리그닌은 3개의 모노리그놀로 구성된 복잡한 이성포합체입니다. 셀룰로오스 다음으로 지구상에서 두 번째로 풍부한 폴리머입니다. 여기서, 우리는 리그닌 함량의 추정을 위한 가장 신뢰할 수 있는 방법인 티오글리쿨산 방법을 시연한다.
이 방법은 리그닌이 티오에테르 결합을 통해 티오글리콜산에 결합한다는 원리에 기초한다. 또한 이 프로토콜을 5단계로 나눕니다. 첫 번째 단계에서는 식물 재료를 준비합니다.
두 번째 단계에서는 알코올 용해성 추출물을 분리합니다. 3상에서는 티오글리콜산및 산성 상태를 사용하여 리그닌을 침전시합니다. 4단계에서는 산업용 대나무 리그닌을 사용하여 리그닌 표준 곡선을 준비합니다.
마지막으로, 5단계에서는 4단계에서 준비된 표준 곡선을 사용하여 리그닌 함량을 추정합니다. 식물 재료는 수집, 뿌리를 분리하기 위해 냄비를 뒤집어, 물로 철저히 세척하고, 공기는 이틀 동안 건조하고, 라벨이 부착 된 용기로 옮기고 1 주일에서 10 일 동안 49도 의 인큐베이터에서 배양합니다. 가위를 사용하여 조직은 1mm에서 3mm 크기의 조각으로 더 잘려냅니다.
대안적으로 바이오매스 그라인더는 식물 조직을 분쇄하는 데 사용됩니다. 바이오매스 그라인더의 루트 조직 턴을 사용하여 분쇄된 분말을 미리 표지된 용기로 수집합니다. 마찬가지로, 줄기 조직과 잎 조직을 반복합니다.
분쇄 된 분말은 다음 냉동고 밀에 배치되는 연삭 꽃병에로드하고 세 사이클에 대한 10 CP 속도의 속도로 냉동실 공장을 실행합니다. 지상 조직 분말의 20 mg의 무게와 미리 만든 2ml 튜브로 전송. 빈 튜브와 튜브에 티슈 파우더와 실험실 노트북의 조직 분말을 적어 둡니다.
1시간 동안 60도의 섭씨로 캡이 열려 있는 튜브를 배양합니다. 인큐베이션 후, 10분 동안 15, 000 RPM의 각 샘플 소용돌이 원심분리기에 1.8 ml의 물을 추가합니다. 상체를 버리고 메탄올 1.8 ml를 추가하십시오.
15, 000 RPM에서 10분 동안 배양 원심분리기 후 20분 동안 예열된 60도 센티미터 블록에서 소용돌이와 인큐베이션을 합니다. 이 단계를 한 번 더 반복합니다. 원심분리 후 상체를 버리고 진공 건조기에서 펠릿을 2~3시간 동안 또는 팔레트가 완전히 건조할 때까지 건조시다.
마지막에 리그닌 함량의 추정을 위해 실험실 노트북에 각 튜브의 무게를 측정하고 기록합니다. 또한 이 시점에서 0.5 mg에서 4 mg으로 트리클리카에 양성 제어 산업 대나무 리그닌을 포함한다. 일반 염산 3분의 1 1ml를 각 샘플 소용돌이에 글리콜산 100마이크로리터를 넣고 3시간 동안 섭씨 80도에서 배양합니다.
3시간 의 배양 후 랙으로 옮기고 10 분 동안 식힙니다. 그런 다음 15, 000 RPM에서 10 분 동안 원심 분리기. 원심 분리 후 솔루션의 색상은 다음과 같습니다.
상부체를 폐기합니다. 물 1 ml를 추가합니다. 15, 000 RPM에서 10분 동안 소용돌이 원심분리기.
상부체를 폐기합니다. 수산화 나트륨 1ml를 추가합니다. 소용돌이와 하룻밤 37도 센티미터 쉐이커에서 배양.
하룻밤 동안 배양 후 15, 000 RPM에서 튜브를 원심 분리한 후 10 분 동안. 상류층 의 신선한 사전 라벨 2 ml 튜브를 전달하여 200 마이크로리터의 농축 염산을 슈퍼나탈에 추가합니다. 여기에 표시된 것처럼 부드러운 반전으로 섞는다.
하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 냉장고에 인큐베이션하십시오. 15에서 배양 원심분리기 후, 10분 동안 000 RPM. 상부체를 폐기합니다.
수산화 나트륨 1 ml를 추가합니다. 소용돌이와 10~15분 동안 실온에서 셰이커에 인큐베이션합니다. 흡광도측정기를 사용하여 흡광도 측정기 280나노미터를 수집하고, 수산화나트륨에 침전된 리그닌 침전이 수산화나트륨에 용해되기 때문에 수산화나트륨 2 마이크로리터를 블랭크로 섭취하십시오.
공백을 0으로 만듭니다. 마찬가지로 샘플을 반복합니다. 각 샘플의 마이크로리터 2개를 사용하여 실험실 노트북에서 흡광도 판독값을 수집합니다.
세 가지 기술 복제에 대해 각 샘플에 대해 세 가지 판독값을 수행합니다. 첫 번째 열에는 샘플 번호가 있습니다. 두 번째 컬럼에서, 우리는 R1, R2, R3가 하나의 실험 라인의 세 가지 생물학적 복제를 나타내는 생물학적 복제가 있습니다.
세 번째 컬럼에서는 280나노미터에서 얻은 흡광도 판독값을 평균화했습니다. x가 평균 OD인 공식 y=mx-c를 사용하여 네 번째 열의 리그닌 함량을 계산하고.m c 값이 준비된 표준 곡선의 회귀 선에서 플롯됩니다. 다섯 번째 열은 메탄올과 물이 세차한 후의 무게입니다.
그래서 이것은 mg에서 리그닌 콘텐츠의 추정에 사용 되는 방법입니다. 따라서 네 번째 열에서 얻은 값을 다섯 번째 열로 나누어 여섯 번째 열에서 리그닌 함량의 mg당 값을 얻습니다. 그리고 이 값은 그램 세포벽 중량당 얻기 위하여 1000을 곱한다.
그리고 백분율 리그닌 콘텐츠는 이 값을 1000으로 나누고 100으로 곱하여 계산됩니다. 마지막으로, 각 실험라인의 3개의 생물학적 복제체의 리그닌을 평균화하여 평균 리그닌을 획득하여, 이는 리닌 함량의 차이를 이해하기 위해 바 그래프의 형태로 다른 실험 라인의 평균과 비교될 것이다. 또한 학생 t-테스트를 적용하여 중요성 수준을 테스트할 수도 있습니다.
칼럼 A에서는 상업용 대나무 리그닌을 가지고 있으며, 그 다음에는 TGA와 280 나노미터의 각각의 흡광도 판독전에 찍은 대나무 리그닌의 무게가 있습니다. 표 A의 이러한 값은 열 B에서 흩어진 그래프를 플롯하는 데 사용되었으며, 이는 m 및 c 값으로 회귀 선을 제공합니다. C에서는, 표준 곡선과 산업용 대나무 리그닌 실험라인을 사용하여 얻은 값을 1과 2개의 바 그래프 형태로 비교하고 그 결과 서로 차이를 나타내었다.
