여기서는 결정성 셀룰로오스 함량의 추정을 위해 세계에서 가장 널리 사용되는 방법인 Updegraff 방법을 시연합니다. 셀룰로오스는 기본적으로 베타-1, 4 글리코시딕 결합에 의해 연결된 포도당 단량으로 구성됩니다. 이 프로토콜을 5단계로 나누었습니다.
1단계에서는 식물 바이오매스 물질을 준비합니다. 두 번째 단계에서는 조세포벽을 추출합니다. 3단계에서는 Updegraff가 아세트산과 질산으로 구성된 Updegraff 치료를 사용하여 샘플에서 헤미셀룰로오스와 리그닌을 제거하는 데 도움을 줍니다.
네 번째 단계에서는 포도당 단량체를 생산하는 황산의 도움으로 산 성 가수 분해를 받습니다. 마지막으로, 다섯 번째 단계에서는 결정성 셀룰로오스 함량을 추정하기 위해 왕좌의 분석방법을 사용합니다. 온실에서 식물 재료를 수집하고, 물로 철저히 씻고, 2 일 동안 공기 건조하고, 조직을 분리하고 개별적으로 표시된 용기로 조직을 옮기고 10 일 동안 49도 Centigrade에서 인큐베이터에서 인큐베이터에 인큐베이션하십시오.
그런 다음 마지막으로 가위 나 블레이드를 사용하여 조각으로 자른다. 조직을 동결하고 박격포에 적재하고 균일 한 분말로 미세 분쇄하거나 냉동고 / 밀을 사용하십시오. 여기에서는 냉동고/밀을 사용하여 티슈 샘플을 이 연삭 유리병에 적재하고 냉동고/밀에 넣고 3사이클동안 10CP 속도를 실행합니다.
조직 분말은 여기에 표시된 대로 팔콘 튜브에서 수집됩니다. 20 mg의 티슈 파우더를 계량하고 미리 계량된 2mL 튜브로 전달합니다. 단백질 용해성 버퍼 1mL를 추가하여 단백질을 제거합니다. 소용돌이.
원심분리기 15, 000 RPM5분. 상부체를 폐기합니다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다.
유지된 펠릿에 멸균 수1mL를 추가합니다. 소용돌이. 원심분리기 15, 000 RPM5분. 이 단계를 두 번 더 반복합니다.
유지 된 펠릿에 70 %의 에탄올 1 ML을 추가합니다. 소용돌이. 예열된 70도 섭씨 블록으로 1시간 동안 동시 흔들림이 있는 블록으로 옮겨보겠습니다. 1시간 배양 후 원심분리기는 15, 000 RPM에서 5분간.
이 단계를 한 번 더 반복합니다. 저장된 펠릿에 100% 메틸론1mL을 추가합니다. 소용돌이. 원심분리기 15, 000 RPM5분.
클로로폼 메탄올 1mL를 추가합니다. 소용돌이. 원심분리기 15, 000 RPM5분. 상체를 버리고 아세톤의 1mL를 추가합니다. 소용돌이.
실온에서 5분간 배양하세요. 원심분리기 15, 000 RPM5분. 상체를 다시 버리고 공기는 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 건조하거나 진공 건조로 계속하십시오.
샘플을 진공 건조기와 2~3시간 동안 또는 펠릿이 완전히 건조할 때까지 공기 건조에 실어 줍니다. 이전 단계에서 얻은 세포벽 추출물의 5 mg의 무게를 측정한다. 두 mL 나사 캡 튜브로 전송합니다.
또한이 시점에서 긍정적 인 제어를 포함한다. 그 목적을 위해 Whatman 필터 용지의 두 mg을 사용합니다. 두 mL 나사 캡 튜브로 전송합니다.
각 계량 세포벽 추출물에 Updegraff 시약 1.5mL를 추가합니다. 소용돌이와 30 분 동안 예열 된 블록에서 섭씨 100도에서 배양. 30분 간 인큐베이션 후 랙으로 옮김합니다.
벤치에서 10분 동안 식힙니다. 15, 000 RPM에서 10분 동안 원심분리기. 펠릿을 방해하지 않고 상체를 버리십시오.
멸균 물 1mL를 추가합니다. 소용돌이. 15, 000 RPM에서 10분 동안 원심분리기. 상수의 500 마이크로 리터를 폐기하십시오.
아세톤 1mL를 추가합니다. 소용돌이. 원심분리기 15, 000 RPM5분. 상체의 1mL를 폐기합니다.
아세톤 1mL를 추가합니다. 소용돌이. 원심분리기 15, 000 RPM5분. 상신을 완전히 버리십시오.
아세톤 1mL를 추가합니다. 소용돌이. 원심분리기 15, 000 RPM5분. 상부체를 폐기합니다.
하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 건조하십시오. 하룻밤 잠복 후 랙으로 옮김하십시오. 67%의 황산 1mL를 추가합니다. 소용돌이.
동시 흔들림으로 섭씨 25도에서 1시간 동안 배양합니다. 1시간 동안 잠복한 후 펠릿이 완전히 용해되었는지 확인하십시오. 랙으로 옮기.
이것은 셀룰로오스 추출의 마지막 단계입니다. 이제 샘플이 샘플 희석을 할 준비가 되었습니다. 시료 희석의 경우 이전 단계에서 각 샘플의 10 마이크로리터를 사용하고 멸균 수490 마이크로리터를 추가하십시오.
모든 실험 샘플에 대해 이 것을 반복합니다. 포도당 표준 곡선 준비를 위해, mL 포도당 1 mg의 신선한 육수를 준비하고 20 마이크로 리터 단위로 mL 포도당 1 mg을 추가하여 20 마이크로 그램 농도에 0 마이크로 그램을 준비하고 멸균 물로 1 mL에 최종 볼륨을 구성합니다. 스크류 캡 튜브에 각 준비된 표준의 500 마이크로리터를 가지고 1 mL 0.2%의 왕좌를 추가하십시오.
그리고 이제 샘플은 왕좌 분석에 대한 준비가되어 있습니다. 갓 준비된 왕좌 1mL을 추가합니다. 소용돌이를 통해 즉시 섞어서 얼음으로 옮으세요.
동일한 방식으로 모든 표준 및 샘플을 반복합니다. 그런 다음 10 분 동안 예열 된 100도 섭씨 블록으로 옮겨. 10분 간 인큐베이션을 한 후 얼음으로 옮기고 얼음 위를 5분간 배양합니다.
인큐베이션 후 각 샘플의 200 마이크로리터를 3개의 복제로 섭취하십시오. 동일한 방식으로 표준과 샘플 모두에 대해 반복합니다. 그리고 로드 된 96 웰 플레이트멀티 모드 검출기에로드되었다.
스마트 맥스 프로 프로그램을 사용하여 필터 설정을 620나노미터로 설정했습니다. 플레이트 타입을 96웰 타입으로. 모든 읽기 영역을 선택합니다.
확인을 클릭합니다. 읽다. 접시를 읽습니다. 셀룰로오스 함량의 추가 분석 및 추정을 위해 Excel 시트에서 수집되는 표준 및 샘플 모두의 흡광도 판독값을 얻을 수 있습니다.
포도당 표준 곡선은 x 축에 mL 당 마이크로그램의 포도당 농도를 사용하고 y축에서 620 나노미터에서 각각농도의 정규화된 흡광도 값을 이용하여 제조된다. 샘플 결정 셀룰로오스 함량을 추정하는 데 사용하는 플롯된 산란 그래프에서 m 및 c 값으로 회귀 선을 얻습니다. 첫 번째 단계에서는 OD 값을 평균 620 나노미터로 측정했습니다.
그런 다음 빈 값을 빼서 데이터를 정규화했습니다. 우리는 표준 곡선에서 회귀 라인의 이전 단계에서 c 및 m 값을 연결하는 OD 마이너스 c/m과 동일한 수식 x를 사용하여 포도당 농도를 계산합니다. 왕좌 분석에 사용 된 총 볼륨은 500 마이크로 리터이기 때문에 희석 계수 2로 나눕니다.
사용된 견본 부피는 단지 10 마이크로리터이기 때문에, 우리는 mL 농도 당 mg과 동일한 포도당의 마이크로 리터 농도 당 마이크로 그램을 얻기 위하여 10에 의해 더 분할할 것입니다. 그리고 그 과정에서 수분 이득인 수분계 1.11을 사용했습니다. 그리고 마지막으로, 우리는 5 mg에 가까운 세포벽 무게로 분할하여 백분율 결정 셀룰로오스 함량을 계산하고, 백분율을 얻기 위해 100으로 곱합니다.
그런 다음 3개의 생물학적 복제의 결정성 셀룰로오스 함량을 평균화하여 개별 샘플에 대한 값을 얻었으며, 이는 3개의 생물학적 복제의 또 다른 실험 라인 평균과 비교될 것입니다. 그리고 t-테스트는 그들의 중요성의 수준을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서 표 A에서, 우리는 620 나노미터에서 각각의 OD의 테이블 값을 나타내며, 이는 두 실험 라인 간의 셀룰로오스 함량 차이를 얻기 위해 C에서 사용된 m 및 c 값으로 산란 그래프 및 회귀 라인을 더 플롯하는 데 사용되었다.
결론적으로, 두 샘플 모두 셀룰로오스 차이를 보여줍니다. 시청해 주셔서 감사합니다.
