이 프로토콜은 유압 파쇄가 근처 스트림의 박테리아에 영향을 미치는지 여부와 확장으로 스트림 자체에 대한 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 데이터 분석을 통해 샘플 수집에서 연구원을 취하므로 전체적인 특성입니다. 절차를 시연하는 것은 제레미 찬제, 내 실험실에서 생물 정보학자, 시드니 리갈, 주니아타 대학의 학부 생, 그리고 길리안 라이스터, 내 실험실 매니저입니다.
핵산 추출을 위한 퇴적물 샘플을 수집하려면 장갑을 사용하여 캡된 멸균 50 밀리리터 원컬 튜브를 해안에서 스트림 워터에 담급합니다. 튜브가 침수되는 동안 캡을 제거하고 캡을 사용하여 1~3센티미터 깊이에서 약 3밀리리터의 퇴적물을 튜브에 스쿱합니다. 샘플을 수집한 후, 튜브에서 약 1밀리리터의 물을 제외한 모든 것을 덤프하고 1, 000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 샘플에 DNA/RNA 방부제 3밀리리터를 첨가합니다.
캡된 원재료관을 5초 간 소용돌이치며 방부제를 철저히 혼합하고 샘플을 얼음에 보관합니다. 실험실로 돌아오면, 16S DNA 분석을 위해 영하 20도 또는 형이상술 RNA 분석을 위해 영하 70도의 샘플을 저장합니다. 필터 수집의 경우, 병을 마지막으로 채우기 전에 병을 세 번 스트림 물로 멸균 된 1 리터 병 전체를 완전히 채우고 비우면 병을 컨디셔닝하십시오.
안정된 표면에서는, 살균 루어 잠금 주사기에 스트림 물의 전체 볼륨을 끌어 서 멸균 및 DNA /RNA 무료 1.7 센티미터 직경 polyethersulfone 필터에 0.22 미크론 모공 크기. 필터를 통해 스트림 워터의 전체 볼륨을 플러시합니다. 전체 샘플 부피가 동일한 방식으로 여과된 경우, 약 20밀리리터의 공기를 주사기에 끌어들이고 필터를 통해 공기를 밀어 필터에서 여분의 물을 제거합니다.
다음으로, P1000 마이크로파이프를 사용하여 필터의 더 큰 개구부에 DNA/RNA 방부제 2밀리리터를 추가하여 필터의 배럴에 파이펫 의 끝과 함께 필터를 수평으로 유지하면서 방부제가 필터에 들어가는지 확인한다. 그런 다음 각 개구부 주변에 파라핀 필름의 단단히 포장 된 사각형으로 필터를 밀봉하고 얼음에 멸균 샘플 가방에 필터를 배치합니다. 샘플링에서 반환하면 16S 또는 메타전사 분석을 위해 필터를 저장하여 설명했습니다.
샘플 전송을 시작하기 전에 10 %의 표백제와 70 %의 에탄올로 작업 영역을 청소하십시오. 퇴적물 샘플에서 핵산 추출의 경우, 화염및 에탄올 멸균 금속 도구를 사용하여 약 250밀리그램의 샘플을 미세원심분리기 튜브로 이송하십시오. 필터 샘플에서 핵산 추출의 경우 70%에탄올및 화염 살균 된 바이스 그립을 사용하여 멸균 표면의 필터 케이싱을 열고 케이싱에서 코어를 제거하십시오.
멸균 메스를 사용하여 상단, 하단, 코어 의 솔기를 따라 슬라이스하고 멸균 핀셋을 사용하여 필터 용지를 접어 메스와 함께 작은 조각으로 절단하십시오. 그런 다음 필터 조각을 살균되지 않은 표면에 접촉하지 않고 미세 원심 분리기 튜브에 조심스럽게 배치합니다. 두 유형의 샘플 내의 세포의 용해의 경우 튜브를 고속으로 세포 파괴기로 치릅니다.
적어도 5 분 후, 원심 분리하고 새로운 멸균 미세 원심 분리기 튜브에 상체를 전송. 일대일 비율로 상체에 용해 버퍼를 추가하고 솔루션을 제공된 필터로 전송합니다. 필터를 새로운 미세원심분리기 튜브에 넣고 튜브에 400 마이크로리터의 준비 버퍼를 추가합니다.
원심 분리 후 700 마이크로리터의 세척 버퍼를 튜브에 넣고 필터를 원심분리합니다. 흐름을 폐기한 후 400마이크로리터의 세척 버퍼를 튜브에 추가하여 추가 원심분리를 하고 필터를 새로운 멸균 마이크로센심분리기 튜브로 옮긴다. DNA를 엘로우기 위해 실온에서 5분 동안 DNase/RNase 가 없는 물의 50마이크로리터로 필터를 처리합니다.
한편, 수집 튜브에 HRC 필터 3개를 넣고 HRC 준비 솔루션 600마이크로리터를 추가합니다. 원심분리 후 필터를 새로운 멸균 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 원심분리를 위한 필터로 용출된 DNA를 전달한다. 플로우스루에는 추출된 DNA가 포함되어 있습니다.
DNA 16S RNA 라이브러리를 만들기 위해 먼저 표준 PCR 프로토콜을 사용하여 16S 리보소말 RNA 증폭을 위해 DNA 생성물을 갓 추출한 것을 사용한다. 생성된 PCR 제품의 7개의 마이크로리터와 13마이크로리터의 DNase 없는 물을 혼합하고 PCR 용액을 2% 아가로즈 젤에 적재합니다. 그런 다음 60~90분 동안 90볼트에서 젤을 실행하여 386개의 베이스 쌍의 대역 크기를 성공적으로 증폭의 증거로 확인합니다.
DNA 16S 리보소말 RNA 라이브러리를 정화하기 위해, 밝은 밴드를 산출한 PCR 제품의 10마이크로리터와 멸균 미세 심분리기 튜브에 희미한 밴드를 산출한 샘플의 13 마이크로리터를 풀로 하고, 풀이 된 각 샘플의 약 150~200나노그램을 새로운 2% 젤의 개별 우물로 적재합니다. 입증된 바와 같이 젤을 실행한 후, 젤에서 386개의 베이스 페어 밴드를 소비하고 상업용 키트를 사용하여 DNA를 정화합니다. 그런 다음 10 밀리머 트리스 염산염의 30 마이크로 리터로 정제 된 DNA를 엘테우고 다음 세대 시퀀싱을 위해 출하하기 전에 건조 얼음에 정제 된 라이브러리를 포장합니다.
이 대표적인 분석에서는 하나를 제외한 모든 추출이 성공적이라고 불립니다. PCR 증폭 에 따라 관찰 된 밝은 밴드는 16S 프로토콜에 대한 성공을 나타냅니다. 16S 샘플은 최소 5, 000이상의 최소 1, 000 시퀀스를 가져야 하며, 형이상술 샘플은 최소 200만 개의 이상적 시퀀스를 갖는 500, 000 시퀀스를 가져야 합니다.
16S 및 메타전사학 분석을 위한 13개의 상이한 스트림에서 21개의 다른 사이트에서 퇴적물 견본이 도시된다. 그 21개 사이트 중 12개 사이트는 파쇄 활동의 하류에 있었고 유압 파쇄 양성으로 분류되었으며, 9개는 파쇄 활동의 상류 또는 파쇄가 부재하고 유압 파쇄 음수로 분류된 분수령에 있었습니다. PERMANOVA 분석에 의해 평가된 바와 같이, 유압 파쇄 양성 데이터와 음수 데이터 사이의 분리는 유압 파쇄 양성 샘플이 파쇄에 의해 영향을 받았다는 것을 시사한다.
가장 중요한 임의 포리스트 예측 변수는 샘플을 올바르게 차별화하는 데 가장 중요한 기능을 나타냅니다. 임의포리스트 모델에 의해 중요한 분류가 확인되면, 유압 파쇄 양성 샘플의 항균 저항 프로파일은 음극응성 시료를 파쇄하는 유압의 프로파일과 비교할 수 있습니다. 그(것)들이 크게 다르면, 그 생물분해를 포함하는 파쇄 액체가 스트림에 들어갔다는 것을 건의할 수 있었습니다.
미생물은 어디에나 있으므로 오염은 이러한 유형의 작업에서 중요한 잠재적 인 문제입니다. 초기 샘플 전송 단계는 특히 이에 취약합니다. 하나는 미생물 생분해 또는 다른 신진 대사에 관심이있는 경우, RNA의 산탄총 염기서열분석 활성 미생물 유전자 발현을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
이 기술은 세균성 서열 데이터의 생물정보학 분석뿐만 아니라 시상 세균 계류를 조사하기 위한 분자 기술의 표준화를 허용합니다.
