이 프로토콜은 곤충 약초보에 반응하여 식물 유전자 발현을 측정하기 위한 간소화된 접근법을 사용합니다. 페트리 접시에서 분리된 분리된 잎을 사용하여, 곤충은 상대적으로 짧은 기간 동안 감염이 재발할 수 있는 유전자 발현 데이터에 기여하는 동안 쉽게 적용하고 모니터링할 수 있다. 이 프로토콜은 많은 식물/곤충 상호 작용에 적응될 수 있다.
전체 플랜트 시스템의 기준 관측이 고려되는 경우. 곤충 먹이의 예측할 수없는 특성은 어려울 수 있습니다. 따라서 제대로 준비된 애벌레와 건강한 식물을 신뢰할 수 있는 공급은 성공의 가장 좋은 기회를 제공합니다.
건강한 식물과 곤충이 어떻게 나타나고 행동해야 하는지 시각화하는 것은 특히 연구 분야의 새로운 연구자에게 최적의 결과를 달성하는 데 도움이 됩니다. 저와 함께 절차를 시연하는 것은 과일과 채소 실험실의 유전자 개선에 있는 분자 생물학자 프랜시스 페레즈가 될 것입니다. 노드 전파 조직 배양 감자 식물을 준비하려면 먼저 3 ~ 4 개의 노드가있는 절제 물질에서 재배 된 Kennebec plantlets를 얻습니다.
멸균 블레이드를 사용하여 나뭇가지를 주 줄기 에 가깝게 자르고 잎 당 약 2 밀리미터의 가지 조직을 남겨 둡니다. 각 노드 위와 아래약 2밀리미터를 잘라 줄기에서 절개를 제거하고 분지와 함께 절달 전달 배지를 포함하는 멸균 조직 배양 용기에 노달 절단을 배치합니다. 그런 다음 24섭씨24도에서 2~3주 동안 식물 조직 배양실로 노달 절단을 옮기고 16시간 의 빛, 8시간 어두운 사진 기간을 옮는다.
먹이를 위해 곤충을 준비하려면, M.sexta의 원하는 애벌레 단계를 얻고 애벌레의 크기에 따라 적절한 봉쇄 용기의 각 우물에 하나의 애벌레를 전송합니다. 흰색 종이줄 지어 여섯 적절하게 크기의 페트리 접시 세트를 개최 할 수있는 다섯 튼튼한 트레이를 사용하여 각 수확 시간 지점에 대한 배치 템플릿을 확인합니다. 각 트레이의 용지에 적당히 크기의 Petri 접시를 사용하여 6개의 원 세트를 추적하고 한 세트의 원 컨트롤 A, B 및 C와 감염된 A, B 및 C.에 레이블을 지정한 다음 각 배치 템플릿에 적절한 수확 시간을 표시합니다.
다음으로, 배치 템플릿의 각 원에 대해 1.7 밀리리터 미세센심분리기 튜브를 라벨로 지정하여 변투, 식물 복제 편지 및 수확 시점을 적절하게 식별합니다. 모든 튜브가 라벨이 붙었을 때 멸균 필터 종이 디스크를 템플릿 당 하나의 페트리 접시에 넣고 각 접시에 과도한 액체 풀을 두지 않고 멸균물로 디스크를 적시십시오. 그런 다음 각 배치 템플릿의 각 원에 하나의 접시를 놓고 각 배치 템플릿 옆에 같은 연령과 상대 크기의 감자 식물 세 개를 놓습니다.
감염을 시작하려면 멸균 가위를 사용하여 각 식물의 상위 2 가지 크기의 일치하는 잎을 제거하고 제어 페트리 접시에 잎 한 개와 각 식물의 감염 된 페트리 접시에 한 잎을 가능한 한 빨리 놓습니다. 모든 잎을 배치한 경우 소프트 터치 포셉을 사용하여 적어도 하나의 애벌레를 각 감염 된 접시에 가능한 한 빨리 옮기고 원하는 감염 시간에 대한 타이머를 설정합니다. 모든 애벌레가 먹고 있는지 확인하기 위해 먹이를 관찰하여 필요에 따라 먹이지 않는 애벌레를 대체하십시오.
감염 시간의 끝에 있는 모든 잎에서 애벌레를 모두 제거하고 수확 타이머를 시작합니다. 각 수확 시점의 끝에서, 각 잎을 해당 튜브로 옮기고 즉시 튜브를 액체 질소로 떨어뜨려 RNA 가 절연될 때까지 영하 80도에서 저장하기 전에 잎 샘플을 동결한다. 건강 정확하게 준비 된 애벌레는 잎 표면에 배치 한 직후 공급을 시작해야하며, 공급은 감염 기간 동안 상당히 일관된 방식으로 계속해야합니다.
이 잎의 바닥에있는 애벌레는 식물 물질을 소비하지 않았으며 감염에 실패한 예입니다. 이 잎은 2 주 된 nodal 전파 조직 배양 식물에서 분리 하 고 각 애벌레 단계에 대 한 다른 속도 및 먹이 스타일에 소비. 이러한 결과에 기초하여, 네 번째 인스타 애벌레는 더 밀접하게 식물 성장 감자 식물을 더 성숙한 토양 재배 감자 식물잎에 대한 손상을 평가하기 위해 선택되었다.
이러한 유전자 발현 연구에서, M.sexta herbivory에 강력하게 반응하는 2개의 새로운 C2H2 아연 손가락 전사 인자는 감염 성 소사를 위한 분리된 잎의 사용을 지원하는 것으로 확인되었습니다. 나이와 크기일치 잎을 사용하고 균일성이 더 재현 가능한 데이터를 초래하기 때문에 각 실험에 대한 애벌레를 올바르게 무대에 올리는 것을 기억하십시오. 잎 조직은 스트레스 유도 반응성 산소 종 과 자스몬산 호르몬 유도체에 대해 분석 될 수있다.
전체 전사, 프로테오메 또는 미생물군유전체 연구는 잎 조직에서도 수행될 수 있다.
