이 방법론 비디오는 DNA 손상 관련 세포 과정을 연구하고 DNA 수리에 연루 된 단백질의 모집을 시각화하고 정량화하는 데 정기적으로 사용되는 면역 염색 및 크로마티닌 면역 침전 프로토콜의 중요한 단계를 소개합니다. 이 기술은 DNA 수리 도중 미세 조정된 규칙에 필요한 그들의 번역 후 수정뿐만 아니라 손상된 게놈 궤적에 묶인 새로운 단백질을 확인하기 위하여 연구원을 위한 강력한 공구를 제공합니다. 이러한 기술은 다른 세포 프로세스를 공부하기 위해 적용될 수 있기 때문에, 레이저 미세 방사선 조사 또는 핵 기지를 둔 DNA 손상 유도 시스템을 사용하는 경우에 잠재적인 관련성이 있습니다.
최근에는 DNA 수리에 대한 이해를 확장하는 데 사용할 수 있는 사이트별 DNA 손상을 유도하기 위해 몇 가지 강력한 도구가 개발되었습니다. 생화학적 및 유전적 접근을 적용, 이 기구는 DNA 손상의 사이트에 DNA 복구 단지의 모집 그리고 조립과 관련되었던 세포 사건을 드러내는 데 필수적입니다. 더욱이, 이러한 기술은 고정 및 살아있는 세포를 모두 사용하여 단세포 해상도에서 이러한 프로세스의 연구를 허용합니다.
10%의 태아 종아리 혈청, 2 밀리몰러 글루타민, 1%항생제 항마이코스 용액으로 보충된 DMEM 배양 배지의 단층층에서 U2OS 세포를 유지한다. 가습된 5%의 이산화탄소 환경에서 세포를 37도에서 80%의 합류가 달성할 때까지 성장하여 2~3일마다 배지를 갱신합니다. 매체를 흡인하고 PBS로 세포를 씻으세요.
트립신-EDTA 용액으로 세포를 분리합니다. 세포가 분리되면, 세포에 배양 배지를 추가하여 트립신의 활성을 중지하여 세포 현탁액을 산출한다. 셀 카운팅 챔버를 사용하여 셀을 계산합니다.
플레이트 20, 000 셀 당 밀리 리터 당 잘 24 잘 접시에 멸균 12 밀리 미터 둥근 커버 슬립 각 우물에. 가습 된 5 %의 이산화탄소 환경에서 37도에서 24 시간 동안 세포를 배양하여 커버 슬립에 부착 할 수 있습니다. 밀리리터 네오카르지노스타틴당 10나노그램으로 세포를 치료하거나 내핵사용 기반 시스템을 통해 이중 가닥 휴식을 유도하는 적절한 방법을 사용한다.
DNA 수리의 운동학을 따르기 위해 가습된 5% 이산화탄소 환경에서 37도에서 1~8시간 동안 세포를 배양한다. 4% 포름알데히드 PBS 용액으로 셀을 25도에서 20분 동안 수정합니다. 고정 용액을 제거하고 PBS로 셀을 각각 5 분 동안 세 번 씻습니다.
PBS를 제거하고 PBS에 용해된 0.2%트리톤 X를 추가합니다. 샘플을 20분 동안 배양합니다. PBS로 셀을 세 번 씻으시면 됩니다.
BSA-PBST에서 희석된 5%BSA로 비특이적 결합을 차단하고 샘플을 최소 20분 동안 배양합니다. 1%BSA-PBST 용액에서 희석된 1차 항체의 적당량을 추가한다. 각 커버를 파라필름 또는 희석 된 항체의 10 마이크로 리터 액적에 거꾸로 놓습니다.
4도에서 1 시간 반 동안 습도 챔버에서 샘플을 배양합니다. 커버 슬립을 24웰 플레이트에 다시 올려 놓고 PBS로 세 번 세척합니다. 1%BSA-PBST에서 희석된 이차 항체의 적당한 양을 추가합니다.
각 커버를 희석 된 항체의 10 마이크로 리터 액적 위에 파라필름에 거꾸로 놓습니다. 한 시간 동안 4도에서 습도 챔버에서 샘플을 배양합니다. 24웰 플레이트에 다시 세워지는 커버 슬립을 놓고 PBS로 세 번 씻습니다.
마지막 PBS 세척 용액을 제거하기 전에, 부드럽게 트위저와 바늘의 절반으로 커버 슬립을 꺼내, 다음 장착 매체의 방울유리 슬라이드에 거꾸로 넣어. 크로마틴 면역 침전은 DNA에 단백질의 결합 패턴을 식별하는 널리 사용되는 기술이다. DSB 주위의 욕망 수리 단백질의 점유율을 밝히기 위해, 특정 항체는 결합되는 DNA 영역과 함께 크로마틴 제제로부터 관심 있는 단백질을 면역침전증하는 데 사용된다.
더욱이, ChIP는 일반적으로 주어진 게놈 궤적에서 DSB에 의해 사용에 특정 번역 후 수정의 존재를 매핑하기 위해 적용되었습니다. 밀리리터당 약 2천만 개의 세포가 각 샘플에 대해 15센티미터 의 접시로 배양되어야 합니다. 배양 배지를 제거하고 얼음 차가운 PBS로 세포를 두 번 씻으시면 됩니다.
1% 포름알데히드-PBS 용액으로 셀을 수정합니다. 플레이트를 궤도 셰이커에 놓고 20분 동안 부드럽게 교반합니다. 글리신으로 고정을 중지하여 125 밀리몰러의 최종 농도에 도달하고 25도에서 5 분 동안 부드러운 동요와 궤도 셰이커에 배양하십시오.
접시를 얼음 위에 놓고 얼음 차가운 PBS로 두 번 씻으시면 됩니다. 얼음 차가운 PBS에서 세포를 긁어 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮춥춥시게 합니다. 4도에서 5 분 동안 5, 000 rpm에서 세포를 원심 분리합니다.
조심스럽게 슈퍼나탄을 흡인하고 2밀리리터 셀 리시스 버퍼로 펠릿을 재보간 후 10분 동안 얼음에 배양합니다. 원심분리기 5, 000 rpm에서 5분 동안 4도. 상체를 조심스럽게 버리고 500 에서 1, 500 마이크로 리터 핵 용해 버퍼로 펠릿을 재연하고 30 ~ 60 분 동안 얼음에 배양하십시오.
용양을 초음파 처리에 적합한 폴리스티렌 원내 튜브로 옮기십시오. 300 ~ 1000개의 염기 쌍의 평균 단편 크기로 DNA를 전단하기 위해 lysate을 초음파 처리합니다. 사전 세척 및 면역 침전 단계에 다이나비드를 준비합니다.
RIPA 버퍼로 4도에서 구슬을 10분 간 두 번 씻으시다. 3.1 단계에서 원래 재고 솔루션에서 꺼낸 것과 동일한 RIPA 버퍼로 다이나비즈를 다시 일시 중지합니다. 4마이크로리터 다이나비드4개와 함께 각 시료의 25~30마이크로그램 크로마틴을 4도에서 1~2시간 동안 회전시 사전 클리어합니다.
자석으로 다이나비드를 침전시키고 상체를 새로운 엡펜도르프 튜브로 옮기다. 각 크로마틴 샘플에 적절한 양의 항체를 추가하고 4도에서 하룻밤 동안 회전합니다. 다음 날, 각 샘플에 세척 된 Dynabeads 40 마이크로 리터를 추가하고 4도에서 하룻밤 회전을 인큐베이션합니다.
300 마이크로리터 저염 버퍼로 한 번 씻고 4도 회전하여 10분간 세척합니다. 300 마이크로리터 고염 버퍼로 한 번 씻고 4도 회전하여 10분간 씻습니다. 300 마이크로리터 리튬 염화물 버퍼로 한 번 세척하여 4도회전으로 10분간 세척합니다.
300 마이크로리터 TE로 10분간 2회 세척하고, 첫 번째 세척은 4도, 두 번째 세척은 25도에서 세척합니다. 구슬에 200 마이크로리터 용출 버퍼를 추가하고 연속 흔들림으로 15 분 동안 열 셰이커에 65도에서 배양하십시오. 200 마이크로리터 용출 버퍼에서 상체를 새로운 튜브로 옮기고 다시 엘테 구슬을 엘테비드로 옮기습니다.
밀리리터 단백질아스-K당 500 마이크로그램과 SDS의 절반을 추가하고 샘플을 2시간 동안 50도에서 배양합니다. 클로로폼 추출을 수행하고 새로운 Eppendorf 튜브에 상부 수성 단계를 전송합니다. 절대 에탄올과 0.1 부피 3 개의 어금니 산 나트륨 아세테이트 pH 5.2의 2 개 반 볼륨을 추가합니다.
마이너스 80도에서 적어도 20 분 동안 배양하십시오. 에탄올을 제거하고 펠릿을 공기 건조시다. 50 마이크로 리터 TE에서 펠릿을 다시 중단합니다. DNA에 그들의 특별한 분포를 공부하기 위하여는, 크로마틴 면역 침전을 적용되어야 합니다.
ChIP-qPCR에 의해 얻어진 전형적인 실험 결과는 I-PpoI 유도된 DNA 손상에 대한 응답으로 감마 히스톤 AX의 시간적 농축을 보여주는 이 그림에 제시된다. 이미지의 왼쪽 부분에, 적시에 검출된 감마 히스톤 AX 신호는 브레이크 측에 표시되고, 오른쪽 부분에는 감마 히스톤 AX 분포가 입증된 파손이 유도되지 않은 대조군 유전자 부위에 제시된다. DNA 수리는 비교적 최근의 연구 분야이지만 생화학적 및 현미경 방법의 도움으로 우리의 지식은 급속히 증가하고 있습니다.
그럼에도 불구하고, 서양 얼룩, 면역 침전 및 질량 분광법과 같은 생화학 적 기술은 다량의 세포를 필요로한다. 연구 복구 프로세스는 원하는 세포 집단의 스냅샷을 나타냅니다. 현미경 분야는 뉴클레오소피 수준에서 DNA 손상 유도 세포 과정의 시각화를 가능하게 하고 단백질 공동 국소화의 정확한 매핑을 보장하는 초해상도 현미경과 같은 고해상도 기술에 의해 혁명을 일으켰습니다.
한편, 크로마틴 면역 침전은 특히 코마틴 또는 이종학 영역에서 원하는 DNA 수리 관련 단백질및 이중 가닥 의 게놈 전체 결합 패턴을 시각화하는 시퀀싱 방법과 결합함으로써 강력한 도구입니다.
