이 작품은 NIH R01EY020560 - 01에 의해 의료 연구 대상에서 WM 켁 영 학술 의해 투자되었다. 저자는 망막 준비 및 주사의 이미징 동안 그의 도움 요셉 Bedont 감사하고 싶습니다.

1. electroporation에 대한 플라스미드 준비 electroporation에 필요한 DNA의 농도는 5μg/μl입니다. 이것은 일반적으로 원하는 plasmids이 작동 금액에 DNA의 정화와 농도에 의해 다음 맥시 - 준비 (Qiagen) 또는 이와 동등한 방법을 사용하여 증폭해야합니다. 다음 단계는 작업 금액에 DNA의 준비를 설명합니다. <ol><li> 나누어지는 100 μg의 DNA (맥시 - 준비 또는 동급에서)와 조작의 용이성 100 μL에 볼륨을 희석. </li><li> 페놀 추가, 페놀의 양은 약 60 %의 DNA / 볼륨 비율 (μg의 DNA : 총 볼륨)을 구하는 계산해야합니다 즉 : 100 μg의 DNA (100 μL)을 더한 67 μL 페놀 (100 μg : 167 μL)를. 철저하게 혼합, 이것은 DNA의 과도한 전단을 일으킬 수 있으므로 아래 피펫과하지 않습니다. </li><li> 실온에서 14,000 rpm으로 5 분 DNA를 스핀. </li><li> 뜨는 수집과 동일한 DNA를 사용하여 클로로포름 추가 단계 1.2 총 부피 비율, 혼합으로 실온에서 5 분간 14,000 rpm으로 단계 1.2 스핀에 설명되어 있습니다. </li><li> , 표면에 뜨는를 수집 DNA 솔루션 3 M의 아세트산 나트륨의 10 % 뜨는 볼륨을 추가 부드럽게 믹스와 2.5 X 100 %의 에탄올의 표면에 뜨는 볼륨을 추가합니다. 역전로 섞는다. DNA가 혼합하는 동안 솔루션의 밖으로 침전한다. </li><li> 14,000 RPM에서 10 분 동안 4 ° C DNA를 스핀. </li><li> 4 70 % 에탄올 350 μl, 5 분 14,000 RPM의 회전과 함께 씻어 ° C. </li><li> 공기 건조 펠렛 다음 5μg/μL 1 X PBS (세포 생물학 등급)에 DNA를 해산. 이것은 매우 어려운 PBS로 분해를 할 수있을 것입니다로 샘플을 overdry하지 마십시오. </li><li> DNA 솔루션에 대한 빠른 그린 염색 (10 % 주식을) 추가 염료의 최종 농도는 주입 추적 역할을, 0.1 %이다. </li></ol> 2. DNA의 주입 Subretinal 다음 단계는 stereomicroscope의 도움과 함께 수행됩니다. 일단 연습 눈 개방, 절개 및 사출의 과정을 복구하기 위해 적절하게 anesthetized 강아지를위한 충분한 시간되지 않습니다 미만 1.5 분이 소요됩니다. 날카로운 30 게이지 바늘을 사용하면, 신중하게 융합 junctional 상피 (그림 1C)을 따라 절단하여 시선을 엽니다. 이것이 기본 안구의 절단을 초래할 수 있으므로 무리한 힘을 적용하지 마십시오. 이 주사를 가리 수 있습니다 출혈이 발생할 수 있으므로 눈꺼풀 접합의 시야 밖으로 절단하지 마십시오. <ol><li> 이 사망률을 초래할 수 있으므로 몇 분 (그림 1A)에 얼음 신생아 생쥐를 마취, 얼음에서 새끼를 매장하지 않습니다. 얼음 시간의 길이는 강아지, 일반적으로 오분에 강아지가 충분하지만, 개인이 매우 빠르게 반응하거나 적절한 마취를 위해 더 이상 노출해야 할 수도 있습니다으로 마우스를 신중하게 모니터링해야합니다에서 변수입니다. 철수 반사를 확인 hemostats와 발 핀치를 실시하고 있습니다. </li><li> subretinal 공간 DNA의 삽입을 용이하게하기 위해 눈 먼저 열려 있어야합니다. 면봉 70 % 이소 프로필 알코올 준비 (타이코 보건)에 주입하고 두 눈꺼풀은 (그림 1B) 함께 융합 junctional 상피를 식별할 수있는 눈. </li><li> 날카로운 30 게이지 바늘을 사용하면, 신중하게 융합 junctional 상피 (그림 1C)을 따라 절단하여 시선을 엽니다. 이것이 기본 안구의 절단을 초래할 수 있으므로 무리한 힘을 적용하지 마십시오. 이 주사를 가리 수 있습니다 출혈이 발생할 수 있으므로 눈꺼풀 접합의 시야 밖으로 절단하지 마십시오. </li><li> 뭉툭한 종료 주사 바늘이 각막과 접합 (그림 1E) 근처 공막엔의 작은 절개를 30 guage 바늘의 팁을 사용하여 눈의 침투를 용이하게합니다. 이 렌즈의 펑크가 발생할 수 있으므로 너무 깊이 침투하지 마십시오. </li><li> 각 사출 (; Exmire microsyringe, 이토 코프 바늘 외경 0.52 mm, 내경 0.13 mm)에 개별적으로 볼륨을 측정하는 주사기의 그라디언트를 사용하여 33 게이지 뭉툭한 종료 사출 바늘로 DNA 솔루션의 0.3 μl을 그립니다. 반대 scleral 벽의 저항이 생각 때까지 절개에 바늘을 삽입합니다. 바늘이 vitreal 챔버 (그림 2B)를 통해 전달되는 등 렌즈를 관통하지 않도록주의하십시오. </li><li> 천천히 주사기의 플런저를 우울하게하는 검지 손가락 또는 엄지를 사용하여 subretinal 공간으로 DNA 솔루션의 0.3 μl를 주입. 실험자의 DNA 솔루션 subretinal 공간에 주입되는 속도는 DNA 솔루션 subretinal 공간 (그림 2C) 내에 확산되는 속도보다 휠씬하지 않도록 플런저 우울증의 속도를 제어하는 신중해야합니다. 그것이 DNA를 주입하지 않는거나 균일하게 확산되지 않는다고 초래할 수 있으므로 바늘이 반대 scleral 벽에 너무 꽉 누르면 안하는 것이 중요하므로 DNA 솔루션은 점성이다. 성공 주사도 발생합니다subretinal 공간의 부분에 DNA 솔루션의 확산. 주입 동물을 회전 때과 녹색 추적기 기본없이 망막의 지역은 분명해야합니다. </li></ol> 3. Electroporation <ol><li> Electroporation는 10mm 직경의 트위터 전극 (; BTX 악기 모델 # 522)를 사용하여 수행됩니다. 동물에 전극에서 전기 전도율을 극대화하고 긍정적인 자극 전극에 인접한 주입 눈과 부정 극에 인접한 비 주입 눈으로 전극 사이에 주입된 강아지의 머리를 장소하기 위해 PBS에 트위터 전극 소크 전극 (그림 3B). </li><li> 펄스 발생기를 사용하여 다섯 사각형 펄스를 적용 : 각 펄스는 펄스 사이에 950 밀리초 간격과 80 볼트와 기간이 50 밀리초입니다. </li><li> 그들은 얼음 마취에서 회복까지 electroporated 새끼는 현재 예열해야합니다. 이것은 온난 램프 아래에 또는 따뜻한 슬라이드 위에 새끼를 삽입하여 수행할 수 있습니다. 따뜻한 슬라이드를 사용하는 경우 적절한 패드가 금속 표면과 복구 강아지 사이에 위치 있는지 확인합니다. 복구되면 자신의 어머니에게 electroporated 새끼를 반환합니다. </li></ol> 4. 분석을 위해 눈 준비 <ol><li> electroporated 망막의 수확 및 분석의 시간은 실험의 목표에 따라 수행됩니다. GFP 표현은 electroporation 후 삼일 조잡한 시각하실 수 있습니다. cryoembedding 다음과 같이 진행 sectioning하십시오. </li><li> 원하는 timepoint에서 electroporated 동물을 희생. electroporated 눈을 밖으로 Disect 4에서 4 % paraformaldehyde에 수정 ° C를 50 분. </li><li> 조심스럽게 공막엔, 각막, 수정체, 망막 맥락막 및 색소 상피 멀리 마이크로는 해부에 의해 눈의 망막을 제거하십시오. 해부 망막은 조잡한 electroporation의 효율성을 결정하는 형광 분석에 따라있을 수 있습니다. 4 숙박 30 % 자당 솔루션에 망막을 전송 ° C. </li><li> OCT cryo - 퍼가기 -80에서 미디어 (사쿠라 Finetek 미국)와 상점 ° C.에 고정 망막 망막 이제 cryotome에 sectioned 유리 슬라이드에 캡처 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 플라스미드 pCAG - EGFP 표정으로 electroporated P0 신생아 망막의 예는 다음은 electroporation (P3)와 그림 4에 electroporation (P14) 다음 십사일 다음 3 일 제공됩니다. electroporated 망막 조직의 영역은 실험에서 subretinal 공간으로 DNA 솔루션의 확산의 주입과 반반함에 발생한 조직 손상의 정도에 따라 실험 변수입니다. 일반적으로 electroporated 망막의 90-100% 성공적으로 통합하여 소개 플라스미드를 표현했습니다 세포 기능 것입니다. 그러나, 언제 조직 형태 및 electroporation 효율 electroporated 망막만이 40-60%을 고려해이 비교 분석에 적합합니다. 바늘 침투의 사이트에서 로제트 형성과 망막 분리는 거의 항상 관찰되며이 지역은 분석을 위해 사용하지 않아야합니다. 성공 DNA는 rosettes과 분리에서 무료 바늘 침투의 사이트를 효율적 측면 electroporated 조직에 microinjection 결과 중에 확산. Gliosis 또한 중요한 실험 우려하고 거의 항상 바늘 침투의 현장에서 발생합니다. 그러나, 로제트 형성과 망막 분리와 마찬가지로, gliosis는 옆으로 electroporated 조직에서 일반적으로 중요하지 않습니다. 이러한 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP)로 Immunohistochemical 마커 분석 지역에서 반응 gliosis 수준이 허용 기준 이내 가을 여부를 확인하는 이용하실 수 있습니다. Sectioned 망막은 electroporated 망막의 형태는 그대로 그 EGFP 표현 라벨 개별 electroporated 세포에 나타난 유지 보여주는. 예제는 P0 electroporation (그림 4D - F) 다음 P0 electroporation (그림 4A - C) 14 일 다음과 같은 삼일 소개하는 부분이있다. P3 망막에 electroporated 세포의 대부분은 망막의 neuroblastic 층 (NBL)에 위치하고 있으며, 망막 (그림 4B, C)의 차별화된 신경이나 glial 세포 중 하나의 독특한 형태학의 특성을 설명하지 않습니다. P14으로 electroporated 세포 바깥 핵 층 (ONL)와 망막의 내부 핵 계층 (INL)에서 찾을 수 있습니다. 또한 다양한 라벨 세포는 이제 INL, photoreceptors 및 멀러 glia의 interneurons (그림의 4E, F)를 포함한 차별화된 뉴런의 특징 형태학의 특징을 표시합니다. <img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 신생아 (P0) 강아지 마우스 및 DNA 솔루션의 subretinal 주입을위한 안구의 오프닝의 아나스타샤. A) 신생아 강아지가에 위치anesthetization위한 얼음 조각의 침대. 주입하는 아이가 얼음에 대해 아래로 배치됩니다. B) 눈꺼풀의 융합 junctional 상피의 위치 (B, 화살표)은 안구 여는 컷 수 있습니다. C) 눈에 노출 융합 junctional 상피 (C, 화살표)을 따라 눈꺼풀의 커팅. D) 개설 눈이 융합 접합에서 절단 다음. E) 절개는 무딘 종료 마이크로 분사 주사기 쉽게 삽입을 용이하게하기 위해 각막 아래 공막엔에서 아래 눈 안으로 이루어집니다. 스케일 바, B, C, D, E : 4mm. <img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig2.jpg" alt="그림 2"/> 무딘 그림 2. 삽입은 subretinal 공간으로 마이크로 분사 주사기 및 DNA 플라스미드 솔루션의 주사를 종료했습니다. A) 만화의 약도는 subretinal 공간으로 주사기 팁의 눈 및 정착에 마이크로 사출 주사기의 정확한 삽입을 보여주는. 유리체 챔버에 DNA 솔루션의 사출, 렌즈에 소켓, 또는 주사로 눈을 통해 주사기의 통로는 electroporated 세포있다면 몇 가지와 함께 실패 실험의 결과 것입니다. subretinal 공간에 주사기 팁의 scleral 벽 및 정착에 만든 절개로 주사기의 B) 삽입. subretinal 공간에 DNA 솔루션 C) 사출. 스케일 바, B, C : 4mm. 다음과 같은 약어 : R - 망막, L - 렌즈, V - 유리, SRS - subretinal 공간,가 없어요 - 무딘가 주사기를 마쳤다. <img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. electroporation을 위해 마우스에 트위터 전극의 오리 엔테이션. A) 만화 개략도 electroporated 눈에 상대 트위터 전극의 긍정적이고 부정적인 심폐의 방향을 보여주는. 녹색 subretinal 공간에 주입 DNA의 위치를​​ 나타냅니다. 점선 화살표는 긍정적인 전극을 향해 부정적인 충전 주입 DNA의 전기 움직임을 나타냅니다. DNA 전기 영동은 긍정적인 전극을 향해 지향하는 망막에 부정적인 전극에 인접한 subretinal 우주에서 발생합니다. B) 트위터의 긍정적인 외륜은 눈 microinjected하고 부정적인 외륜이 아닌 주입 눈에 인접한 위치의 DNA에 인접한 배치됩니다. 신생아 마우스 트위터 전극 배치의 C) 높은 배율 이미지. 점선 라인은 긍정적인 전극으로 DNA의 전기 운동의 방향을 나타냅니다. 스케일 바, C : 5mm. <img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. 신생아 마우스 망막 (P0)는 pCAG - EGFP와 electroporated 및 출생 후의 일 3 (P3)과 출생 후의 일 14 (P14)에서 분석했다. AC) P0에서 pCAG - EGFP와 electroporated sectioned P3의 망막의 공촛점 이미지. electroporated 세포의 대부분은 망막 neuroblastic 층 (NBL)에 앉아. P0에서 pCAG - EGFP와 electroporated sectioned P14 망막의 (DF) 공촛점 이미지. Electroporated 세포 바깥 핵 층 (ONL)와 망막의 내부 핵 계층 (INL)에서 확인할 수 있습니다. 스케일 바, AF : 50 μm의.

<ol>
	<li>Neumann, E., Rosenheck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+changes+induced+by+electric+impulses+in+vesicular+membranes.">Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes.</a> J. Membr. Biol. 10, 279-290 (1972).</li><li>Turnbull, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Letter:+Letter:+An+alternate+explanation+for+the+permeability+changes+induced+by+electrical+impulses+in+vesicular+membranes.">Letter: Letter: An alternate explanation for the permeability changes induced by electrical impulses in vesicular membranes.</a> J. Membr. Biol. 14, 193-196 (1973).</li><li>Zimmermann, U., Schulz, J., Pilwat, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+ion+flow+in+Escherichia+coli+B+and+electrical+sizing+of+bacterias.">Transcellular ion flow in Escherichia coli B and electrical sizing of bacterias.</a> Biophys. J. 13, 1005-1013 (1973).</li><li>Kinosita, K., Tsong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-induced+pore+formation+and+hemolysis+of+human+erythrocytes.">Voltage-induced pore formation and hemolysis of human erythrocytes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 471, 227-242 (1977).</li><li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-845 (1982).</li><li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparking+new+frontiers:+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations.">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Dev. Biol. 233, 13-21 (2001).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>Onishi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pias3-dependent+SUMOylation+directs+rod+photoreceptor+development.">Pias3-dependent SUMOylation directs rod photoreceptor development.</a> Neuron. 61, 234-246 (2009).</li><li>Onishi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+nuclear+hormone+receptor+ERRbeta+controls+rod+photoreceptor+survival.">The orphan nuclear hormone receptor ERRbeta controls rod photoreceptor survival.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 11579-11584 (2010).</li><li>Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Core+Paired-Type+and+POU+Homeodomain-Containing+Transcription+Factor+Program+Drives+Retinal+Bipolar+Cell+Gene+Expression.">A Core Paired-Type and POU Homeodomain-Containing Transcription Factor Program Drives Retinal Bipolar Cell Gene Expression.</a> J. Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

생체내에 electroporation은 DNA의 표현 plasmids와 망막 세포의 변화에 대한 신속하고 효율적인 방법을 나타냅니다. 이 방법은 실험자들이 ectopically ubiquitously 표현 발기인의 통제하에 관심있는 유전자를 도입하거나 관심있는 유전자를 대상으로 s​​hRNA 구조를 사용하여 기능 연구의 손실을 수행하기 위해하여 기능 연구의 이득을 수행할 수 있습니다. 또한, 다중의 DNA plasmids은 실험자 여러 유전?...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 버퍼 페놀 포화 </td><td> Invitrogen </td><td> 15513-039 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 클로로포름 </td><td> JT 베이커 </td><td> 9180-03 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 아세트산 나트륨 </td><td> JT 베이커 </td><td> 3470-05 </td><td> 3 M 주식 </td></tr><tr><td> 빠른 그린 FCF </td><td> 피셔 생명 공학 </td><td> BP123 - 10 </td><td> 10 % 주식 </td></tr><tr><td> 이소 프로필 알코올 준비 </td><td> 타이코 헬스케어 </td><td> 6918 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 30 guage 바늘 </td><td> Terumo 의료 주식 회사 </td><td> SG2 - 3013 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Exmire microsyringe </td><td> 이토 주식 회사 </td><td> MS * E05 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Tweezertrode (트위터 전극) </td><td> BTX 악기, Genetronics 주식 회사 </td><td> 522 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 전기 스퀘어 Porator (electroporator) </td><td> BTX 악기, Genetronics 주식 회사 </td><td> ECM 830 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> OCT 컴파 운드 </td><td> 사쿠라 Finetek 미국 </td><td> 4583 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of developing mouse retina

포유 동물 망막 개발 중에 표현 유전자의 기능적 특성은 중요한 도전 남아있다. 기능 knockouts의 제정 또는 조건부 손실을 생성하는 대상 유전자는 비용과 노동 집약뿐만 아니라 시간이 소요 남아 있습니다. 이러한 도전을 추가, 망막는 녹아웃 방식을 사용하면 의도하지 않은 유전자 confounds 이어지는 망막 밖에서 필수적인 역할을 할 수 있습니다 표명했다. 세포 운명 사양 및 / 또는 터미널 차별화의 역할을 파악하려고 할 때뿐만 아니라, ectopically 기능 실험의 이득에 유전자를 표현하는 능력은 매우 가치 수 있습니다. 우리는 electroporation에 의해 신생아 마우스 망막에의 DNA plasmids의 신속하고 효율적인 설립을위한 방법을 제시한다. 멤브레인 1,2,3,4 전체 자료의 전송을 촉진 플라즈마 막 투과성의 일시적 증가 특정 필드 강도 결과 위에 짧은 전기 자극의 응용 프로그램입니다. 획기적인 작품은 electroporation은 지질 이중층 1-5 높은 청구 DNA의 통과를 허용 친수성 플라즈마 막 모공의 형성을 유도하여 포유 동물 세포에 유전자 전달의 수단으로 활용 될 수 있다고 보여주었다. 지속적인 기술 개발은 망막, 본 6, 7, 8, 9, 10 설명되어있는 방법을 포함한 여러 마우스 조직에서 생체내 유전자 전달에 대한 방법으로 electroporation의 생존 결과입니다. 그 DNA가 신생아 (P0) 마우스 및 전기 펄스의 망막 색소 상피와 망막 사이에 위치하므로 DNA 솔루션은 트위터 전극을 사용하여 적용됩니다 subretinal 공간에 주입합니다. 마우스에 눈의 수평 배치가 필요한 부정 극 - DNA - 망막 - 긍정적인 극 정렬에 트위터 전극의 쉬운 방향을 허용합니다. 양도 유전자의 다양한 결합과 표현은 출생 후의 일 2 (P2)에 의해 확인할 수 있습니다. 망막에있는 세포의 중요한 측면 마이 그 레이션의 부족으로 인해 electroporated이 아닌 electroporated 영역은 생성됩니다. 비 electroporated 지역 내부 histological 컨트롤 적절한 역할을 수 있습니다. 망막 electroporation은 같은 편대의 편대 장으로 유비 쿼터스 발기인 아래 유전자를 표현하기 위해, 또는 shRNA 구조 또는 Cre 호텔 - recombinase를 사용하여 유전자 기능을 방해하는 데 사용할 수 있습니다. 보다 타겟이 명확한 표현은 세포 특정 유전자 발기인과 구조를 설계하여 얻을 수 있습니다. electroporated 세포의 시각화는 GFP를 표현 bicistronic 구조를 사용하여 달성하거나 GFP 식은 구조 공동 electroporating 것입니다. 또한, 여러 구조는 유전자 조합 효과 또는 다른 유전자의 기능을 동시에 이득과 손실의 연구 electroporated 수 있습니다. 망막 electroporation도 적절한 표현 구조 및 삭제 돌연변이를 생성하여 게놈 CIS - 규제 요소의 분석을 위해 활용할 수 있습니다. 이러한 실험은 세포 특정 유전자 발현 11 충분한이나 필요한 CIS - 규제 지역을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 잠재적인 실험은 구성 가능한 의해 제한됩니다.

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In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

이득 또는 기능 연구의 손실 중 하나를 수행하기위한 목적으로 murine 망막 세포에 플라스미드 DNA의 결합을위한 방법<em&gt; 생체내에</em&gt; 제공됩니다. 이 방법은 외부 전기장의 응용 프로그램에 의해 유도된 세포 플라즈마 점막의 투과성에서 일시적 증가에 capitalizes.

개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

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Research

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Neuroscience

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

20.7K 조회수.  Johns Hopkins School of Medicine. 이득 또는 기능 연구의 손실 중 하나를 수행하기위한 목적으로 murine 망막 세포에 플라스미드 DNA의 결합을위한 방법 생체내에 제공됩니다. 이 방법은 외부 전기장의 응용 프로그램에 의해 유도된 세포 플라즈마 점막의 투과성에서 일시적 증가에 capitalizes.

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

연구

신경과학

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to cis-regulatory elements (CREs), short (&tilde;300-600 bp) stretches of genomic DNA which can lie upstream, downstream, or within the introns of the genes they control. CREs (i.e., enhancers/promoters) typically consist of multiple clustered binding sites for both transcriptional activators and repressors1-3. They serve as logical integrators of transcriptional input giving a unitary output in the form of spatiotemporally precise and quantitatively exact promoter activity. Most studies of mammalian cis-regulation to date have relied on mouse transgenesis as a means of assaying the enhancer function of CREs4-5. This technique is time-consuming, costly and, on account of insertion site effects, largely non-quantitative. On the other hand, quantitative assays for mammalian CRE function have been developed in tissue culture systems (e.g., dual luciferase assays), but the in vivo relevance of these results is often uncertain. 
Electroporation offers an excellent alternative to traditional mouse transgenesis in that it permits both spatiotemporal and quantitative assessment of cis-regulatory activity in living mammalian tissue. This technique has been particularly useful in the analysis of cis-regulation in the central nervous system, especially in the cerebral cortex and the retina6-8. While mouse retinal electroporation, both in vivo and ex vivo, has been developed and extensively described by Matsuda and Cepko6-7,9, we have recently developed a simple approach to quantify the activity of photoreceptor-specific CREs in electroporated mouse retinas10. Given that the amount of DNA that is introduced into the retina by electroporation can vary from experiment to experiment, it is necessary to include a co-electroporated 'loading control' in all experiments. In this respect, the technique is very similar to the dual luciferase assay used to quantify promoter activity in cultured cells. 
When assaying photoreceptor cis-regulatory activity, electroporation is usually performed in newborn mice (postnatal day 0, P0) which is the time of peak rod production11-12. Once retinal cell types become post-mitotic, electroporation is much less efficient. Given the high rate of rod birth in newborn mice and the fact that rods constitute more than 70% of the cells in the adult mouse retina, the majority of cells that are electroporated at P0 are rods. For this reason, rod photoreceptors are the easiest retinal cell type to study via electroporation. The technique we describe here is primarily useful for quantifying the activity of photoreceptor CREs.

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

This protocol describes a simple and inexpensive way to quantify the activity of cis-regulatory elements (i.e., enhancer/promoters) in living mouse retinas via explant electroporation. DNA preparation, retinal dissection, electroporation, retinal explant culture, and post-fixation analysis and quantification are described.

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Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

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The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

전체의 전의 생체내의 Culturing, 개발 Drosophila의 뇌는

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

마우스의 유전자 조작을 통해 시상 하부 개발<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색<em&gt; 생체 내</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

마우스 급성 뇌 조각의 Neuroblast 마이그레이션의 생체 내 출생 일렉트로 및 시간 경과 영상

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

마우스 망막을 사용하여 중추 신경계의 혈관 재생의 평가

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...