갈색 지방 조직의 생물학적 측면을 조사하려면 정제된 갈색 지방 크기를 제거하는 것이 필수적입니다. 현재 갈색 지방 크기 정제가 제공되지 않았으며 질량을 사용할 수 있습니다. 이 연구에서는 이 문제를 해결하기 위한 간단한 프로토콜을 개발했습니다.
이제 이 프로토콜에 한 가지 기술이 필요합니다. 다른 방법보다 훨씬 적은 연구 재료가 필요하며 정제 된 갈색 지방 크기는 유전자 및 단백질 발현 분석에 직접 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 고전적인 갈색 지방 크기의 생물학을 연구하는 새로운 방법을 제공합니다.
백색 지방 세포 갈변 과정을 연구하는 데에도 적용 할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 조교 인 Amanda가 될 것입니다. BAT와 소화 용액이 담긴 플라스크를 섭씨 35도 인큐베이터에서 분당 60회전으로 자석 교반기에 30분 동안 두는 것으로 시작합니다.
1 밀리리터 피펫을 사용하여 교반기 바 주변의 BAT 슬라이스의 응집 된 조직 덩어리를 방해하십시오. 분해 후 깨끗한 50밀리리터 원심분리 튜브 위에 70마이크로미터 여과기 필터를 놓고 스트레이너를 통해 약 4밀리리터의 세포 현탁액을 피펫으로 만듭니다. 그런 다음 4 밀리리터의 12 % 요오드 딕산올 용액으로 씻으십시오.
세포를 요오드 잔산 용액과 혼합하기 위해 위아래로 피펫 한 다음 세포 혼합물을 두 개의 투명한 5 밀리리터 폴리스티렌 시험관으로 옮깁니다. 셀 혼합물이 들어있는 폴리스티렌 튜브를 얼음 위에 1 시간 동안 놓아 BA가 상단에 층을 형성하도록합니다. 현미경 검사를 위해 분리된 BA 20마이크로리터를 꺼냅니다.
RNA 및 단백질 분리를 위해 BA 층을 두 개의 1.7 밀리리터 마이크로 센터 퓨지 튜브에 피펫팅합니다. 그런 다음 BA 층을 손상시키지 않고 과도한 요오드 용액을 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 1밀리리터의 TRIzol을 세포 용액에 첨가하여 RNA, DNA 및 단백질을 동시에 분리하고 세포를 용해시키기에 충분히 혼합합니다.
상을 분리하려면 섭씨 4도에서 10 분 동안 9, 981 G의 튜브에 200 마이크로 리터의 클로로포름과 원심 분리기를 첨가하십시오. 원심분리 후, RNA 분리를 위해 수성 상을 사용한다. 300 마이크로 리터의 유기상을 2 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 옮기고 750 마이크로 리터의 100 % 에탄올을 첨가하십시오.
10 초 동안 볼텍싱 한 후 200 마이크로 리터의 1- 브로 모 -3- 클로로 프로판을 넣고 10 초 동안 다시 와동시킵니다. 10초 동안 볼텍싱하기 전에 600마이크로리터의 이중 증류수를 추가합니다. 혼합 용액을 실온에서 10 분 동안 그대로 두십시오.
원심 분리 후 섭씨 4도에서 10 분 동안 9, 981G을 첨가하십시오. 단계는 중간층에 국한된 단백질 상과 분리됩니다. 상단 수용액을 제거하고 나머지 용액에 100 % 에탄올 1 밀리리터를 첨가하십시오.
섭씨 4도에서 10 분 동안 9, 981 G에서 원심 분리 한 후, 상청액을 버리고 100 % 에탄올 1 밀리리터로 펠렛을 세척한다. 섭씨 4도에서 10 분 동안 9, 981G에서 원심 분리기. 상층액을 제거한 후, 펠렛을 실온에서 10분 동안 자연 건조시키고 습윤 펠렛의 무게를 측정하였다.
펠릿 밀리그램 당 1 마이크로 리터의 비율로 20 % SDS 용액을 첨가하십시오. 튜브를 섭씨 55도 및 11G의 가열 셰이커에 5-10분 동안 넣어 펠릿을 완전히 녹입니다. 프로토콜에서 3%BSA를 포함하는 PBS는 BAT에서 BA를 분리하는 데 사용되었습니다.
분리된 세포는 내부에 다안 지질 방울이 있는 라즈베리 모양이었고 tdTom 양성으로 BA임을 확인했습니다. 단백질을 개선된 GTPC 프로토콜로 BAs로부터 분리한 다음, SDS-PAGE 겔로 검사하였다. BSA와 관련된 우성 밴드가 BA 샘플에서 관찰되었으며, 이는 단백질 추출에 대한 간섭을 시사합니다.
BSA 간섭을 피하기 위해 전형적인 라즈베리 모양을 갖고 다안 지질 방울을 포함하는 BA의 분리를 위해 6% 요오드 용액을 사용했습니다. 이들 BA로부터 추출된 단백질은 SDS-PAGE 겔에서 잘 분리되었다. 이 세포는 tdTomato 양성인 반면 펠릿에서 회수된 세포는 명백한 지질 방울이 없는 tdTomato 음성으로 밝혀졌으며, 이는 비지방 세포에서 BA를 효율적으로 분리함을 시사합니다.
유전자 발현 분석에서, UCP1 및 PDGFA의 mRNA 수준은 단리된 BA에서 유의하게 더 높았다. 그러나 PDGFRA의 mRNA는 BAT에서만 검출되었습니다. UCP1 단백질은 분리된 BA에서 풍부하게 발견되었다.
EDGFR 알파는 BAT에서 검출되었지만 분리 된 BA에서는 검출되지 않았습니다. 이러한 결과는 BA를 분리하는 방법의 효율성을 확인하고 분리된 BA가 유전자 및 단백질 발현 연구에 적합하다는 것을 입증합니다. 이 프로토콜을 시도할 때 신선한 소화 완충액을 사용하여 갈색 지방 조직을 해리하고 소화 기간 동안 조직 덩어리 형성을 피하십시오.
이 새로운 방법을 사용하면 단일 세포 탭 수준에서 갈색 지방 조직의 생물학을 쉽게 조사 할 수 있습니다. 이 방법을 적용하면 원래 무지방 세포에서 오염에 대한 걱정 없이 갈색 지방 세포 유전자 발현 프로그램을 정밀하게 해부하는 순수한 갈색 지방 세포로 GN 및 단백질 발현 연구를 수행할 수 있습니다.
