EV의 복잡한 특성으로 인해 관심 있는 하위 모집단을 인식하기 어렵고 이 프로토콜은 표현형, 크기 프로필 및 나노기계적 특성으로 이를 감지할 수 있습니다. 이러한 기술 조합은 비표지 분석법으로, 상태 매질과 혈장에서 EV를 실시간으로 감지할 수 있습니다. 이 기술은 병리학의 생물 지표로 사용되거나 약물 전달을 위한 나노 입자로도 사용되기 위해 관심 있는 나노 입자의 깊은 하위 집합을 특성화할 수 있습니다.
매우 민감한 방법이기 때문에 관심 샘플을 주입하기 전에 바이오칩 준비에 주의를 기울이는 것이 필수적입니다. 칩을 코팅하고 기능화한 후, 바이오칩을 200밀리몰 에틸 디메틸아미노프로필 카르보디이미드/N-하이드록시숙신이미드와 리터당 50밀리몰의 N-하이드록시숙신이미드의 혼합물에서 실온의 어두운 곳에서 최소 30분 동안 배양합니다. 스폿터를 사용하여 300나노리터의 리간드 용액을 추가하고 바이오칩을 음파 수조 아래에서 30분 동안 배양합니다.
초순수로 바이오칩을 상단에서 세척합니다. 프리즘과 굴절률이 동일한 오일 방울을 추가하여 바이오칩과 프리즘 사이에 균일한 얇은 층을 만들고 바이오칩과 굴절률이 동일한 프리즘에 부드럽게 놓습니다. 표면 플라즈몬 공명 영상의 경우 SPRi 시스템에 바이오칩을 장착합니다.
소프트웨어 왼쪽의 드롭다운 메뉴로 이동하여 작업 디렉토리를 클릭합니다. 다른 지점이 보이는 이미지를 찾아 이 이미지를 클릭하여 선택합니다. 그런 다음 리간드 패밀리의 이름을 쓰고 Finish species definition(종 정의 완료)을 클릭합니다.
커서가 있는 검은색 선을 최적의 작업 각도로 끕니다. 미러를 작업 각도로 이동을 클릭하고 작업 각도를 선택합니다. 이제 Kinetics를 클릭하십시오.
소프트웨어에서 사용자에게 음성 컨트롤을 정의하라는 메시지가 표시되면 이 시점에서 음성 컨트롤 없음을 선택합니다. 쥐 혈청 알부민을 분당 50 마이크로 리터로 4 분 동안 주입합니다. 에탄올아민을 분당 20마이크로리터의 속도로 10분 동안 주입하여 표면에 여전히 존재하고 반응성인 카르복실기를 비활성화합니다.
그 후, 4분 동안 분당 50마이크로리터의 속도로 40밀리몰 OG를 주입하여 바이오칩을 세척합니다. 생체 기능화된 칩에 특정 농도의 세포외 소포체를 주입하면서 동시에 다른 지점에서 소포의 상호 작용 동역학을 따릅니다. 또한 반사율 값과 상호 작용 수준을 결정합니다.
안정화되면 칩에 글루타르알데히드를 주입하여 AFM 이미징을 수행하기 전에 세포외 소포를 제자리에 고정합니다. 유리 슬라이드의 마스크 상단에 바이오칩을 맞춥니다. AFM 상단의 CCD 카메라를 사용하여 스캔해야 하는 올바른 지점에 캔틸레버의 위치를 지정합니다.
접촉 모드에서 3-5개의 큰 영역부터 작은 영역까지 AFM 수집을 시작합니다. 다음으로, 먼저 높이 채널을 선택하여 JPK 데이터 처리 소프트웨어로 AFM 이미지를 처리합니다. 각 선에서 뺄 다항식 피팅을 선택하여 곧게 펴진 스캔 선을 얻습니다.
표면의 거칠기를 제거하기 위해 금 입자의 높이 임계값을 선택합니다. 입자 추출 모듈은 8.5 나노 미터의 높이 임계 값을 사용하여 입자를 표시합니다. 멀티플렉싱된 바이오칩은 알부민 패시베이션 후 분석되었습니다.
기본값이 없는 칩입니다. 반점의 융합, 약한 접목 또는 기포 또는 오염 물질로 인해 일부 결함이 있는 칩. 및 금에 대한 세포밖 소포체의 흡착을 조사하기 위한 마이크로어레이가 없는 벌거벗은 금 칩이 도시되어 있다.
다중화된 바이오칩에 대한 포획 실험은 상이한 리간드에 대해 양호한 반사율 신호를 보여주었고, 상이한 리간드에 대해 양호한 신호 대 잡음비를 나타내었는데, 이는 음성 대조군의 반응이 무시할 수 있었기 때문이다. 세포외 소포 샘플을 주입한 후 세포외 소포 흡착은 높은 반사율 신호를 나타내었으며, 이는 해당 소포가 금 칩에 흡착되어 안정적으로 유지될 수 있음을 시사합니다. 세포외 소포체 로딩 후, 바이오칩 상의 세포외 소포체의 대규모 및 소규모 AFM 이미지가 생성되었다.
고해상도의 면밀한 관찰은 세포외 소포의 계측을 가능하게 합니다. 바이오칩 상의 세포외 소포체의 유효 직경은 30 내지 300 나노미터 범위였으며, 대다수는 약 60 나노미터였다. 공기와 액체에서 얻은 결과는 비슷했습니다.
네이키드 칩에 흡착된 세포밖 소포의 라만 스펙트럼은 세포외 소포막의 지질과 관련된 메틸렌 진동에 주로 해당하는 피크와 함께 명확한 스펙트럼을 나타냈습니다. EV를 정확하고 재현 가능한 방식으로 감지할 수 있도록 바이오칩을 엄격하게 준비하는 것이 중요합니다. 웨스턴 블로팅 및 나노 입자 추적 분석과 같은 기존 방법을 사용하여 표현형 및 크기 패턴을 상호 연관시키고 확인할 수 있습니다.
또한, 다중 오믹 분석은 EV 분자 특성화 및 잠재적 하위 집합 식별에 대해 더 깊이 파고들 것으로 예상됩니다.
