이 방법론은 병아리의 망막 발달 연구를 위한 기능 상실 접근법을 제공합니다. 이 기술은 망막의 특정 영역에서 표적 유전자의 신속하고 지속적인 억제를 지원합니다. 이 접근법은 신경 조직과 비신경 조직을 모두 포함하여 병아리 배아의 다른 부분에도 적용될 수 있습니다.
oovo electroporation의 경우 25mg의 Fast Green FCF를 10ml의 PBS에 용해시켜 0.25%Fast Green 용액을 준비한 다음 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 용액을 여과합니다. 다음으로, microRNA 에메랄드 GFP 플라스미드와 Tol2 트랜스포사아제 발현 플라스미드를 2:1 비율로 혼합하여 DNA 칵테일 주사액을 제조한다. 그런 다음 주입 된 영역의 시각화를 위해 준비된 Fast Green 용액을 DNA 칵테일에 1 대 10 비율로 첨가하십시오.
다음으로, 미세주입 장치를 설정한다. 이 장치는 해밀턴 주사기, 18 게이지 2 인치 바늘, 2 센티미터 길이의 폴리 염화 비닐 튜브 및 마이크로 피펫 바늘로 구성됩니다. 해밀턴 주사기에 중광유를 채운 다음 18게이지 바늘을 주사기에 부착하고 주사기 플런저를 눌러 바늘 내부 공간을 기름으로 채웁니다.
다음으로 폴리염화비닐 튜브를 바늘 끝에 부착하고 튜브에 오일을 채웁니다. 당겨진 마이크로피펫 바늘을 튜브에 부착합니다. 그런 다음 미세 집게를 사용하여 해부 현미경으로 바늘 끝을 직경 10-20 마이크로 미터로 떼어 내고 작은 구멍을 만듭니다.
바늘 전체에 기름을 채 웁니다. 다음으로, 5 마이크로 리터의 착색 된 DNA 칵테일을 페트리 접시에 넣는다. 해부 현미경 아래에서 마이크로 피펫 바늘의 끝을 페트리 접시의 DNA 용액에 넣고 용액을 천천히 바늘에 넣습니다.
바늘 내부와 외부의 압력이 평형을 이룬 후 바늘 끝을 DNA 용액에서 꺼내 주사할 때까지 작은 비커에 멸균된 PBS에 담근다. 그런 다음 전기 천공 장치를 설정하려면 미세 조작기의 전극 홀더로 한 쌍의 백금 전극을 단단히 고정하십시오. 전극 끝 사이의 간격을 2mm로 조정하고 전극을 케이블로 구형파 펄스 발생기에 연결합니다.
다음으로, DNA 미세 주입을 위해 인큐베이터에서 수정 된 화이트 레그혼 알을 제거하고 70 % 에탄올에 적신 티슈 페이퍼로 알의 표면을 닦습니다. 그런 다음 18 게이지 바늘을 10 밀리리터 주사기에 부착하고 노른자가 손상되지 않도록 아래쪽으로 기울어 진 계란의 뭉툭한 끝을 통해 바늘을 삽입합니다. 달걀에서 2-3 밀리리터의 알부민을 꺼낸 후 스카치 테이프로 구멍을 막고 배아와 유리막이 껍질에서 분리되도록하기 위해 달걀에 빛을 촛불로 촛불을 켭니다.
다음으로, 집게를 사용하여 달걀 꼭대기에서 달걀 껍질을 제거하여 배아를 노출시킵니다. 전기천공 중 배아가 마르는 것을 방지하기 위해 한 번에 5개 이상의 알을 낳지 마십시오. 바늘 끝을 근위부에서 시신경에 45도 각도로 삽입하고 파란색 용액이 내강을 채울 때까지 플런저를 천천히 눌러 DNA 칵테일을 주입합니다.
바늘을 빼고 끝을 PBS에 다시 넣습니다. electroporation의 경우 펄스 전압을 15V로, 펄스 길이를 15밀리초로, 펄스 간격을 915밀리초로, 펄스 수를 5로 설정합니다. 배아 위의 바이텔린 막에 HBSS 몇 방울을 추가한 후 미세 매니퓰레이터를 사용하여 전극을 배아의 전후 축에 수직인 HBSS로 내립니다.
시신경의 양쪽에 전극을 놓고 전극이 배아나 혈관에 닿지 않도록 한 다음 펄스 전기장을 적용합니다. 전기천공이 완료되면 전극을 제거하고 알부민 축적을 방지하기 위해 물에 적신 멸균 면봉으로 전극을 부드럽게 청소합니다. 스카치 테이프로 창을 밀봉하고 원하는 발달 단계까지 배아를 재배양하십시오.
개별적인 pre-microRNA 서열을 Nel AP 발현 HEK293T 세포 내로 형질감염시키는 것은 뉴클레오티드 482 내지 502, 910 내지 930, 및 2461 내지 2481에 대한 구축물에 의한 Nel 발현의 현저한 억제를 초래하였다. 두 개의 microRNA 서열을 연결하면 녹다운 효율이 크게 향상되었습니다. 세 가지 조합 모두 사슬이 없는 개별 pre-microRNA 서열에 비해 향상된 억제 활성을 보여주었습니다.
형질감염 후 최소 13일에 강력한 억제가 관찰되었습니다. 뉴클레오티드 482 내지 502 및 2461 내지 2481을 표적으로 하는 Nel pre-microRNA 구조체를 트랜스포사제 발현 벡터와 함께 병아리 망막 내로 공동 형질감염시켰을 때, 배아 4.5일째에 에메랄드 GFP 발현 세포에서 망막 색소 상피에서의 Nel 발현이 유의하게 감소하였다. 생후 8일 된 배아에서, Nel 발현은 또한 망막 신경절 세포에서 감소하였다.
대조적으로, 망막에서의 Nel 발현은 대조군 microRNA의 도입에 의해 영향을 받지 않았다. 이 절차에 따라 세포 증식 및 분화, 세포 사멸, 세포 및 축삭 추적 검사와 같은 다양한 방법을 사용하여 표적 유전자 억제에 미치는 영향을 검사할 수 있습니다.
