호중구는 말기 분화 된 세포이며, 현재 완전히 호중구 생물학을 재구성할 세포주가 없습니다. 따라서 그들의 생물학을 공부하기 위하여 순수하고, 불활성화되고, 건강하고 신선한 호중구를 얻기 위하여 필요합니다. 이 새로 고침 방법은 밀도 그라데이션, 퇴적물, 부드러운 리시스를 결합하여 순수한 호중구 제제를 얻습니다.
설정하기 쉽고 간단한 장비와 연습이 필요합니다. 이 방법의 그라데이션 레이어링과 같은 기술적 측면은 마스터하는 몇 가지 연습이 필요하지만 그라데이션이 완성되면 다른 단계는 바람으로 와야합니다. 버피 코트, 포장 및 라미나르 후드를 살균하여 시작합니다.
그런 다음 50 밀리리터 튜브에 10 밀리리터의 혈액을 추가합니다. 그라데이션의 클리너에 대한 혈액을 희석하려면 5 %의 FBS / HBSS를 추가하고 최대 35 밀리리터의 볼륨을 구성합니다. 뚜껑을 닫은 후 튜브를 여러 번 반전하여 혼합한 다음 튜브를 거꾸로 유지하여 적혈구가 없는 바닥을 얻습니다.
혈액 바로 아래에 밀도 그라데이션 배지의 10 밀리리터를 추가하여 배지와 혈액이 섞이지 않고 인터페이스가 날카로워지도록 합니다. 실온에서 30분 동안 400gg으로 튜브를 회전시켜 브레이크를 비활성화하십시오. 회전 후, 상부 혈청 혈장 층으로 분리된 그라데이션, 말초 혈액 단핵 세포의 중간 백색 고리, 흐린 밀도 그라데이션 중간 층 및 적혈구 위에 백색 얇은 호중구 대역으로 구성된 바닥 펠릿을 관찰한다.
PBMC를 제거하기 위해, 흡입 파이펫을 PBMC 층으로 직접 등장시키고 링이 제거됨에 따라 혈청 플라즈마 층이 감소하는 동안 완전히 흡인한다. 흡입 파이펫으로 튜브의 측면을 긁어 PBMC의 제거를 극대화합니다. PBMC 링과 호중구/RBC 펠릿 사이의 흐린 밀도 그라데이션 중간 층을 조심스럽게 제거합니다.
적혈구 침전의 경우 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 호중구/RBC 펠릿을 깨끗한 튜브로 옮기십시오. 그런 다음 5%의 FBS/HBSS를 최종 25밀리리터에 추가합니다. 3%dextran/0.9%NaCl을 함유한 예온된 용액 25밀리리터를 튜브에 직접 넣고 반전으로 부드럽게 섞습니다.
튜브를 수평 및 비 진동 표면에 15분 동안 놓습니다. 튜브를 후드에 다시 넣은 후, 액체에 파이펫을 약간 담그고 액체 표면을 아래쪽으로 따라 상단 층의 약 30 밀리리터를 수집합니다. 튜브를 회전하여 미디어에 부동 입자없이 빨간색 펠릿을 얻습니다.
잔류 RBC의 용해를 위해 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼네티드를 부드럽게 흡인시합니다. 25mm의 멸균 초순수물을 튜브에 직접 넣고 튜브를 28초 동안 반으로 섞어 RBC를 lyse합니다. 그런 다음 즉시 25 밀리리터의 멸균 1.8% NaCl 용액을 튜브에 물에 넣고 부드러운 혼합을 통해 동소환경 상태로 다시 용액을 되돌려 준다.
낮은 브레이크로 튜브를 200배~ 5분간 회전하여 RBC와 호중구를 가진 혈소판의 침전을 최소화합니다. 백색 호중구 펠릿을 다시 중단하기 위해, 펠릿에 배양 배지를 직접 추가하지만 위아래로 파이펫을 하지 마십시오. 다음으로 튜브를 좌우로 가로로 흔들어 세포 활성화를 최소화합니다.
세포 응집 또는 응집이 관찰되는 경우, 응집된 호중구를 폐기하기 위해 70 마이크로미터 메쉬를 통해 세포 현탁액을 필터링한다. 고립 된 호중구 제제의 품질을 평가하기 위해 호중구, 호산구 및 활성화 마커에 특정 한 마커로 세포를 얼룩지게합니다. 유동 세포에 의해 20, 000 세포를 습득한 후, 게이팅 전략을 사용하여 세포 순도 및 활성화를 분석하고 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 부속서 V/프로피듐 요오드를 사용하여 세포 생존가능성을 결정한다.
저속으로 인한 밀도 그라데이션은 더 순도가 높은 호중구를 산출했으며, 고속으로는 순도를 희생하여 수율이 증가했습니다. 형광 활성화 셀 정렬을 사용하여, 세포 분포만으로는 세포 절연 품질의 추정치를 제공했지만 특정 세포 마커의 사용이 바람직합니다. 확인된 오염하는 세포 인구는 단핵구, 림프구 및 호산구였습니다.
이 프로토콜을 사용하여 엄청난 호중구 수율을 달성했습니다. CD62L의 발현을 평가했다. CD62L에 대한 평균 형광 강도는 CD62L 흘리기 및 호중구 활성화를 나타내는 양성 조절 세포에서 감소하였다.
호중구 건강은 호중구가 상대적으로 짧은 반감기를 가지고 있으며 활성화가 삶을 더 단축하기 때문에 분석을 수행하기 전에 평가되어야합니다. 밀도 그라데이션 및 상용 마이크로비드를 이용한 호중구 정화 후, 세포는 24시간 동안 배양되었고 세포 생존은 혈류 세포측정에 의해 분석되었다. 실행 가능한 세포의 정량화는 밀도 그라데이션 정제키트를 사용하여 정제보다 24시간 후에 더 실행 가능한 세포를 초래했다는 것을 나타냈습니다.
그라데이션 레이어링 및 원심분리 단계는 준비의 품질에 큰 영향을 미치기 때문에 가능한 한 수행되어야 합니다. 체외 실험 및 생화학적 인 분석을 이 절차에 따라 수행 할 수 있습니다. 또한, 초순수 세포가 사이토카인 및 단백질 발현 실험에서와 같이 요구되는 경우 부정적인 선택이 수행될 수 있다.
