이 프로토콜은 단일 가이드 RNA 및 CAS9에 의해 유도된 이중 가닥 파단의 복구 중에 발생하는 돌연변이를 식별하는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 특정 게놈 유전자좌에서 돌연변이를 탐지하는 비용 효율적이고 강력한 방법이라는 것입니다. 우리는 인간 각질세포를 예로 들지만, 이 프로토콜은 임의의 형질감염 가능한 세포주에 적응될 수 있다.
이 프로토콜을 시연하는 것은 우리 실험실의 학부 조교 인 Taylor Bugbee가 될 것입니다. 시작하기 위해, HFK LXSN 및 HFK 8E6 세포를 섭씨 37도의 10센티미터 플레이트에서 5% 이산화탄소와 함께 인간 각질세포 성장 보충제 및 1% 페니실린 스트렙토마이신과 함께 케라티노사이트 배양 배지를 함유하는 재킷 배양기에서 배양한다. 배양 배지를 3밀리리터의 트립신-EDTA로 교체하고 섭씨 37도에서 3분 동안 배양한다.
그런 다음 동일한 양의 FBS 보충 배지로 트립신을 중화하십시오. 이제 세포를 15 밀리리터 원심분리 튜브로 옮기고 300 배 G에서 5 분 동안 원심 분리하십시오. 인간 각질세포 성장 보충제로 10 밀리리터의 각질세포 배양 배지로 세포를 재현탁시키고 혈구분석기로 세포의 농도를 결정한다.
그 후, HFK LXSN 및 HFK 8E6 세포에 대해 각각 두 개의 플레이트를 인간 각질세포 성장 보충제 및 1% 페니실린 스트렙토마이신과 함께 4밀리리터의 케라티노사이트 배양 배지에 시드한다. 시딩 후, 세포를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소에서 재킷 인큐베이터에서 배양한다. 형질 감염 당일, 3 밀리리터의 항생제가없는 보충 배지로 배지를 교체하고 재킷 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 두 시간 동안 배양하십시오.
세포를 형질감염시키기 위해, 트랜스펙션 시약을 실온으로 가온하고 사용하기 전에 부드럽게 피펫한다. 적절한 양의 형질감염 완충액을 각 세포주에 대해 두 개의 멸균 1.5밀리리터 원심분리 튜브에 놓고 이를 튜브 하나와 모의 트랜스펙션, 또는 튜브 둘로 라벨링한다. 이어서, 플라스미드 DNA 발현, CAS9, 단일-가이드, RNA-표적화 인간 CD4의 두 마이크로그램을 튜브 하나와 피펫에 첨가하여 완전히 혼합한다.
같은 양의 멸균수를 튜브 두 개에 넣으십시오. 적절한 양의 트랜스펙션 시약을 DNA 혼합물로 튜브 하나와 모의 트랜스펙션 또는 튜브 두개에 첨가한다. 피펫을 사용하여, 이들을 완전히 부드럽게 혼합하고 실온에서 15 내지 30분 동안 인큐베이션하여 복합체를 형성한다.
트랜스펙션 혼합물을 플레이트에 적가하고, 배양 플레이트를 일분 동안 부드럽게 흔들어 트랜스펙션 혼합물을 고르게 분배한다. 트립신화에 의해 세포를 수확하기 위해, 배양 배지를 트립신 EDTA 한 밀리리터로 교체하고 섭씨 37도에서 3분 동안 배양한다. 그런 다음 동일한 양의 FBS 보충 배지로 트립신을 중화하십시오.
세포의 각 플레이트에 대해, 세포 현탁액을 동일한 분취량으로 두 개의 미세원심분리 튜브로 옮기고 5분 동안 300배 G에서 원심분리한다. 원심분리 후, 시퀀싱을 위해 한 밀리리터의 PBS에 한 밀리리터의 PBS에 세포 펠릿을 재현탁시키고, 면역블롯을 위해 얼음처럼 차가운 PBS로 다른 튜브에 재현탁시킨다. 면역블롯 분석은 형질감염되지 않은 HFK 세포와 형질감염된 HFK 세포에서의 CAS9 발현을 비교하기 위해 수행되었다.
결과는 형질감염되지 않은 HFK 세포가 유사한 양의 CAS9를 발현한다는 것을 보여주며, 이는 형질감염 효율이 두 세포주 사이에서 유사하다는 것을 나타낸다. SgRNA/CAS9 형질감염된 세포 및 형질감염되지 않은 대조군에서 인산화된 히스톤 H2AX S139의 면역형광 현미경 이미지를 수득하였다. 결과는 두 개의 이중 가닥 파단이 CAS9 SgRNA에 의해 유도되었음을 나타내었다.
게놈 변이는 HFK LXSN 및 HFK 8E6에서의 돌연변이 사건의 유형별로 분류되었고, 여기서 게놈 변이의 각 그룹과 HFK LXSN과 HFK 8E6 사이의 총 변이의 수를 비교하였다. 결과는 8E6이 CAS9로 유도된 이중 가닥 파단 주위에서 200킬로베이스 내에서 게놈 변이를 증가시킨다는 것을 보여주었으며, 이는 HPV 8E6이 이중 가닥 파괴 복구를 조절하지 않고 게놈 불안정성을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 면역 블롯의 목적은 데이터 분석 중에 고려되어야하는 형질감염 효율을 측정하는 것입니다.
형질감염 효율 이외에, 면역형광 현미경은 마커로서 포스포-H2AX를 사용하여 이중 가닥 파단 유도를 확인하기 위해 사용될 수 있었다. 우리는 베타 HPV 8E6을 예로 사용합니다. 이 기술은 소분자 억제제와 같은 다른 시약에 의해 유발되는 돌연변이 빈도 또는 유형의 변화를 검출하는데 사용될 수 있다.
