우리는 시간이 지남에 따라 이러한 프로토콜의 개발에 기여한 Kim Lab의 이전 및 현재 구성원에게 감사드립니다. 대표 데이터는 P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/United States 및 P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/United States에 의해 가능했습니다. 이 간행물은 Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award의 보조금 번호 T32 GM135134 덕분에 부분적으로 가능했습니다.

동물 프로토콜은 로체스터 대학의 동물 자원에 관한 대학 위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구의 마우스는 로체스터 대학 동물 시설의 병원체가 없는 공간에서 유지되었습니다. 본 연구에는 6-12주(15-30g)의 수컷/암컷 C57BL/6마리 마우스가 사용되었습니다. 마우스 조직 분리는 손을 가리는 장갑과 코와 입을 가리는 안면 마스크가 있는 벤치탑 또는 생물 안전 캐비닛 내부에서 수행할 수 있습니다. 모든 세포 배양 및 플레이트 준비는 생물안전 작업대에서 수행해야 합니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. CD8+ T 세포 정제 및 활성화
<ol><li>재료 준비<ol><li>CD8+ T 세포의 음성 선택: 각각 anti-CD4 및 anti-MHCII를 생성하는 하이브리도마 세포주 GK1.5 및 M5/114 항체의 상층액에서 negative selection 배지를 준비합니다. 상층액을 1:1 비율로 혼합하고 여과한 다음 나중에 사용할 수 있도록 4°C에서 보관합니다(각 항체의 >0.5μg/총 세포 100만 개). 또는 상용 CD8+ T 세포 분리 키트를 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>T 세포 활성화: 1x DPBS(칼슘 및 마그네슘 제외) 항체에 500μL의 CD3(10μg/mL) 및 CD28(16μg/mL) 항체를 비조직 배양(TC) 처리된 24웰 플레이트에 추가하고 플레이트 결합을 보장하기 위해 4°C에서 밤새 보관합니다. 참고: 항체 및 단백질은 일반 TC 처리된 것보다 TC를 처리하지 않은 배양 플레이트/접시를 더 잘 코팅하므로 TC를 처리하지 않은 배양 플레이트가 T 세포 생성에 사용됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>70μm 세포 여과기를 접시에 넣어 10cm 배양 접시(또는 이에 상응하는 것)를 준비하고 2mL의 R9 배지를 필터에 분배합니다(R9 배지: 10% FBS, 1% 항생제-항진균제, 20mM HEPES 완충액, 1% MEM 비필수 아미노산, 50μM β-메르캅토에탄올이 보충된 RPMI 1640x).</li>
	<li>실험 설계에 의해 결정된 적절한 유전적 배경, 성별, 연령 및 체중을 가진 마우스를 얻습니다.</li>
	<li>CO2 를 사용한 후 자궁 경부 탈구를 사용하거나 지역 동물 관리 및 사용 프로토콜에 의해 정의되고 기관에서 승인한 적절한 안락사 전략을 사용하여 마우스를 안락사시킵니다.</li>
	<li>마우스를 누운 자세로 놓고 네 팔다리를 모두 몸에 수직으로 뻗은 다음 마우스 해부 T 핀 또는 이와 동등한 핀을 사용하여 발판에 발판을 고정합니다. 마우스 수술용 해부 가위로 복부 하복부의 피부층을 통해 표재성 중앙을 절개하고 턱까지 직선(~8cm)으로 자릅니다. 복막 내벽에서 피부를 분리하여 림프절을 노출시킵니다. 몸통에서 피부를 수직으로 펴고 핀으로 고정합니다5.<ol><li>뭉툭한 집게(또는 표준 마우스 수술 해부 키트에서 선호되는 유형)를 사용하여 경추, 축, 상완 및 서혜부 림프절을 양측으로 부드럽게 절제합니다. 1.2단계에서 준비한 세포 여과기로 옮깁니다.</li>
		<li>복막을 열고 비장을 제거합니다. 1.2단계에서 준비한 세포 여과기로 옮깁니다.</li>
		<li>쥐 사체를 적절한 생물학적 위험 용기에 버리십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>1.2단계에서 2mL의 R9 배지를 사용하여 70μm 세포 여과기에 기계적 파괴에 의한 2차 림프 조직의 단세포 현탁액을 준비합니다. 조직 파괴 도구를 시계 방향 및 반시계 방향으로 반복적으로 1/2바퀴 돌립니다. 참고: 루어 락 주사기의 플런저 끝(3mL 또는 10mL)은 조직을 분쇄하고 균질화하는 데 효과적입니다. 대체 재료는 사용자의 재량에 따라 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>세포, 주사기 끝, 여과기 및 배양 접시를 7mL의 배지로 세척하고 여과기가 똑바로 유지되도록 하여 단일 세포 현탁액에 존재할 수 있는 더 큰 조직 조각 또는 세포 응집체가 전달되지 않도록 합니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>실온(20°C)에서 270 x g으로 5분 동안 세포를 펠렛하고 상층액을 디캔팅합니다.</li>
	<li>500μL의 용해 완충액을 1분 동안 첨가하여 적혈구를 제거합니다. 9.5mL의 R9 배지로 희석하고 270 x g(20°C)에서 5분 동안 회전합니다. 상층액을 디캔팅합니다.</li>
	<li>항-MHCII 및 항-CD4를 포함하는 이전에 제조된 음성 선택 배지 10mL에 펠릿을 현탁시킵니다(단계 1.1.1). 실온(20°C)에서 30분 동안 락합니다.</li>
	<li>세포를 270 x g 에서 5분 동안 펠릿하고 상층액을 디캔팅합니다. R9 배지 10mL로 3회 세척합니다.</li>
	<li>동시에 15mL 원뿔형 튜브에서 7mL의 배지에 200μL의 양 항쥐 IgG 비드를 세척합니다. 튜브를 자석에 놓고 매체를 제거한 다음 세탁 단계를 두 번 반복합니다. 비드를 7mL의 R9 배지에 재현탁시킵니다.</li>
	<li>270 x g (20 °C)에서 5분 동안 세포를 펠릿하고 상층액을 디캔팅한 다음 1.13단계에서 7mL의 비드 현탁액에 펠릿을 재현탁시킵니다. 실온(20°C)에서 45분 동안 흔들어 놓습니다.</li>
	<li>마그네틱 비드 고갈(magnetic bead depletion)을 통해 CD8+ T 세포를 농축합니다. 원뿔형 튜브를 뚜껑 없이 자석에 직접 올려 3분 동안 항체/비드 결합 세포를 제거합니다. CD8+ 세포는 유지되어야 합니다. 튜브가 여전히 자석에 있는 상태에서 혈청학적 피펫 또는 이와 동등한 것을 사용하여 세포 현탁액을 수집하고 새 15mL 튜브로 옮깁니다. 270 x g (20 °C)에서 5분 동안 원심분리하고 매체에서 3번 세척합니다.</li>
	<li>플레이트 바닥 표면에 직접 피펫팅하지 않고 사전 코팅된 활성화 플레이트(1.1.2단계)를 1x DPBS로 두 번 세척합니다.</li>
	<li>선택 사항: 죽은 세포를 제거하기 위해 살아있는/죽은 림프구 분리를 수행합니다.<ol><li>세포를 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 세포 현탁액 바닥에 2mL의 림프구 분리 배지를 부드럽게 추가합니다. 900 x g 에서 낮은 가속 및 감속으로 10분(실온에서) 원심분리합니다. 참고: 살아있는 세포는 배지와 분리 매체(중간 백색층)의 계면에서 분리됩니다. 죽은 세포는 튜브 바닥에서 펠릿으로 만들어지며 끝에서 버려질 수 있습니다.</li>
		<li>살아있는 림프구가 포함된 중간층을 새 튜브로 옮기고 실온에서 270 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 디캔팅합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>펠릿을 10U/mL 재조합 마우스 IL-2와 함께 12mL의 배지에 재현탁시킵니다. 비 TC 처리된 24웰 플레이트에서 웰당 1mL를 플레이트하고 밤새 37°C로 옮깁니다.</li>
</ol>2. 활성화된 CD8+ T 세포 리프팅
<ol><li>4x 또는 10x 대물렌즈를 사용하는 표준 탁상용 광학 현미경을 사용하여 세포를 시각화합니다. 참고: 활성화된 T 세포는 비활성화된 T 세포에 비해 더 크고 둥글거나 길쭉해 보이며 웰 전체에 조밀한 세포 클러스터가 있어야 합니다.</li>
	<li>활성화된 세포를 들어 올리려면 1mL 피펫으로 세포를 파괴하고 플레이트 가장자리에서 잘 섞이도록 합니다. 세포를 새로운 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 참고: 활성화된 세포는 더 끈적거리며 더 활발한 피펫팅이 필요합니다.</li>
	<li>R9 배지 1mL로 웰을 세척하여 남아 있는 세포를 제거합니다. 필요한 경우 한 번 더 반복합니다. 270 x g (20 °C)에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 상층액을 버립니다.</li>
	<li>1.17-1.18단계와 같이 죽은 세포를 제거하기 위해 살아있는/죽은 림프구 분리를 수행합니다.</li>
	<li>non-TC 6-well plate에서 IL-2와 함께 R9 배지에서 3-4일마다 살아있는/죽은 세포를 제거하여 T 세포를 유지합니다. 참고: T 세포는 초기 활성화 동안 작은 치수의 웰에서 더 잘 증식하는데, 이는 T 세포-T 세포 접촉 또는 T 세포 유래 용해성 인자가 활성화를 돕기 때문일 수 있습니다. 빠른 T 세포 증식은 배양 후 24-48시간 이내에 배양 배지를 황색으로 만듭니다. 이 시점에서 세포를 들어 올려 세포에 공급하기에 충분한 신선한 배양 배지(일반적으로 웰당 5mL)가 있는 더 큰 웰(코팅되지 않은, 비TC 6-웰 플레이트)로 옮깁니다. 고갈된 매체는 노란색 매체 색상 변경이 표시될 때마다 또는 3-4일마다 새 매체로 교체하십시오.</li>
</ol>3. 유리 접시의 준비
<ol><li>4°C에서 하룻밤 동안 300μL/cm2 Protein A(0.1mg/mL)로 코팅하여 유리 세포 이동 챔버 또는 플레이트를 준비하고 다음 단계로 이동하기 전에 접시에 분배하고 디캔팅하여 1x DPBS로 두 번 세척합니다.</li>
	<li>이동 챔버 또는 플레이트를 300 μL/cm2 재조합 마우스 ICAM-1 또는 VCAM-1 Fc 키메라(0.1-2.75 mg/mL)와 재조합 마우스 케모카인(0.1-10 μg/mL)으로 실온에서 2-3시간 동안 코팅합니다. 피브로넥틴(fibronectin), 마우스 콜라겐 IV(mouse collagen IV) 및 마우스 E-cadherin과 같은 다른 인테그린 리간드는 4°C에서 하룻밤 동안 2.5-10μg/mL로 챔버를 직접 코팅하도록 렌더링됩니다.<ol><li>접시에 디스펜싱하고 셀을 추가하기 직전에 디캔팅하여 1x DPBS로 챔버를 두 번 세척합니다. 참고: T 세포는 활성화, 분화, 감작 및 프라이밍 상태에 따라 다양한 농도의 인테그린 리간드 및 케모카인에서 다르게 이동할 수 있습니다. 다양한 농도에서 세포 이동을 분석하는 것이 강력히 권장됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>T 세포를 암세포와 같은 다른 세포와 공동 배양하는 경우 이미징 시작 24시간 전에 부착 세포를 유리 코팅된 플레이트에 플레이트하여 암세포의 T 세포 사멸을 실시간으로 측정합니다.</li>
</ol>4. 세포의 준비
<ol><li>선택 사항: 37°C에서 15분 동안 또는 제조업체의 프로토콜에 따라 1x DPBS에서 1 x 10 7 세포당 1 x 107 세포당 1μg/mL의 원하는 세포 추적기 염료를 사용하여 T 세포 및 부착 세포를 염색합니다.</li>
	<li>혈구계 또는 이와 동등한 것을 사용하여 세포를 계수합니다.</li>
	<li>37 °C 챔버에서 1-5 g/L 포도당이 보충된 Leibovitz의 L-15 배지에 있는 플레이트 1 x 105 CD8+ T 세포(또는 원하는 양). 알림: L-15 매체는 CO2-중탄산나트륨 시스템 없이 사용하도록 제조되었습니다. 유리 염기성 아미노산, 인산염 완충액 및 갈락토스를 사용하여 완충되어 pH 수준을 유지합니다.</li>
	<li>선택 사항: 인테그린 블로킹을 수행합니다.<ol><li>인테그린(1-10 μg/mL, anti-mouse CD11a(M17/4), anti-mouse CD18(M18/2), anti-mouse VLA-4(9C10)에 대한 차단 항체로 T 세포를 10분 동안 사전 배양하고 동일한 항체가 있는 상태에서 크롤링할 수 있도록 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 타임랩스 현미경
<ol><li>비디오 현미경 검사를 수행합니다.</li>
	<li>T 세포의 경우, 10-60분 동안 10-60초마다 명시야 및 형광 이미지를 획득하거나 원하는 획득 설정을 획득합니다. 참고: T 세포 이동은 온도에 민감하며 마우스 T 세포 이동을 위한 최적의 온도는 37°C입니다. 이 프로토콜이 사용하는 온도 제어 시스템은 가열 시스템이 부착된 밀폐형 및 절연 현미경 데크로 구성됩니다. 이미징 챔버는 이미징 데크에 있습니다. 이 챔버의 둘레에는 이미징 중에 일관된 열과 습도를 허용하는 증류수로 채워진 우물이 있습니다. 마이크로웰은 이미징 챔버의 중앙에 위치합니다.</li>
</ol>6. T 세포 이동에 대한 소프트웨어 지원 분석
<ol><li>Volocity 소프트웨어를 사용하여 T 세포 이동을 평가할 수 있습니다.<ol><li>Volocity를 열고 새 이미지 시퀀스를 만듭니다.</li>
		<li>모든 타임랩스 비디오 현미경 동영상을 선택하여 Volocity의 파란색 영역으로 이동합니다.</li>
		<li>대비 향상 도구를 사용하여 연구자가 원하는 설정으로 밝기와 대비를 조정합니다.</li>
		<li>이미지 크기 확인: 20x의 경우 0.325μm, 10x의 경우 0.65μm.</li>
		<li>순서: 시점을 설정합니다(예: 20분 동안 15초마다 이미지를 촬영하는 경우 81개 이미지, 분당 4개).</li>
		<li>측정 탭에서 모든 시점을 선택 취소합니다.</li>
		<li>강도를 사용하여 물체를 찾고 막대를 밀어 피크의 바로 오른쪽에 오도록 합니다.</li>
		<li>크기별로 개체 제외: 직경이 10μm보다 작고 100μm보다 큰 모든 셀은 셀 파편 또는 비세포 입자를 제외합니다. 기록 시간의 20% 미만 동안 이동하는 T 세포는 제외합니다(각 연구자의 정의에 따라 다를 수 있음).</li>
		<li>정적 개체를 무시 합니다(확인란).</li>
		<li>끊어진 tract를 자동으로 결합 합니다(확인란).</li>
		<li>최단 경로를 20μm 이하로 설정합니다.</li>
		<li>셀 이동 추적은 시간이 지남에 따라 동일한 셀의 위치를 연결하는 선입니다. 추적 알고리즘이 각 프레임의 세그멘테이션을 통해 개별 개체가 감지되는 위치를 감지하여 추적하고 있는지 확인하고 개체가 프레임 간에 일치하는지 확인합니다.</li>
		<li>[Measurements] > [Save Protocol] > [Name New Protocol]을 선택하여 새 프로토콜을 저장합니다.</li>
		<li>측정 탭에서 모든 시점 측정을 클릭합니다.</li>
		<li>시간 범위(높음에서 낮음)별로 트랙을 정렬합니다.</li>
		<li>조사관이 정의한 대로 양호한 추적이 있는 모든 셀에 대한 추적 ID 번호를 기록합니다. 자동 세포 추적 후에는 잘못 식별되거나 끊어진 추적을 제외하기 위해 각 세포 추적에 대한 수동 평가가 필요합니다. 추적 결과가 잘못된 셀은 제외합니다.</li>
		<li>파일을 쉼표로 구분된 텍스트로 내보내고 원하는 분석 소프트웨어로 데이터를 전송합니다. 참고: 기본 매개변수: 속도(μm/min), 변위(순 이동, μm), 트랙 길이(총 경로 길이, μm) 및 구불구불한 지수(MI; 순 변위/트랙 길이. MI = 1은 완전히 직선 선형 트랙을 나타냄).</li>
	</ol></li>
	<li>이미지 J를 사용하여 수동 추적을 수행합니다.<ol><li>플러그인을 열고 추적 및 수동 추적을 선택합니다. 매개변수를 설정합니다 - 시간 간격, x/y 보정(픽셀 크기) 및 z 보정(수동 추적 모드에서). 트랙 추가를 클릭하고 첫 번째 시점에서 하나의 셀을 선택한 다음 모든 시점까지 계속하여 개별 셀 추적을 시작합니다. 그런 다음 트랙 종료를 클릭합니다. 관심 있는 모든 셀에 대해 이 작업을 반복합니다. 알림: 세포 추적을 위한 또 다른 도구인 Trackmate는 ImageJ 플러그인을 통해 사용할 수 있는 자동 추적 소프트웨어입니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

T-Cell Kinetics의 해명: 실시간 이동 분석 방법

<ol>
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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> J Cell Biol. 75 (2), 606-616 (1977).</li><li>Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhausted+mature+dendritic+cells+exhibit+a+slower+and+less+persistent+random+motility+but+retain+chemotaxis+against+ccl19.">Exhausted mature dendritic cells exhibit a slower and less persistent random motility but retain chemotaxis against ccl19.</a> Lab Chip. 22 (2), 377-386 (2022).</li><li>Harding, M. G., Zhang, K., Conly, J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+crawling+in+capillaries:+A+novel+immune+response+to+staphylococcus+aureus.">Neutrophil crawling in capillaries: A novel immune response to staphylococcus aureus.</a> PLoS Pathog. 10 (10), e1004379 (2014).</li><li>Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zanker, K. S., Dittmar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+migration+within+a+three-dimensional+collagen+matrix.">Analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix.</a> J Vis Exp. (92), e51963 (2014).</li><li>Wu, P. H., Giri, A., Sun, S. X., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+migration+does+not+follow+a+random+walk.">Three-dimensional cell migration does not follow a random walk.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 3949-3954 (2014).</li><li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li><li>Overstreet, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-induced+interstitial+migration+of+effector+CD4(+)+T+cells+is+dependent+on+integrin+&#945;v.">Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin &#945;v.</a> Nat Immunol. 14 (9), 949-958 (2013).</li></ol>

저자는 모든 연구 및 원고 준비가 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 수행되었다고 선언합니다.

생체 내 수렴 신호의 생물학적 영향을 이해하는 것은 어렵고 해석하기도 쉽지 않습니다. 본 명세서에 제시된 프로토콜은 고도로 정의되고 생물학적으로 유의미한 조건에서의 T 세포 이동을 이해하기 위한 합리적인 방법을 제공한다. 이러한 조건은 연구자의 재량에 따라 지정할 수 있으며 다양한 T 세포 집단, 활성화 상태 및 세포 표현형의 요구에 맞게 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 또한...

T 세포는 적응형 항원 특이적 면역 반응의 주요 효과인자입니다. 집단 수준에서 T 세포는 이질적이며, 뚜렷한 특수 기능을 가진 세포 하위 집합으로 구성됩니다. 중요한 것은 CD8+ T 세포가 면역 체계의 주요 세포 용해 효과인자로, 감염되거나 기능 장애가 있는 세포를 직접 제거한다는 것입니다1.
성숙한 CD8+ T 세포는 조직에 상주하며 항원을 찾기 위해 혈액과 림프관을 순환합니다. 감염 중에는 T 세포에 혈액이나 조직에 항원이 제시되고 비장이나 가장 가까운 배수 림프절로 빠르게 배출되어 생산적인 면역 반응을 시작합니다. 어느 경우에나, T 세포는 활성화되고, 클론 확장을 겪으며, 림프계가 혈액 속으로 들어가도록 내버려 둔다. 이 과정에서 세포내 신호전달은 림프 귀환 수용체(lymphatic homing receptor)의 하향 조절과 조직 특이적 이동에 필수적인 수많은 인테그린 수용체(integrin receptor)와 케모카인 수용체(chemokine receptor)의 상향 조절을 부여한다2. 궁극적으로, T 세포가 감염 부위로 직접 이동하는 것은 인테그린(integrin)과 케모카인(chemokine) 신호전달을 포함하는 환경적 신호의 수렴에 의해 주도됩니다.
케모카인은 크게 두 가지로 분류할 수 있습니다: (1) 분화, 생존 및 기초 기능에 필수적인 항상성 신호와 (2) 화학주성에 필요한 CXCL9, CXCL10, CCL3와 같은 염증 신호. 일반적으로 케모카인은 인테그린 발현1을 활성화하는 것 외에도 화학주성(chemotaxis)으로 알려진 방향성 이동을 촉진하는 신호 구배를 생성합니다. 화학주성은 미세하게 조절되고 매우 민감하며, T 세포는 특정 방향이나 위치로 유도할 수 있는 구배의 작은 변화에 반응할 수 있습니다.
이러한 T 세포 관련 요인 외에도 이동은 세포외 기질(ECM) 조성 및 밀도에 의해서도 영향을 받습니다. ECM은 콜라겐과 프로테오글리칸을 포함한 단백질의 조밀한 네트워크로 구성되어 있으며, 이들은 T 세포의 접착 인테그린 수용체에 대한 골격을 제공합니다. 인테그린(Integrins)은 다양한 막관통 단백질군으로, 각 단백질은 고도로 전문화된 결합 도메인과 다운스트림 신호 효과를 가지고 있습니다. T 세포 표면에서 인테그린 수용체의 동적 발현은 변화하는 환경에 빠르게 적응할 수 있도록 합니다3. 중요한 것은 인테그린이 ECM과 세포 내 세포골격 액틴 네트워크를 연결하여 T 세포 이동에 필요한 추진력을 생성한다는 것입니다.
요약하면, 이동 패턴은 면역 세포 표현형 또는 환경 신호에 따라 달라집니다. 이러한 복잡한 생물학적 과정은 T 세포, 주변 세포 및 국소적으로 감염된 조직의 표면에서 사이토카인, 케모카인 및 인테그린의 발현에 의해 엄격하게 조절됩니다. 생체 내에서, 이러한 이동 메커니즘은 복잡할 수 있으며, 여러 가지 부가적 신호(additive signal)4에 의해 발생할 수 있다. 이러한 복잡성으로 인해 겉보기에 서로 맞물려 있는 것처럼 보이는 변수 간의 인과 관계를 설정하는 것이 불가능할 수 있습니다. 이를 극복하기 위해 특정 케모카인 신호에 대한 반응 및 T 세포 인테그린과 ECM 결합 단백질 간의 상호 작용과 같은 T 세포 이동의 특정 측면을 연구하기 위한 몇 가지 시험관 내 접근 방식이 있습니다. 이 프로토콜은 2차원 공간에서의 체외 이동 분석과 지정된 T 세포 이동을 분석하기 위한 계산 분석 도구를 사용하여 쥐 CD8+ T 세포를 분리하고 활성화하는 방법을 다룹니다. 이러한 방법은 문헌에 기술된 일부 다른 세포 이동 분석법과 같이 정교한 재료나 장치를 필요로 하지 않기 때문에 사용자에게 유리합니다. 이러한 방법으로 생성된 세포 이동 데이터는 생체 내에서 정보에 입각한 추가 조사를 가능하게 하는 단순한 방식으로 면역 반응의 증거를 제공할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339650</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>without calcium and without magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate non-TC treated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3736</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>352350</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6KR centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Violet</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C34571</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Sorvall ST 16R</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen (IV)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354233</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>04200417C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Sheep anti-Rat IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag 15 Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12301D</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy sep mouse T cell isolation kit</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>19851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>F2442-500ML</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>10838039001</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td>http://fiji.sc/</td>
			<td>weblink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cubes</td>
			<td>Nikon or Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GK1.5</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HQ CCD camera</td>
			<td>CoolSNAP</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/h</td>
			<td>weblink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ automatic tracking plug in</td>
			<td></td>
			<td>http://imagej.net/TrackMate</td>
			<td>weblink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ manual tracking plug in</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</td>
			<td>weblink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15</td>
			<td>Various</td>
			<td>See Materials</td>
			<td>Medium Recipe: Leibovitz&#8217;s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liebovitz&#39;s L-15 medium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lok disposable syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-459</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphocyte separation medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-072-CI</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M5/114</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope heating system</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>okolab.com</td>
			<td>Custom designs available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell EZ slide</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C86024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mojosort mouse CD8+ Na&#239;ve T cell isolation kit</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse E-cadherin</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>8875-EC-050</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse surgical dissection kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-820-096</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-TC 24wp</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R9</td>
			<td>Various</td>
			<td>See Materials</td>
			<td>Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 &#956;M &#946;-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>796-IC-050</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>575410</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T pins</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S99385</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE2000-U microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Various recombinant mouse chemokine</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VCAM-1 Fc chimera</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>643-VM-050</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time in vitro migration assay for primary murine cd8+ t cells

적응 면역 반응은 병원체와 이물질에 반응하여 혈액, 림프 및 조직을 통해 이동하는 T 세포의 능력에 의존합니다. T 세포 이동은 케모카인, 케모카인 수용체 및 접착 분자를 포함한 환경 및 국소 면역 세포의 많은 신호 입력의 조정이 필요한 복잡한 과정입니다. 또한 T 세포 운동성은 활성화 상태, 전사 환경, 접착 분자 발현 등을 변경할 수 있는 동적 주변 환경 단서의 영향을 받습니다. 생체 내에서는 겉으로 보기에 서로 얽혀 있는 것처럼 보이는 요인들의 복잡성으로 인해 T 세포 이동에 기여하는 개별 신호를 구별하기 어렵습니다. 이 프로토콜은 매우 특정한 환경 조건에서 실시간으로 T 세포 이동을 평가하기 위해 T 세포 분리에서 컴퓨터 지원 분석에 이르기까지 일련의 방법을 제공합니다. 이러한 조건은 이동을 조절하는 메커니즘을 규명하고, T 세포 동역학에 대한 이해를 높이고, 동물 실험을 통해 얻기 어려운 강력한 기계론적 증거를 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다. 세포 이동에 영향을 미치는 분자 상호 작용에 대한 심층적인 이해는 개선된 치료법을 개발하는 데 중요합니다.

T cells are the major effectors of the adaptive, antigen-specific immune response. On a population level, T cells are heterogeneous, comprised of cellular subsets with distinct specialized functions. Importantly, CD8+ T cells are the main cytolytic effectors of the immune system, which directly eliminate infected or dysfunctional cells1.
Mature CD8+ T cells reside in tissue and circulate through blood and lymphatics in search of antigens. During infection, T cells are presented with antigens in blood or tissue and quickly drain to the spleen or nearest draining lymph node to begin a productive immune response. In either case, T cells become activated, undergo clonal expansion, and leave the lymphatic system to enter the blood, if not already there. During this process, intracellular signaling confers the downregulation of lymphatic homing receptors and the upregulation of numerous integrin and chemokine receptors essential for tissue-specific migration2. Ultimately, the directed migration of T cells to sites of infection is driven by converging environmental signals that include integrin and chemokine signaling.
Chemokines can be broadly categorized into two main classes: (1) homeostatic signals, which are essential for differentiation, survival, and basal function, and (2) inflammatory signals, such as CXCL9, CXCL10, and CCL3, which are required for chemotaxis. Generally, chemokines create a signal gradient that drives directional migration, known as chemotaxis, in addition to activating integrin expression1. Chemotaxis is finely regulated and highly sensitive, with T cells capable of responding to tiny changes in gradient that can lead them toward a specific direction or location.
In addition to these T cell-related factors, migration is also affected by the extracellular matrix (ECM) composition and density. The ECM is made up of a dense network of proteins, including collagen and proteoglycans, which provide the scaffold for adhesive integrin receptors on T cells. Integrins are a diverse family of transmembrane proteins, each with highly specialized binding domains and downstream signaling effects. Dynamic expression of integrin receptors on the surface of a T cell enables quick adaptation to their changing environments3. Importantly, integrins connect the ECM and intracellular cytoskeletal actin networks that work together to generate the propelling force required for T cell movement.
In summary, migration patterns vary based on the immune cell phenotype or environmental signals. These complex biological processes are tightly regulated by the expression of cytokines, chemokines, and integrins on the surface of the T cell, surrounding cells, and the local, infected tissue. In vivo, these migratory mechanisms can be&#160;complex and may result from several additive signals4. Due to this complexity, it can be impossible to establish a causal relationship between seemingly interlocked variables. To overcome this, there are several in vitro approaches to study specific aspects of T cell migration such as response to specific chemokine signals and the interaction between T cell integrins and ECM binding proteins. This protocol addresses methods to isolate and activate murine CD8+ T cells, with in vitro migration assays in two-dimensional space and computational analysis tools for analyzing specified T cell migration. These methods are advantageous to the user because they do not require sophisticated materials or devices, as with some other cell migration assays described in the literature. Cell migration data generated with these methods can&#160;provide evidence of immune responses in a simplistic manner that enables further, informed investigation in vivo.

저자 스포트라이트: T 세포 이동의 실시간 분석을 통한 질병 메커니즘 이해

일차 쥐 CD8+ T 세포에 대한 Real-Time In Vitro Migration Assay

The goal of our research is to understand T cell migration patterns in highly defined environmental conditions to enable informed in vitro experimentation and decipher molecular interactions impacting migration. Live imaging, such as intravital multiphoton microscopy, is used for in vivo understanding of immune cell kinetics. But microfluidic devices are a common in vitro tool that offer precise control over the microenvironment that cannot be afforded in a live specimen.Our protocol allows us to analyze intricate signaling pathways and provides better understanding for targeted in vitro experiments to further address the biological roles of individual signals in a cell type specific manner. Our method is simple, reproducible and easy to access in research labs that have a brightfield microscope featuring an attached digital camera. Therefore, our approach ensures a reliable set of methods to study dynamic cell migration events.Our lab will focus on investigating the migration of immune cells, including T cells and neutrophils in a variety of disease settings, such as tumors and infection, thereby comprehending the mechanisms that are important to regulate immune cell migration. This will help in developing the therapeutic methods to help treat and prevent disease.

T 세포 활성화의 확인은 유세포 분석을 통해 달성할 수 있으며, 쥐 T 세포에서 활성화의 표준 마커인 CD69 및 CD44의 발현 증가를 확인할 수 있습니다6. 또한 T 세포 집단의 순도는 CD3+ CD8+ T 세포에 대한 유세포 분석으로 측정할 수 있습니다. 이 방법은 >90 % CD8+ T 세포 집단을 생성합니다.
T 세포 이동은 연구자의 요구에 맞게 재현 가능하고...

이 프로토콜은 정량 분석을 통해 특정 환경 조건에서 T 세포 이동의 일차 쥐 T 세포 분리 및 타임 랩스 현미경 검사 방법을 제공합니다.

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign ...

우리 연구의 목표는 고도로 정의된 환경 조건에서 T 세포 이동 패턴을 이해하여 정보에 입각한 체외 실험을 가능하게 하고 이동에 영향을 미치는 분자 상호 작용을 해독하는 것입니다. 생체 내 다광자 현미경과 같은 실시간 이미징은 면역 세포 동역학의 생체 내 이해에 사용됩니다. 그러나 미세유체 장치는 살아있는 표본에서 감당할 수 없는 미세환경을 정밀하게 제어할 수 있는 일반적인 시험관 내 도구입니다.당사의 프로토콜을 통해 복잡한 신호 전달 경로를 분석할 수 있으며 표적 in vitro 실험에 대한 더 나은 이해를 제공하여 세포 유형별 방식으로 개별 신호의 생물학적 역할을 추가로 해결할 수 있습니다. 당사의 방법은 간단하고 재현성이 높으며 디지털 카메라가 부착된 명시야 현미경이 있는 연구실에서 쉽게 접근할 수 있습니다. 따라서 우리의 접근 방식은 동적 세포 이동 이벤트를 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 일련의 방법을 보장합니다.본 연구실은 종양 및 감염과 같은 다양한 질병 환경에서 T 세포 및 호중구를 포함한 면역 세포의 이동을 조사하여 면역 세포 이동을 조절하는 데 중요한 메커니즘을 이해하는 데 중점을 둘 것입니다. 이것은 질병을 치료하고 예방하는 데 도움이 되는 치료 방법을 개발하는 데 도움이 될 것입니다.

real-time-in-vitro-migration-assay-for-primary-murine-cd8-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-Time In Vitro Migration Assay for Primary Murine CD8+ T Cells

730 조회수.  University of Rochester. 우리 연구의 목표는 고도로 정의된 환경 조건에서 T 세포 이동 패턴을 이해하여 정보에 입각한 체외 실험을 가능하게 하고 이동에 영향을 미치는 분자 상호 작용을 해독하는 것입니다. 생체 내 다광자 현미경과 같은 실시간 이미징은 면역 세포 동역학의 생체 내 이해에 사용됩니다. 그러나 미세유체 장치는 살아있는 표본에서 감당할 수 없는 미세환경을 정밀하게 제어할 수 ?...

비디오: 저자 스포트라이트: T 세포 이동의 실시간 분석을 통한 질병 메커니즘 이해

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign bodies. T cell migration is a complex process that requires the coordination of many signal inputs from the environment and local immune cells, including chemokines, chemokine receptors, and adhesion molecules. Furthermore, T cell motility is influenced by dynamic surrounding environmental cues, which can alter activation state, transcriptional landscape, adhesion molecule expression, and more. In vivo, the complexity of these seemingly intertwined factors makes it difficult to distinguish individual signals that contribute to T cell migration. This protocol provides a string of methods from T cell isolation to computer-aided analysis to assess T cell migration in real-time&#160;under highly specific environmental conditions.&#160;These conditions&#160;may help&#160;elucidate mechanisms that regulate migration, improving our&#160;understanding of T cell kinetics and providing&#160;strong mechanistic evidence that is difficult&#160;to attain through animal experiments. A deeper understanding of the&#160;molecular interactions that impact cell&#160;migration is important to develop improved therapeutics.

This protocol providesa method of primary murine T cell isolation and time-lapse microscopy of T cell migration under specific environmental conditions with quantitative analysis.