이 방법은 형광을 사용하여 단백질이 합성 막 사이의 생물학적으로 중요한 liqids로 전달되는지 확인하고 따라서 진핵 세포 내부의 이러한 지질 분포에 기여합니다. 이 기술은 단백질에 의한 천연 지질의 추출 및 수송을 가능하게 하며, 쉽게 만들 수 있는 형광 세포와 리포솜이 필요합니다. 이 방법은 장기와 막 사이의 몇 가지 필수 지질의 분포 뒤에 단백질에 의해 세포 생물학에 대한 통찰력을 얻기 위해 사용하고 수정 할 수 있습니다.
시각적 데모는 형광에 의한 지질 전달의 실시간 측정을 수행하는 방법을 설명하는 것이 중요합니다. 그래서 절차를 시연하는 것은 또한 Maud Magdeleine, 내 실험실에 대한 엔지니어가 될 것입니다. 먼저 신선한 여과 및 탈가스 HEPES 칼륨 아세테이트 버퍼를 준비하여 1밀리알라 마그네슘 염화 마그네슘으로 보충하여 HKM 버퍼를 형성합니다.
그런 다음 PC로만 만들거나 2개의 어금니 퍼센트 PS 또는 PI(4)P로 도핑된 리포솜을 준비합니다. 이제 플라스크를 회전 증발기위에 놓고 지질을 진공 상태에서 건조시하십시오. 한 가지 잘, 지질 센서, NBD-C2 Lact와 두 어진 퍼센트 PS를 포함하는 리포솜을 혼합, 250 나노 몰러와 100 마이크로 리터의 최종 농도.
3개의 마이크로몰라 지질 전달 단백질 또는 LTP와 혼합된 리포솜 및 NBD-C2 수질의 동일한 양으로 두 번째 를 잘 채웁니다. 순수 80 마이크로몰러 PC 리포솜과 순수한 80 마이크로 몰러 PC 리포좀과 네 번째 잘 혼합 250 나노 몰러 NBD-C2 lact와 세 번째 잘 채우기. 이 단계를 반복하여 세 개의 우물 시리즈를 추가로 준비합니다.
그런 다음 형광 판독기에 멀티 웰 플레이트를 배치합니다. 각 웰에 대해 25섭씨 490 나노미터에서 5나노미터 대역폭을 가진 505~650나노미터의 NBD 스펙트럼을 기록한다. 각 계열에 대해 다른 스펙트럼에서 리포솜만으로 기록된 스펙트럼을 뺍니다.
PI(4)P 추출 분석의 경우 2개의 어금니 퍼센트 인산염으로 도핑된 리포솜을 준비하고 NBD-PH FAPP 프로브로 측정을 수행한다. 제어 실험을 수행하고 추출 비율을 결정합니다. 압출 리포솜을 마친 후 이 압출 된 리포좀으로 튜브를 채웁니다.
갓 탈가스 및 여과된 HKM 버퍼를 준비하고 압출 된 리포솜을 실내 온도에서 유지하는 튜브를 유지하십시오. 알루미늄 호일에 인산염으로 표시된 로다민이 함유된 리포솜을 감싸고 불투명한 상자에 보관하여 사진 표백을 방지합니다. 섭씨 25~37도 사이의 온도를 설정하고 1~3나노미터의 짧은 대역폭으로 460나노미터로 발산 단색계를 조정하고, 10나노미터 이상의 큰 대역폭으로 530나노미터로 방출한다.
최대 1초의 시간 해결을 통해 획득 시간을 25분으로 설정합니다. 석영 쿠벳에서 LA 리포솜 서스펜션 및 NBD-C2 lact 스톡 솔루션 및 프리웜 HKM 버퍼의 30 마이크로리터를 희석하여 200 마이크로몰라 총 지질 및 250 나노 몰라 또는 NBD-C2 lact를 포함하는 570 마이크로리터 샘플을 준비합니다. 작은 자기 교반 바를 추가하고 플루오로미터 홀더에 큐벳을 배치합니다.
시료가 열적으로 평형화되면 측정을 트리거합니다. 1분 후, 샘플에 LB 리포솜 현탁액 30마이크로리터를 추가합니다. 3분 후 LTP의 최종 농도가 200 나노몰러되도록 샘플에 LTP를 주입한 다음 나머지 21분 동안 신호를 획득한다.
NBD 신호를 정규화하기 위해 병렬 실험을 수행합니다. LA 평형 리포솜 서스펜션 30마이크로리터를 HKM 버퍼에 250 나노몰러 NBD-C2 lact와 혼합하여 570마이크로리터의 최종 부피로 혼합합니다. 1 분 후, LB 평형 리포솜 현탁액30 마이크로 리터를 주입하십시오.
관심 있는 LTP로 측정된 운동 곡선을 변환하여 시간이 지남에 따라 LA에서 LB 리포솜으로 전송되는 PS의 양을 결정합니다. 그런 다음 곡선의 각 데이터 점을 정규화합니다. PS 전송 분석과 동일한 바닥 방출기 설정 및 조건을 사용하여 PI(4)P 실험을 수행합니다.
큐벳에서는 30마이크로리터의 lb 리포솜 서스펜션과 NBD-PH FAPP 프로브를 사전 따뜻하게 한 HKM 버퍼와 혼합하여 570 마이크로리터의 최종 부피를 얻습니다. 시료의 열 평형에 도달하면 측정을 시작합니다. 1 분 후 LA 리포솜 서스펜션 30 마이크로 리터를 주입하십시오.
3분 후, 관심 있는 LTP를 주입하고 신호를 기록합니다. NBD 신호를 정규화하기 위해 두 번째 실험을 수행합니다. 250 나노 몰라 NBD-PH FAPP와 570 HKM 버퍼의 570 마이크로 리터와 lb 평형 리포솜 현탁액의 30 마이크로 리터를 혼합합니다.
1 분 후, LA 평형 리포솜 서스펜션의 30 마이크로 리터를 주입. 운동 곡선을 변환하여 시간이 지남에 따라 LB에서 LA 리포솜으로 전송되는 PI(4)P의 양을 결정한 다음 각 데이터 점을 정규화합니다. LTP가 효율적인 정도를 정량화합니다.
경적을 얻기 위해 전송 역학의 첫 번째 데이터 포인트의 선형 회귀를 수행합니다. 반응 혼합물의 LTP 농도로 경사 값을 나누어 시간 단위당 단백질당 전달되는 지질 분자의 수를 결정한다. SDS 페이지 분석을 통해 구슬에서 C2 수유의 효율적인 복구가 확인되었습니다.
NBD로 표지된 C2 수유의 자외선 가시 흡수 스펙트럼은 모든 C2 lact 분자가 NBD 그룹으로 표지되었다는 것을 확인했습니다. NBD-C2 수질과 그 형광의 순도는 SDS 페이지 분석에 의해 결정되었다. NBD-C2 lact 또는 NBD-PH FAPP의 형광은 PS 또는 PI(4)P를 함유한 리포솜만이 인큐베이션에 사용되었을 때 최대화되어 센서가 멤브레인바운드임을 나타냅니다.
Osh6p가 또한 이 단백질이 리포솜에서 PS 또는 PI(4)P를 효율적으로 추출했다는 것을 나타내는 낮은 형광이 존재했을 때 보였습니다. Osh6p를 LTP로 사용한 PS 전송 분석의 결과가 표시됩니다. LA 리포솜에서 LB 리포솜으로 PS 이송의 평균 운동 곡선을 계산하거나, 인산염-4-인산염으로 도핑하거나 도핑하지 않은 것으로 계산되었다.
평균 초기 PS 전송 속도는 세 가지 뚜렷한 실험에서 결정되었다. 마찬가지로, Osh6p를 LTP로 사용한 PI(4)P 전송 분석의 결과가 여기에 나와 있다. 신호 정규화 후 얻은 평균 운동 곡선과 함께.
평균 전송 속도는 도핑또는 PS와 도핑되지 않은 LA 리포솜으로 측정되었다. 이 프로토콜을 수행할 때는 신선한 버퍼를 사용하고 같은 날을 준비합니다. 플로르센트 리포솜과 단백질의 가벼운 박람회를 최소화하고, 잘 정제된 NBD 라벨 단백질을 사용하고 얼음 위에 보관하십시오. 유전자 인코딩형 형광지질 센서를 사용하여 원핵세포 내부의 세포기관 간 PS 및 PI(4)P 전달을 측정하여 확인할 수 있다.
이 기술은 PS와 PI(4)가 세포 내에 분포되어 있으며, 이들의 활동은 여러 LTPS의 특이성을 겪는다.
