이 프로토콜은 백색 지방 조직으로의 섬 생착 메커니즘을 평가하는 것을 가능하게합니다. 이 지방으로 덮인 췌도 이식 방법의 주요 장점은 기술적으로 복제하기 쉽다는 것입니다. 상기 방법은 다른 질병 모델에 적용될 수 있다.
예를 들어 암의 마우스 모델을 만드는 데 사용할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 후쿠오카 대학의 부교수 인 나오아키 사카타 (Naoaki Sakata)가 될 것입니다. 해부 현미경에서 P 200 마이크로 피펫을 사용하여 acinar 및 섬유질 조직을 포함한 췌장 소화에서 여분의 섬 성분을 제거합니다.
그런 다음 세포 여과기를 사용하여 단일 acinar 세포를 걸러냅니다. 여과된 췌도를 소 혈청 또는 알부민이 보충된 적절한 배양 배지 또는 완충 용액이 포함된 새로운 배양 접시에 옮기고 접시를 소용돌이치게 하여 섬을 중앙에 위치시킵니다. P 200 마이크로 피펫을 사용하여 개별 섬을 적절한 수집 튜브에 넣습니다.
50 밀리리터 플라스틱 튜브 위에 새로운 40 마이크로 미터 셀 스트레이너를 놓습니다. 1000 마이크로 리터 피펫을 사용하여 섬을 여과기에 추가하여 섬과 단일 acinar 세포를 분리합니다. 집게를 사용하여 소 혈청 또는 알부민이 보충 된 배양 배지 또는 적절한 완충 용액이 포함 된 새로운 60 또는 100 밀리리터 크기의 비 처리 배양 접시에 여과기를 뒤집습니다.
신선한 배지 또는 완충액을 사용하여 섬을 새로운 배양 접시로 플러시한 다음 배양 접시에 총 부피가 약 20밀리리터에 도달하도록 충분한 배지 또는 완충액을 추가합니다. 현미경으로 섬을 세고 기증자 동물의 수에 따라 개별 1.5 밀리리터 플라스틱 원심 분리기 튜브간에 섬의 수를 균등하게 나눕니다. 췌도를 실온에서 1분 동안 2, 100 G에서 원심분리하고 상층액을 버린다.
약 20-30 마이크로 리터의 잔류 용액이 일반적으로 튜브에 남아 있습니다. 감염을 방지하기 위해 복부에서 머리카락을 제거한 후 마우스를 앙와위 자세로 두십시오. 복부와 사타구니 부위를 소독한 후 중간 부위가 낮은 부위의 피부를 절개하여 약 2cm 길이의 피부 절개를 만듭니다.
집게 또는 견인기로 왼쪽 복벽을 고정하고 조직을 마우스의 왼쪽으로 당겨 수술 부위를 고정합니다. 면봉을 사용하여 소장과 대장을 마우스 오른쪽으로 움직입니다. 복강의 왼쪽 표피 백색 지방 조직은 왼쪽 사타구니 영역에 있습니다.
표피 백색 지방 조직과 왼쪽 고환을 복부 바깥쪽으로 동원하고 조직을 펴십시오. P 200 마이크로 피펫을 사용하여 하나의 1.5 밀리리터 튜브에서 췌도의 전체 부피를 수집하고 수집 시 튜브에 췌도가 남아 있지 않도록 주의하십시오. 수집 된 섬이 중력에 의해 피펫 끝에 정착하도록하십시오.
마이크로 피펫 팁을 팽창된 지방 조직에 가볍게 놓고 팁의 배지 또는 완충액이 과도하게 플러싱되지 않도록 주의하십시오. 조심스럽게 섬을 조직에 씨를 뿌립니다. 파종 후 해부 현미경으로 섬의 올바른 위치를 확인하십시오.
표피 백색 지방 조직으로 섬을 덮은 다음 왼쪽 고환을 상피 백색 지방 조직 아래에 놓고 조직을 복강 내로 되돌립니다. 4-o 봉합사를 사용하여 피부를 두 층으로 닫습니다. 완료되면 마우스를 열 램프 아래에 놓고 완전히 회복 될 때까지 모니터링하십시오.
지방피복췌도 이식의 이식 효능을 복강내 췌도 이식 후의 이식효능과 비교하기 위해, 대조군 수용자 당뇨동물의 좌측 부산균 공간에 있는 복막에 동일한 수의 췌도를 이식하였다. 지방이 덮인 췌도 이식 마우스의 혈당 수치는 복강 내 췌도 이식 마우스에 비해 점진적으로 현저히 감소하는 것으로 관찰되었다. 복강 내 포도당 내성 검사는 이식 1 개월 후에 수행되었다.
지방으로 덮인 췌도 이식을 받은 마우스의 혈당은 복강내 췌도 이식 마우스에서 관찰된 것보다 낮은 수준으로 유지되었다. 조직학적 검사는 표피 백색 지방 조직으로의 췌도 생착을 평가하기 위해 사용되었다. 지방으로 덮인 췌도 이식 수용자 동물에서, 헤마톡실린 에오센 염색은 표피 백색 지방 조직 내에 췌도의 존재를 밝혀냈다.
또한, 인슐린 양성 섬들의 형광 접합 항체 염색은 모든 수용자 마우스의 표피 백색 지방 조직 내의 폰 빌레브란트 인자 양성 미세 혈관의 검출을 용이하게 하였다. 이 절차를 성공적으로 수행하려면 췌도가 피펫 끝에 완전히 정착하고 엎지르지 않고 지방 조직에 씨를 뿌려야 합니다.
