현미경 이미지는 고급 현미경의 미시간 주립 대학 센터의 서비스를 통해 실시되었다. 옥수수 캘러스 아이오와 주립 대학의 옥수수 변환 센터에서 구입했다. 저자는 탄수화물 분석에 대한 기술적 인 지원을 MSU 식물 연구소의 제프리 R. 웨더에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 관대 미시간의 옥수수 마케팅 프로그램 (CMPM) 및 식물 생명 공학 연구를위한 컨소시엄 (CPBR)에 의해 투자되었다.

1. ZmCCR1의 아래 규제에 사용 dsRNAi 구문의 준비 <ol><li> dsRNAi 노크 아웃에 ZmCCR1 유전자를 구성하기 위해 필요한 제한 효소 사이트를 포함한 디자인 유전자 특이 적 프라이머. 두 개의 프라이머 세트는 ZmCCR1의 cDNA의 두 조각 세그먼트를 증폭하도록 설계되었습니다 :. 1271 뉴클레오티드 748에서 523 bp의 단편, 그리고 1271 뉴클레오티드 986에서 285 bp의 단편 ZmCCR1의 cDNA는 애리조나 게놈 연구소 (AGI)에서 제공되었다. 더 자세한 내용은 그림 1에 설명되어 있습니다. </li><li> ZmCCR1_748F_BglII 프라이머 (5&#39;-AGATCTACATCCTCAAGTACCTGGAC-3 &#39;)와 ZmCCR1_1271R_NcoI (5&#39;-CCATGGTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3&#39;)를 사용하여 cDNA를 ZmCCR1 템플릿으로부터 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 큰 단편을 증폭한다. ZmCCR1_986F_BglII 프라이머 (5&#39;-AGATCTGGAAGCAGCCGTACAAGTTC-3 &#39;)와 ZmCCR1_1271R_SacI (5R을 이용하여 더 작은 프래그먼트 (285 BP)를 증폭17]-GAGCTCTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3 &#39;). </li><li> 개별 제조업체의 지침에 따라을 pGEM-T 쉬운에 조각을 결찰. </li><li> 각각 포함, 개별 형질 전환 체로부터 미니 준비 플라스미드 DNA 분리를 수행을 pGEM-T 상용 미니 준비 플라스미드 키트를 사용하여 구성합니다. </li><li> 두 다이제스트에 BglII과를 NcoI 모두와을 pGEM-T :: ZmCCR1 (523 BP)과 ImpactVector (IV) -1.1 (세포질 발현 벡터). </li><li> IV-1.1 정제 소화 젤로 큰 소화 겔 정제 ZmCCR1 조각 (523 BP)을 결찰. </li><li> IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 BP)에 작은 조각을 삽입하기 위해 BglII에와 SacI에 모두을 pGEM-T :: ZmCCR1 (285 BP)와 IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 BP)를 소화. </li><li> IV-1.1 정제 소화 겔 :: ZmCCR1 (523 BP)에 작은 소화 겔 정제 ZmCCR1 조각 (285 BP)을 결찰. </li><li> 523 BP 285 BP의 fragmen 모두 복제거꾸로 반복 조각의 중간에 238 bp의 스페이서 (그림 1 참조)와 285 bp의 역 반복 서열을 가지는 ZmCCR1의 RNAi가 구성 할 수있는 IV-1.1에 TS. </li><li> 이 대장균 (대장균)에 구축 이동, 그들을 성장과 옥수수 유전자 변형에 대한 충분한 플라스미드 DNA를 얻기 위해 미디 준비 크기의 플라스미드 DNA 분리를 수행합니다. </li></ol> 2. 유전자 변형 옥수수 <ol><li> 텅스텐 입자의 제조 <ol><li> 1.5 ML 튜브에 텅스텐 구슬 60 밀리그램 (M10)을 넣고 2 분 동안 소용돌이로 교반하여 70 % 에탄올 1 ㎖로 씻는다. 23 ° C에서 10 분 동안 배양 한 다음 2 분 동안 18,894 XG에서 원심 분리하고 상층 액을 버린다. </li><li> 2 분 동안 원심 분리하고 상층 액을 버리고, 1 ㎖ 100 % 에탄올로 3 회 씻는다. 60 ㎎ / ㎖로 미세 입자의 농도를 가지고 멸균 50 % 글리세롤의 1 ML을 추가합니다. </li></ol></li><li> 사격에 대한 DNA의 준비 <ol><li> 경기 수1.5 ML 튜브에 50 % 글리세롤 제조 텅스텐 구슬의 50 μL (3 mg)을 에이스. IV-1.1의 5 μL (1 μg) :: ZmCCR1 RNAi의 플라스미드 DNA, 2.5 M 염화칼슘의 50 μL, 0.1 M 스퍼 미딘의 20 μl를 추가합니다. 간단히 위의 시약의 각 추가 사이의 소용돌이. </li><li> 소용돌이 30 초 동안 18,894 XG에 텅스텐 비드 DNA 혼합물 간단히 원심 분리기. 뜨는을 붓고, 70 % 에탄올 140 μL에 펠렛을 재현 탁. 액체를 제거하고 폐기. 100 % 에탄올 140 μl를 추가합니다. 액체를 제거하고 폐기. </li><li> 100 % 에탄올 48 μl를 추가합니다. 이전의 폭격에 최대 4 시간 동안 즉시 사용하거나 얼음에 저장합니다. </li></ol></li><li> 충격 <ol><li> 32 (osmotium로) 적어도 4 시간 전에 폭격에 N6OSM 미디어를 포함하는 100mm 배양 접시의 중간에 (아이오와 주립 대학의 옥수수 변환 센터에서 제공) 3-5 cm 직경 안녕-II 배 발생 옥수수 캘러스를 놓습니다. </li><li> Prepar제조업체의 지침 33에 따라 전자 PSD-1000/He 입자 전달 장치. </li><li> 70 % 에탄올로 챔버 벽을 살균. 멸균 고정 캡으로 멸균 650 PSI 파열 디스크를 넣습니다. 마크로 캐리어, 건조 잠깐의 표면에 M10-DNA 솔루션 5-6 μl를 확산. 로드 마크로 캐리어 및 마이크로 캐리어 발사 어셈블리로 화면을 중지. </li><li> 정지 화면 (L2 = 6 CM) 및 가까운 문에서 선택한 거리에서 챔버에서 마이크로 캐리어 발사 조립 및 옥수수 캘러스를 놓습니다. 와이어 메쉬 스크린에 대해 27 PSI의 진공 가속화. </li><li> 파열판 버스트 및 헬륨 압력 게이지가 제로로 떨어질 때까지 화재 버튼을 누릅니다. 발사 버튼을 놓습니다. </li><li> 27 ° C에서 어둠 속에서 16 시간 동안 N6OSM (삼투 배지) (32)를 포함하는 페트리 접시에 포격 캘러스를 품어 약 10 조각으로 캘러스를 중단하고 N6E (캘러스 유도 배지)에 배양 접시에 32을 전송하고 5 일 동안 배양 난N 27 ° C에서 어둠. </li></ol></li><li> 선택 <ol><li> N6E 5 일 후, N6S 매체 (선택 미디어) 32에 캘러스를 전송합니다. 서브 컬쳐 선택 매체의 모든 캘러스 캘러스 구조를 방해하지 않고 8~12주마다 30 일. </li><li> 8 ~ 10 주 후, 흰색 빠르게 성장하는 부문은 비 증식 부분적으로 괴사 어머니 캘러스 밖으로 성장할 것입니다. 흰색 빠르게 성장하는 조직을 절제하고 신선한 선택 배지 (N6S) (32)을 배양하고 위의 배양을 계속합니다. </li></ol></li><li> 재건 <ol><li> 재생 매체 (32)에 흰색과 빠르게 성장하는 배아 캘러스를 전송하고 1 주 동안 위와 같이 품어. 25 ~ 27 ° C에서 16 시간의 일광과 8 시간의 어둠의 기간에 재생 배 발생 캘러스 스위치 </li><li> 회생이 응원에 3-4주 후 유리 테스트 튜브 매체 (32)를 촬영 전송, 상기와 같이 배양을 계속합니다. 상당한 연구 후OOT 개발은 토양 4 &quot;화분에 묘목을 이식 한 후, 물 꼭지에서주의 깊게 뿌리를 씻어 나타납니다. 촉촉하게 유지하기 위해 플라스틱 가방과 함께 냄비를 커버. 이일은 작은 구멍 비닐 봉투를 한 후. 5-6일 후 비닐 봉투를 제거합니다. 다른 5~6일 위와 같이 배양을 계속합니다. </li></ol></li><li> 온실 <ol><li> 토양 18 &quot;화분에 모종을 전송하고 전체 여름 햇빛 또는 온실 빛을 유지한다. 첫 번째 씨앗은 T 1 세대에 속하는 반면, 초기 재생 식물은 T 0이라고합니다. </li></ol></li></ol> 3. 조직 학적 분석 <ol><li><ol><li> 10 % 중성 포르말린 5 ㎖에 옥수수 잎 중순 갈비뼈를 고정합니다. </li><li> 공정 및 진공 티슈 프로세서를 사용하여 티슈 프로세서 파라핀으로 침투. </li><li> HistoCentre III 임베딩 스테이션을 사용하여 파라핀의 조직을 포함합니다. </li><li> 가장자리에서 초과 파라핀을 제거 한 번 블록KS는 냉각된다. </li><li> 마이크로톰을 사용하여 마이크로톰 4-5 μm의 섹션에 샘플. </li><li> 현미경 슬라이드 및 2-24 시간 동안 56 ° C 배양기에서 건조에 섹션을 배치합니다. 확인 섹션은 완전히 슬라이드에 부착되어 있습니다. </li><li> 23 ℃에서 5 분 동안 크실렌의 두 가지 사항에 Deparaffinize 섹션 </li><li> 수화물은 2 분 동안 100 % 에탄올 두 가지 변경, 23 ℃에서 2 분 95 % 에탄올의 두 가지 변경을 통해 슬라이드 </li><li> 2 분 동안 흐르는 수돗물에 섹션을 씻어. </li><li> 1 ~ 2 분 동안 0.05 % 톨루이딘 블루 O와 얼룩 DDH 2 O로 간단히 씻어 </li><li> 광학 현미경과 침수 오일 및 시각화 샘플을 커버 슬립을 놓습니다. </li></ol></li><li> 주사 전자 현미경 (SEM) <ol><li> 4 % 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde)의 횡단 옥수수 잎 중순 갈비뼈를 수정하고 1 ~ 2 시간 동안 4 ° C에서 0.1 M 인산 나트륨 완충액 (pH 7.4). </li><li> 간단히 버퍼의 샘플을 씻어, 그들에 탈수10 분, 3X 각 계조하고 100 % 에탄올에서 15 분 동안 에탄올 시리즈 (25 %, 50 %, 75 %, 95 %). </li><li> 과도 유체로서 액체 이산화탄소를 사용 임계점 건조기에서 탈수 횡단 옥수수 잎 중앙 리브 말린다. </li><li> 높은 진공 탄소 탭을 사용하여 알루미늄 스텁에 건조 된 샘플을 탑재 </li><li> 코트 옥수수 잎 중간 갈비 아르곤 가스로 치환 스퍼터 코팅기에 금 (약 20 nm의 두께)와 알루미늄 스텁에 장착. </li><li> JEOL JSM-6400V (란탄 hexaboride 전자 에미 터) 주사 전자 현미경에 코팅 된 샘플을 검사합니다. </li><li> 디지털 이미지는 분석 프로 소프트웨어 (버전 3.2)을 사용하여 묘사 하였다. </li></ol></li></ol> 4. Klason 리그닌 측정 <ol><li> 2 ㎜의 스크린 공장은 샘플. </li><li> 각 샘플의 수분 함량을 결정하고 값을 기록하는 수분 분석기를 사용한다. </li><li> ~ 각 샘플 1.5 g을 칭량하고 중량을 기록한다. Extract 자동화 된 용매 추출 (추출 당 3 회 ~ 사이클 당 14 분) 또는 속실 렛 장치 (추출 당 8 시간)을 사용하여 두 번째 추출 에탄올 다음에 제 1 추출, 물을 사용하여 샘​​플. (참고 :이 단계는 명백한 Klason 리그닌 함량이 증가, 산 가수 분해 동안 응축하고 정확한 리그닌 측정을 방해 할 수있는 추출액을 제거합니다.) </li><li> 밤새 45 ° C에서 추출 된 샘플을 건조하고이를 데시 케이 터, 다시 무게를 할 수 있습니다. </li><li> 30 ° C.에 인큐베이터를 설정 (샘플 당 삼중 권장) 나사 정상 고압 튜브에 각각 건조, 추출 된 샘플 0.3 g을 측정하고 가장 가까운 0.1 mg의 무게를 기록한다. 각 압력 튜브에 72 % H 2 SO 4 3 ㎖를 추가합니다. </li><li> 유리 또는 테플론 교반 막대를 사용하여 샘​​플을 섞는다. 물이 배양 한 다음 추가 될 때까지 튜브에 교반 막대를 둡니다. </li><li> 인큐베이터에 튜브를 놓고 그 자체30 ° C에서 60 분 동안 150 rpm의 t. 1 시간 후 4 %로 산 농도를 희석 교반로드와 혼합 탈 이온수 84 ㎖를 추가합니다. 물 라인 위의 유리 병의 측면에 샘플의 많은 양이 남지 않도록주의하십시오. </li><li> 단단히 모든 병의 마개를 밀봉 금속 랙 또는 큰 비커에 배치합니다. 1 시간 동안 액체 살균주기를 사용하여 121 ° C에서 압력솥. 그들을 열기 전에 실온으로 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 최소 4 시간 동안 575 ° C에서 가열로에서 필터링 도가니를 미리 재가. 도가니는 한 시간 이상 건조기를에 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 진공 도가니 확보 고무 어댑터를 이용하여, 별도의 도가니를 통해 각각의 튜브로부터 용액을 고를. 튜브에 남아있는 입자를 씻어 탈 이온수를 사용합니다. </li><li> 4 시간의 최소 105 ° C에서 리그닌 잔류 물을 건조. 건조 도가니 잔류의 무게를 기록한다. </li><li> 575 ° C를 사용하는 경우, 사전에- 화재 분젠 버너에 샘플이 더 연기 나 재가없는 한 후 24 시간 동안 가열로에 배치, 또는 프로그램 노를 사용하는 경우, - 재를 미리 다음과 같은 프로그램을 사용하지 않는 때까지 : </li><li> 105 ° C 상온에서 진입로와 12 분 동안 누르고 있습니다. </li><li> 10 ° C / 분에서 250 ° C의 램프와 30 분 동안 누르고 있습니다. </li><li> 20 ° C / 분에서 575 ° C의 램프 적어도 180 분 동안 누르고 있습니다. </li><li> 로에서 도가니를 제거하고 데시 케이 터. 도가니 재 무게. </li><li> 다음 식을 이용하여 산 불용성 잔사를 계산 </li></ol><img alt="식 (1)" fo:content-width="300" src="/files/ftp_upload/51340/51340eq1.jpg" width="450" /> 사전 추출 된 바이오 매스의 M PRE = 질량 후 추출 된 바이오 매스의 M POST = 질량 추출 된 바이오 매스의 M 유리 병 = 질량은 유리 병에 추가 도가니와 리그닌 잔 유의 M 잔류 = 질량UE 도가니와 화산재의 M ASH는 = 질량 사전 추출 된 바이오 매스, 총 중량을 기준으로 전체의 MC = 수분 함량 5. 탄수화물 분석 <ol><li> 세포벽 탄수화물 포스터 등을 기준으로 분석한다. (2010) 프로토콜 31을 수행합니다. 간단히, 동결 건조 식물 재료에서 알코올 불용성 잔류 물을 준비합니다. 그런 다음 트리 플루오로 아세트산과 물질을 가수 분해 및 해당 알디 톨 아세테이트에 용해 된 단당류 유도체와 일치합니다. 중극 질량 분석계에 연결된 가스 크로마토 그래피 (GC)에 의해이 휘발성 유도체를 분석. </li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Relationship+between+Phenylalanine+Ammonia-Lyase+Levels+and+Phenylpropanoid+Accumulation+in+Transgenic+Tobacco+Identifies+a+Rate-Determining+Step+in+Natural+Product+Synthesis.">Quantitative Relationship between Phenylalanine Ammonia-Lyase Levels and Phenylpropanoid Accumulation in Transgenic Tobacco Identifies a Rate-Determining Step in Natural Product Synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7608-7612 (1994).</li><li>Hu, W. 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(e1837), (2010).</li><li>Department of Agronomy, Iowa State University. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+bombardment+of+Hi+II+immature+zygotic+embryos+and+recovery+of+transgenic+maize+plants.">Particle bombardment of Hi II immature zygotic embryos and recovery of transgenic maize plants.</a> , (2005).</li><li>Cano-Delgado, A., Penfield, S., Smith, C., Catley, M., Bevan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cellulose+synthesis+invokes+lignification+and+defense+responses+in+Arabidopsis+thaliana.">Reduced cellulose synthesis invokes lignification and defense responses in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 34, 351-362 (2003).</li><li>Boudet, A. M., Kajita, S., Grima-Pettenati, J., Goffner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignins+and+lignocellulosics:+a+better+control+of+synthesis+for+new+and+improved+uses.">Lignins and lignocellulosics: a better control of synthesis for new and improved uses.</a> Trends in plant science. 8, 576-581 (2003).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

세포벽 다당류를 심는 미생물 셀룰라아제의 액세스는이 페놀 폴리머 (23)와 연결되어있는 정도에 크게 의존한다. 설탕을 발효 될 수있는 목질 계 바이오 매스 변환 속도에 부정적인 식물 secondadry 세포벽에 입금 리그닌 함량과 상관 관계가있다. 이 상관 관계는 그러한 소수성 (24), 화학 등의 이질성 리그닌의 물성에 기인 한 정규 가수 분해성 intermonomeric의 부재 (25)를 결합하...

목질 계 바이오 매스로부터 바이오 연료 생산으로 인해 미국 1 년에 현재 풍부하는 것이 매우 바람직하며, 농림업 잔기의 지속 수확의 경우, 식품 및 동물 사료의 생산에 사용되는 농경지에 직접 경쟁 할 수있는 능력. 그러나, 현재 미국에서 생성 된 바이오 연료의 주요 소스 옥수수 곡물, 달리, 리그 노 셀룰로오스 물질은 훨씬 더 복잡하고 어려운 무너 뜨리는 수 있습니다. 장쇄 탄수화물, 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스, 리그 노 셀룰로오스 성 물질의 발효 중에 당류의 주 소스이며, 식물 세포벽의 많은 유형 또한 리그닌을 포함하고, 병원체의 공격에 대하여 강도, 방위를 제공 phenylpropanoid 중합체 및 소수성 외에 벽을 셀. 식물의 성장과 생존에 필요한 반면, 리그닌은 셀룰로오스 hemicellu의 성공적인 효소 전환에 상당한 장벽을 제공합니다수용성 당을 잃게됩니다. 높은 리그닌 함량을 가진 재료는 일반적으로 (생물학적 변환 경로를 통해) 생물 연료 및 가공 특성 및 제품의 품질에 부정적인 영향으로 인한 펄프와 종이 산업에 모두 덜 바람직한 물질이다. 따라서, 작물 구조 강도 및 방어 시스템을 방해하지 않는 수준에서 리그닌 감소를위한 식물 재료의 유전자 조작은 리그 노 셀룰로오스 바이오 연료와 펄프 및 제지 산업을 모두 생산 비용의 감소를 위해 중요 할 수 있습니다. 옥수수 (ZEA 메이)에서 리그닌 공유 ferulate 및 diferulate 다리를 통해 2 차 전지 벽에 헤미셀룰로오스에 대한 상호 연결되어 있습니다. 리그닌 헤미셀룰로오스 복잡한 이차 전지 벽에 무결성과 힘을 부여 복잡한 매트릭스를 형성, 수소 결합을 통해 셀룰로오스 미세 섬유에 결합한다. 식물 세포벽의 기계적 강도는 크게 리튬의 유형에 의해 결정된다gnin 3-5 소단위. 이전의 연구에서, 리그닌 서브 유닛의 비율을 변경하는 효소 소화 6-11에 뚜렷한 경향을 보이지 않고있다. 그러나, 리그닌 함량의 감소는 일반적으로 변환 (12, 13)의 향상을 보여 endocellulases, cellobiohydrolases 및 β-글루코시다 제 (14)를 포함하여 가수 분해 효소에 의해 식물 소재의 소화율을 증가시키는 열쇠가 될 수 있습니다. 전 사체의 발현 정도를 조절하는 유전 공학 광범위 작물 특성을 개선하기 위해 실시되었다. 안티센스 (15)과 공동 16 억제 기술 등 고급 기술은, 아래로 규제 대상 유전자의 효과적인 수 있습니다. 완전한 유전자 녹아웃은 머리핀 구조 (17) 인트론 접합 RNA를 암호화하는 유전자의 구조를 사용하여 달성되었습니다. 또한, 이중 가닥 RNA 간섭 (dsRNAi) 기술, 즉 강력하고 효과적인 유전자 발현 미디어대상으로 성적 저하 또는 번역 탄압 중 하나에 의해 작동 토르, 목표 mRNA의 18에 억제 효과의 넓은 범위를 유도하는 강력한 수단을 제공한다. 유전자 침묵 기술은 몇 가지 제한 사항을 보여줍니다. 이러한 기술은 정확하게 전사의 수준을 규제하지 않고는 다른 동종 유전자에 예기치 않은 침묵 효과를 일으킬 수 있습니다. 이 방법에서는, 우리는 dsRNAi은 옥수수 게놈에 생성 수행하는 입자 충격을 채택했다. 현재까지 식물 종의 광대 한 배열이 성공적으로 입자 충격, 아그로 박테 리움 매개 형질 전환, 일렉트로 및 미세 주입 방법을 사용하여 변형되었다. 그것은 가장 효율적이므로 옥수수 유전자 변형에서, 입자 충격 법은 모든 다른 방법에 비해 유리하다. 입자 충격 박테리아에 의존하지 않는, 그래서 방법은 유전자의 유전자, 종의 크기 또는 생물 제약은 무료입니다이긴, 또는 식물의 유전자형. 물리적 유전자 전달체는 높은 변환 효율이 19에서 엽록체로 식물 게놈에 및 경우에 따라 도입 될 고 분자량 DNA 복수 유전자를 가능하게한다. 잎 중앙 리브의 혈관계에서 리그닌 환원은 샘플의 지형 및 조성을 조사하기위한 유리한되는 주사 전자 현미경 (SEM)을 통해 가시화 될 수있다. 옥수수 식물, 신나-CoA 환원의 두가 (ZmCCR1 : X98083 및 ZmCCR2 : Y15069) 유전자는 옥수수 게놈 (20)에서 발견되었다. 신나 모일-CoA 환원은 신나 밀 알데히드로 hydroxycinnamoyl 아실-CoA 에스테르의 전환을 촉매한다. 유전자가 모든 lignifying 조직에서 발현되어 있기 때문에 우리는이 효소를 하향 조절하는 ZmCCR1 유전자를 선택했다. 시퀀스 것으로 나타났다 때문에 ZmCCR1 유전자의 3 &#39;말단에 523 개의 뉴클레오티드는 dsRNAi가 구성을 위해 선택되었다ZmCCR2들에 비해보다 다양. 따라서, dsRNAi 구조는 정확하게 21를 입을 오프 대상 피하고 만 ZmCCR1에 바인딩합니다. ZmCCR1_RNAi 구조체는 세포질 발현 시스템 ImpactVector1.1 태그로 설계 하였다 (1.1 IV) 녹색 조직 특이 적 프로모터를 함유하는, 리불 로스 -1,5 - 비스 포스페이트 카복실 시게나 (RuBisCO). dsRNAi는 형질 전환 식물에서 생성의 효과를 연구하기 위해, 리그닌 함량을 정량 하였다. Klason (산 불용성) 리그닌 측정 리그닌 (22)의 일부를 용해 산성 세제 리그닌 정량 방법에 비해 더 정확한 것으로 알려져있다. 따라서 Klason 리그닌은 형질 전환 된 옥수수 줄기 측정 하였다. 이 절차는 수용성 단당류 (23) 내로 중합체 탄수화물 변환 두 단계의 산 가수 분해로 구성된다. 가수 매스이어서 산 가용성 및 불용성 분획으로 MATERIALS 및 산 불용성 리그닌은 이전 연구 23, 24에 따라 측정 하였다. 이상적으로, 리그닌 분석 전에 결과를 방해 할 수있는 가용성 물질을 제거하기 위해, 가수 분해 단계, 잔사에 존재하는 회분을 고려하여 리그닌 잔기의 후 가수 분해 연소에 물, 에탄올 추출을 포함해야한다. 이 단계없이, 시료의 리그닌 함량을 인위적으로 팽창 될 수있다. 전체 방법은 그러나 우리의 실험을 위해 우리가로 인해 테스트에 사용할 재료의 작은 볼륨으로 이러한 단계를 모두 수행 할 수 없습니다, 여기에 제시되어 다른 두 세포벽 성분, 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스는 리그닌 하향 조절 된 유전자 변형 옥수수 라인 분석 하였다. 이보고되고있다 그 중 하나를 자신의 페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL) 25, 4-coumarate 아래로 조절 된 형질 전환 식물 : CoA를 리가 (4CL) 26, 또는 신나lcohol 탈수소 효소 (CAD)는 27 일 다른 세포 벽 구조 구성 요소의 증가를 보여줍니다. 우리의 연구에서 첫 단계로서, 결정질 셀룰로오스 Updegraff 방법 (28)을 사용하여 측정 하였다. 이 방법은 원래 cellulolytic 세균 및 곰팡이의 다수의 셀룰로오스의 결정을 위해 고안되었다. 헤미셀룰로오스, 리그닌 및 xylosans을 제거하기 위해 간단히, 분쇄 옥수수의 주식은 Updegraff 시약 (물 : 질산 초산)으로 처리 하였다. 결정 셀룰로오스는 완전히 SO 4 H 2를 추가하여 Saeman 가수 분해를 통해 포도당으로 가수 분해시켰다. 결정 셀룰로오스는 다음 비색 트론 방법 29을 사용하여 측정 하였다. 헤미셀룰로오스의 내용이 변경된 경우를 확인하기 위해, 분쇄 된 수피로부터 단당류 추출물을 트리 플루오로 아세트산을 사용하여 가수 분해 알디 톨 아세테이트의 방법을 사용하여 유도체 화 한 후, 가스 크로마토 그래피 (GC) (30)에 의해 분석 하였다. 결정에 셀에 대한 자세한 절차lulose 내용과 매트릭스 다당류 성분의 분석은 포스터 등으로 설명되어 있습니다. (2010) 31. 여기, 우리는 리그닌에 사용되는 절차에 대해 설명 아래 규제의 RNAi 기술, 입자 충격의 변환 및 바이오 연료 발효 설탕에 옥수수 리그 노 셀룰로오스 바이오 매스의 가속 해체를위한 리그닌 분석을 통해 옥수수에서.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td>Chemical compositions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6OSM</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Osmotic medium)</td>
			<td>1 ml/l N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.69 g/L proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/l sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l sorbitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l mannitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6E</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Callus induction)</td>
			<td>1 ml/l (1000X) N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.76 g/l proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/l sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6S media</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Selection media)</td>
			<td>1 ml/l N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.69 g/L proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l sorbitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l mannitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regeneration medium</td>
			<td>4.3 g/L MS salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 ml/L (1000X) MS vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>60 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>3 g/L gelrite, pH 5.8 (100x25 mm petri-plates)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized bialaphos (3 mg/L) added after autoclaving.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rooting medium</td>
			<td>4.3 g/L MS salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 ml/L MS vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>3g/L gelrite, pH 5.8 (100x25 mm petri-plates).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-top high pressure tubes</td>
			<td>Pressure tube (#8648-27); Ace Glass, Vineland, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Plug (#5845-47); Ace Glass, Vineland, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral buffered formalin&#160;</td>
			<td>100ml of formalin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(1 liter)</td>
			<td>900ml of ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4.0 g of Sodium dihydrogen phosphate, monohydrate&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>(NaH2PO4.H2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device (Hercules, CA, United States)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelsior ES Tissue Processor (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoCentre III Embedding Station (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microtome Model Reichert 2030 (Reichert, Depew, NY, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emscope Sputter Coater model SC 500 (Ashford, Kent, England)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill; Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA35 Moisture Analyzer; Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer, Balzers CPD (Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lignin down-regulation of zea mays via dsrnai and klason lignin analysis

생물 전환 공정 동안에 대안 바이오 에너지 자원 등 목질 계 바이오 매스의 사용을 촉진하기 위하여, 전처리 단계는 세포벽 탄수화물의 접근성을 증가, 식물 세포벽의 구조를 열 필요가있다. 리그닌, 많은 세포 유형의 벽에 존재하는 폴리 페놀의 재료는, 액세스를 효소 심각한 지장으로 알려져있다. 식물의 구조적 완전성과 방어 시스템을 방해하지 않는 레벨로 리그닌 함량의 감소는 바이오 에탄올 생산 비용을 줄이기 위해 가치있는 단계 일 수있다. 이 연구에서는 유전자 이중 가닥 RNA 간섭 기술을 통해 리그닌 생합성 관련 유전자 중 하나, 신나-CoA 환원 (ZmCCR1)를 아래로 조절했다. ZmCCR1_RNAi 구조체는 입자 충격 법을 사용하는 옥수수 게놈에 통합 하였다. 형질 전환 옥수수 식물에없이 야생형 대조군 식물과 비교하여 일반적으로 성장형질 전환 식물의 잎 중간 갈비, 껍질에 갈색 착색의 표시를 제외하고, 바이오 매스의 성장이나 방어 메커니즘으로 terfering 및 줄기. 현미경 분석은 조직 학적 분석과 함께, 잎 후벽 섬유 박형화되었지만 다른 주요 혈관 시스템 구성 요소의 구조 및 크기가 변경되지 않았 음을 밝혔다. 유전자 변형 옥수수의 리그닌 함량은 7-8.7 % 감소시키고, 결정 성 셀룰로오스, 리그닌 함량 감소에 응답하여 증가하고, 헤미셀룰로오스는 그대로 남아 있었다. 분석은 탄소 흐름이 셀룰로오스 생합성에 리그닌 생합성에서 변환 된 경우가 있습니다 나타낼 수 있습니다. 이 문서의 RNAi 기술을 통해 옥수수의 리그닌 함량을 하향 조절하기 위해 사용되는 절차를 묘사하고 세포벽 조성은 세포벽 구조에 대한 변형의 효과를 검증하기 위해 사용 분석한다.

우리는 RNAi를 통해 옥수수 식물의 리그닌 함량 감소를 보여 주었다. 입자 충격의 변환 방법은 약 30 % trnasformation 효율을 얻었다. ZmCCR1의 유전자 침묵 일관 T0-T2 세대에서 관찰되었다. 리그닌 감소 된 형질 전환 체는 잎 중간 리브, 껍질, 줄기에 갈색 채색을 표시 제외 야생형 옥수수 식물과 유사하게 성장했다. 조직 학적 분석은 돌연변이 라인 옥수수 잎 중앙 리브 (18)의 후벽 섬유의 ?...

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Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

이중 가닥 RNA 간섭 (dsRNAi) 기술은 옥수수 신나 코엔자임에게 낮은 식물 리그닌 함량에 대한 환원 (ZmCCR1) 유전자를 하향 조절하기 위해 사용된다. 세포벽에서 리그닌 다운 규제는 현미경 분석에 의해 시각과 Klason 방법에 의해 정량화된다. 헤미셀룰로오스 및 결정 셀룰로오스의 조성 변화를 분석됩니다.

의 리그닌 아래로 규제<em&gt; ZEA 메이스</em&gt; dsRNAi 및 Klason 리그닌 분석을 통해

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

lignin-down-regulation-zea-mays-via-dsrnai-klason-lignin

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

13.3K 조회수.  University of Arizona.  이중 가닥 RNA 간섭 (dsRNAi) 기술은 옥수수 신나 코엔자임에게 낮은 식물 리그닌 함량에 대한 환원 (ZmCCR1) 유전자를 하향 조절하기 위해 사용된다. 세포벽에서 리그닌 다운 규제는 현미경 분석에 의해 시각과 Klason 방법에 의해 정량화된다. 헤미셀룰로오스 및 결정 셀룰로오스의 조성 변화를 분석됩니다. 

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Contrast Ultrasound Targeted Treatment of Gliomas in Mice via Drug-Bearing Nanoparticle Delivery and Microvascular Ablation

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the microvasculature are controlled by varying ultrasound pulsing parameters.  Specifically, we are testing whether such approaches may be used to treat malignant brain tumors through drug delivery and microvascular ablation.  Preliminary studies have been performed to determine whether targeted drug-bearing nanoparticle delivery can be facilitated by the ultrasound mediated destruction of "composite" delivery agents comprised of 100nm poly(lactide-co-glycolide) (PLAGA) nanoparticles that are adhered to albumin shelled microbubbles. We denote these agents as microbubble-nanoparticle composite agents (MNCAs). When targeted to subcutaneous C6 gliomas with ultrasound, we observed an immediate 4.6-fold increase in nanoparticle delivery in MNCA treated tumors over tumors treated with microbubbles co-administered with nanoparticles and a 8.5 fold increase over non-treated tumors. Furthermore, in many cancer applications, we believe it may be desirable to perform targeted drug delivery in conjunction with ablation of the tumor microcirculation, which will lead to tumor hypoxia and apoptosis. To this end, we have tested the efficacy of non-theramal cavitation-induced microvascular ablation, showing that this approach elicits tumor perfusion reduction, apoptosis, significant growth inhibition, and necrosis. Taken together, these results indicate that our ultrasound-targeted approach has the potential to increase therapeutic efficiency by creating tumor necrosis through microvascular ablation and/or simultaneously enhancing the drug payload in gliomas.

Insonation of microbubbles is a promising strategy for tumor ablation at reduced time-averaged acoustic powers, as well as for the targeted delivery of therapeutics. The purpose of the present study is to develop low duty cycle ultrasound pulsing strategies and nanocarriers to maximize non-thermal microvascular ablation and payload delivery to subcutaneous C6 gliomas.

명암 초음파 마약 베어링 Nanoparticle 배달 및 Microvascular 절제를 통해 마우스에서 Gliomas의 치료 타겟

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the ...

연구

생체공학

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Biomaterials 높은 처리량 발견을위한 폴리머 Microarrays

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

매개 변수화 이완기 충전 형식주의를 통해 Transmitral 흐름의 운동 학적 모델링 기반의 분석에 의하여 세계적인 이완기 기능의 정량화

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to their intense optical absorbance in the near-infrared window, low cytotoxicity and potential to home into tumors. However, their delivery to tumors still remains an issue. An innovative approach consists of the exploitation of the tropism of tumor-associated macrophages that may be loaded with gold nanorods in vitro. Here, we describe the preparation and the photoacoustic inspection of cellular vehicles containing gold nanorods. PEGylated gold nanorods are modified with quaternary ammonium compounds, in order to achieve a cationic profile. On contact with murine macrophages in ordinary Petri dishes, these particles are found to undergo massive uptake into endocytic vesicles. Then these cells are embedded in biopolymeric hydrogels, which are used to verify that the stability of photoacoustic conversion of the particles is retained in their inclusion into cellular vehicles. We are confident that these results may provide new inspiration for the development of novel strategies to deliver plasmonic particles to tumors.

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

금 나노 막대를 포함하는 세포 차량의 제조 및 광 음향 분석

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

Studying Soft-matter and Biological Systems over a Wide Length-scale from Nanometer and Micrometer Sizes at the Small-angle Neutron Diffractometer KWS-2

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. The instrument is optimized for the exploration of the wide momentum transfer Q range between 1x10-4 and 0.5 &#197;-1 by combining classical pinhole, focusing (with lenses), and time-of-flight (with chopper) methods, while simultaneously providing high-neutron intensities with an adjustable resolution. Because of its ability to adjust the intensity and the resolution within wide limits during the experiment, combined with the possibility to equip specific sample environments and ancillary devices, the KWS-2 shows a high versatility in addressing the broad range of structural and morphological studies in the field. Equilibrium structures can be studied in static measurements, while dynamic and kinetic processes can be investigated over time scales between minutes to tens of milliseconds with time-resolved approaches. Typical systems that are investigated with the KWS-2 cover the range from complex, hierarchical systems that exhibit multiple structural levels (e.g., gels, networks, or macro-aggregates) to small and poorly-scattering systems (e.g., single polymers or proteins in solution). The recent upgrade of the detection system, which enables the detection of count rates in the MHz range, opens new opportunities to study even very small biological morphologies in buffer solution with weak scattering signals close to the buffer scattering level at high Q.
In this paper, we provide a protocol to investigate samples with characteristic size levels spanning a wide length scale and exhibiting ordering in the mesoscale structure using KWS-2. We present in detail how to use the multiple working modes that are offered by the instrument and the level of performance that is achieved.

Here, we present a protocol to investigate soft matter and biophysical systems over a wide mesoscopic length scale, from nm to &#181;m that involves the use of the KWS-2 SANS diffractometer at high intensities and an adjustable resolution.

작은 각도 중성자 회절 계 KWS-2에서 나노 미터와 마이크로 미터 크기에서 넓은 길이 규모 이상 소프트 물질과 생물학적 시스템을 공부

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic significance. Possible reasons for the lack of exploration are the experimental limitations and technical challenges that render the study of cell division in 3D culture inefficient. Here, we describe an imaging-based method to efficiently study mammalian cell division and cell-matrix interactions in 3D collagen matrices. Cells labeled with fluorescent H2B are synchronized using the combination of thymidine blocking and nocodazole treatment, followed by a mechanical shake-off technique. Synchronized cells are then embedded into a 3D collagen matrix. Cell division is monitored using live-cell microscopy. The deformation of collagen fibers during and after cell division, which is an indicator of cell-matrix interaction, can be monitored and quantified using quantitative confocal reflection microscopy. The method provides an efficient and general approach to study mammalian cell division and cell-matrix interactions in a physiologically relevant 3D environment. This approach not only provides novel insights into the molecular basis of the development of normal tissue and diseases, but also allows for the design of novel diagnostic and therapeutic approaches.

This protocol efficiently studies mammalian cell division in 3D collagen matrices by integrating synchronization of cell division, monitoring of division events in 3D matrices using live-cell imaging technique, time-resolved confocal reflection microscopy and quantitative imaging analysis.

양적 Confocal 반사 현미경을 통해 3D 매트릭스에 포유류 세포 분열

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging applications. This increased specificity can have significant clinical implications, including decreased side effects and lower dosages with higher potency. Furthermore, the in situ targeting and controlled modulation of specific cell subsets can enhance in vitro and in vivo investigations of basic biological phenomena and probe cell function. Unfortunately, the required expertise in nanoscale science, chemistry and engineering often prohibit laboratories without experience in these fields from fabricating and customizing nanomaterials as tools for their investigations or vehicles for their therapeutic strategies. Here, we provide protocols for the synthesis and scalable assembly of a versatile non-toxic block copolymer system amenable to the facile formation and loading of nanoscale vehicles for biomedical applications. Flash nanoprecipitation is presented as a methodology for rapid fabrication of diverse nanocarriers from poly(ethylene glycol)-bl-poly(propylene sulfide) copolymers. These protocols will allow laboratories with a wide range of expertise and resources to easily and reproducibly fabricate advanced nanocarrier delivery systems for their applications. The design and construction of an automated instrument that employs a high-speed syringe pump to facilitate the flash nanoprecipitation process and to allow enhanced control over the homogeneity, size, morphology and loading of polymersome nanocarriers is described.

Nanomaterials provide versatile mechanisms of controlled therapeutic delivery for both basic science and translational applications, but their fabrication often requires expertise that is unavailable in most biomedical laboratories. Here, we present protocols for the scalable fabrication and therapeutic loading of diverse self-assembled nanocarriers using flash nanoprecipitation.

급속 하 고, 확장 가능한 어셈블리 및 플래시 Nanoprecipitation 통해 다양 한 합성 Nanocarriers에 생리 활성 단백질의 Immunostimulants 로드

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

하위 구조 분석기: 형광 현미경 이미지에서 세포 체의 신속한 탐색 및 정확한 분석을 위한 사용자 친화적인 워크플로우

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

생물학적 조직의 자극을 위한 전기 및 자기장 장치

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...