CRISPR/Cas9 게놈 편집 헬리코파 아르미게라 의 배아 미세 주입 및 녹아웃 돌연변이 식별 (휘브너)

면 볼웜은 전 세계적으로 가장 파괴적인 해충 중 하나입니다. CRISPR/Cas9 기술로 게놈 편집은 이 유기체에 있는 다른 유전자 중 유전자 기능 및 상호 작용의 추가 연구를 가능하게 합니다. 이 기술의 두 가지 주요 장점은 높은 특이성을 가지고 있으며 헤아질 수 있다는 것입니다.

sgRNA 표적을 선택하려면 CRISPR 온라인 웹 사이트로 이동하여 가능한 가이드 사이트와 유전자의 5가지 주요 번역되지 않은 영역에 가까운 엑슨을 검색하십시오. 텍스트 상자에 엑슨 서열을 입력하고 헬리코파 아미게라에 대상 게놈을 선택합니다. 웹 사이트의 사용자 매뉴얼에 따라 20 BPNGG에 대한 PAM 옵션을 선택하고 기본 매개 변수에 다른 설정을 둡니다.

소프트웨어의 예측 가이드 시퀀스를 비교하고 가장 높은 예측 효율과 가장 적은 불일치와 다섯 가지 주요 미번역 영역 근처에 하나 또는 두 개의 구아닌을 포함하는 20 개의 기본 쌍의 가이드 시퀀스를 선택하여 편집 효율성을 개선하고 오프 타겟 편집을 줄입니다. 배아 준비를 위해 3일 된 남성과 2일 된 암컷중 50명의 건강한 개인을 선택하고 깨끗한 그물 케이지에 섞어 줍니다. 10%의 설탕 용액이 들어 있는 촉촉한 면 한 조각을 케이지에 놓습니다.

그물 케이지를 거즈로 덮고 거즈를 고무 밴드로 고정합니다. 거즈에 물을 뿌리면 촉촉하게 유지하십시오. 검은 천을 적절한 크기로 자르고 촉촉한 거즈를 이 검은 천으로 대체하여 30분 동안 무료 바요사 위치를 확보할 수 있습니다.

양면 테이프를 현미경 슬라이드에 붙여 넣습니다. 집게를 사용하여 양면 테이프 표면에 계란을 연달아 붙여 넣습니다. 각 패치의 여백을 눌러 테이프에 단단히 고정되도록 합니다.

현미경 슬라이드 당 50~100개의 계란을 수집합니다. 미세 주입 하기 전에, 배아의 개발을 지연 하는 얼음에 현미경 슬라이드를 유지. 텍스트 원고에 설명된 마이크로 파이펫 풀러를 사용하여 모세관 유리를 당겨 바늘을 준비합니다.

마이크로 그라인더를 사용하여 바늘 끝을 날카로운 팁으로 갈아 넣습니다. 10 마이크로리터 부피 혼합물을 얻기 위해 PCR 튜브에 RNace 없는 물에 상용화된 Cas9 단백질 및 sgRNA 의 2개의 마이크로리터를 추가하여 사출 솔루션을 준비하십시오. 파이펫팅으로 잘 섞어서 얼음 위에 놓습니다.

전자 마이크로인젝터의 매개 변수를 설정합니다. 마이크로 로더 파이펫 팁을 사용하여 혼합물의 마이크로 리터 2 개를 바늘에 적재하여 바늘 끝에 많은 잔류 공기를 최대한 소모합니다. 주입 바늘을 마이크로 조작기에 연결하고 두 부분 간의 긴밀한 연결을 보장합니다.

페트리 접시에 슬라이드를 놓고 현미경의 무대에 놓습니다. 조심스럽게 45도 각도에서 배아의 상단 반구에 바늘 팁을 삽입합니다. 배아에 혼합물을 전달하기 위해 페달을 누르면 배아의 약간의 팽창이 발생합니다.

배아에서 바늘을 즉시 철회하고 다음 배아가 바늘에 근접할 때까지 페트리 접시를 한 손으로 움직입니다. 충분한 부화양을 보장하기 위해 동일한 절차를 사용하여 적어도 300 개의 배아를 주입하십시오. 주입 후 페트리 접시의 뚜껑을 덮습니다.

배아의 표면 색이 어두워지면 현미경 슬라이드 주위에 페트리 접시에 인공 식단을 넣습니다. 24웰 의 문화 판을 준비하고 인공 식단으로 볼륨 용량의 1/3에 각각을 채웁니다. 작은 페인트 브러시를 사용하여 부화 유충을 골라 24웰 문화 판으로 옮기면 애벌레 가 하나 도 있습니다.

애벌레가 세 번째 인스타 스테이지로 성장하면 새로운 유리 성덕에 게 전달합니다. 새로 동봉 된 G-제로 남성 성인과 야생 형 여성 성인을 동일한 비율로 신선한 그물 케이지로 옮긴다. 면봉에 떨어뜨린 10%의 설탕 용액을 공급합니다.

G-one의 새끼까지 일상적인 방법을 사용하여 후면 곤충. 집게를 사용하여 뒷다리를 조심스럽게 제거하고 각 다리를 Lysing Matrix 튜브에 넣습니다. 조직 균질화제를 사용하여 뒷다리를 균질화합니다.

제조업체의 지침에 따라 상용 gDNA 추출 키트를 사용하여 균질화된 샘플의 게놈 DNA를 추출합니다. 텍스트 원고로부터 유전자 계부 프라이머및 PCR 반응 조건을 사용하여 유전자 세그먼트를 증폭한다. 유전자 염기서열 분석 서비스로 유전자형을 확인합니다.

동일한 유전자형의 G-one 개인을 하나의 그물 케이지에 넣고, 자기가 G-one 자손을 교차하고 동일한 방법을 사용하여 계속 화면을 계속합니다. 관심 유전자의 표적 부위는 두 번째 엑슨에 위치했다. 이 사이트는 매우 보존되었고 합성 된 sgRNA의 표적 밴드 단편은 아가로즈 젤 전기 포이를 사용하여 확인되었다.

단일 sgRNA 표적의 돌연변이 검출은 G-one 부모 단위로부터 PCR 제품을 시퀀싱하여 수행되었다. 돌연변이의 큰 삭제가 야생 형 팬과 쉽게 구별되었기 때문에 서로 다른 엑슨에 걸쳐 비 겹치는 sgRNA 쌍을 사용하는 효과가 입증되었습니다. 특정 수의 돌연변이 개인을 얻은 후, 전기 생리학적 또는 행동 실험은 다른 유전자 간의 유전자 기능 및 상호 작용을 명확히 하기 위해 수행될 수 있다.