution within xylem at cellular and subcellular levels. The combination of cryo-SEM with non-destructive in situ observation techniques will profoundly improve the exploration of woody plant water flow dynamics.

Observing the water distribution within the xylem provides significant information regarding water flow dynamics in woody plants. In this study, we demonstrate the practical approach to observe xylem water distribution in situ&#160;by using a cryostat and cryo-SEM, which eliminates artifactual changes in the water status during sample preparation.

극저온 스캐닝 전자 현미경으로 시각화된 우디 식물의 자일렘 물 분포

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...