The authors would like to thank Christina Ball&#225;zs, Hug Aubin and J&#246;rn H&#252;lsmann for the critical reading of the manuscript and excellent editorial assistance. Moreover, the authors thank Gisela Mueller for the technical assistance. The authors thank Particle Metrix GmbH for providing the funds covering the publication costs.

참고 :이 작업에 제시된 실험 뒤셀도르프 대학의 기관 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 엑소 준비 <ol><li> (9 ml의 총) 정맥 천자를 통해 3 구연산 튜브에 전혈을 수집합니다. 15 ㎖의 팔콘 튜브에 혈액을 붓고. </li><li> 플라즈마에서 세포의 분리를 시작하기 위해 4 ° C에서 20 분 동안 1,500 XG에서 샘플을 원심 분리기. 새로운 15 ㎖의 팔콘 튜브에 뜨는을 전송합니다. </li><li> 플라즈마에서 (; CFP 무 세포 플라즈마를) 모든 세포를 제거하기 위해 4 ° C에서 20 분 동안 2,800 XG에서 샘플을 원심 분리기. 초 원심 튜브, 튜브 당 1 ml의 CFP를 전송합니다. </li><li> 4 ° C에서 90 분 동안 10 만 XG에 원심 분리기 엑소 좀을 소모합니다. 상층 액 900 μl를 제거합니다. 초 원심 분리 튜브에 남아있는 100 μL에 펠릿을 다시 일시. 900 μl의 PBS를 추가합니다. </li><li> 원심 분리기 다시 4 ℃에서 30 분 동안 10 만 XG에. SU 900 μl를 제거pernatant. 나머지 100 μL로 펠렛을 다시 일시. </li><li> 전송 증류수 40㎖의 재 현탁액의 5 내지 20 μL. 큰 입자에서 엑소 좀을 분리하는 450 nm의 필터를 통해 서스펜션을 필터링합니다. 입자 측정을위한 마지막 정지를 사용합니다. </li></ol> 입자 추적 장비 2. 시작 절차 <ol><li> 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하여 프로그램을 시작합니다. 다양한 소프트웨어 탭을 클릭 ( &quot;셀 확인&quot;, &quot;측정&quot;, &quot;분석&quot;) 프로토콜을 통해 그들 사이를 전환합니다. </li><li> 시작 절차의 자동화 구현을 위해 화면의 지시 사항을 따르십시오. 셀 품질 검사 및 자동 정렬 모두에 대한 상자를 선택합니다. 참고 :이 단계 중 하나가 &quot;셀 검사 &#39;탭 버튼 (A) 또는 (B)를 눌러 별도로 필요하다면 반복 될 수있다. </li><li> NTA 악기의 입구와 출구 포트를 열고 10m를 주입L은 유입구를 통해 채널 내로 세포 주사기로 증류수. 물의 양은 마지막 주입됨에 따라 출구 포트를 닫고. 폐액을 수집 출구에서 비커를 놓습니다. 측정 셀은 기포가 없는지 확인하고 시스템에 공기 방울을 주사기하지 않습니다. 바로 입구 포트를 닫습니다. </li><li> &quot;OK&quot;를 클릭하여 셀 품질 검사를 수행합니다. 소프트웨어는 몇 초 후에 셀 품질의 결과를 표시한다. </li><li> 모든 입자는 여전히 소프트웨어의 라이브 뷰 화면에 시각화 또는 품질 검사의 결과 만 좋거나 나쁜 경우, 나머지 입자까지 반복 스텝 2.3은 측정 셀로부터 제거하는 경우. 또한 입자의 축적을 방지하기 위해 각 측정 후 단계 2.3를 반복합니다. 증류수 주입을 반복하고 세포 검사하는 &quot;좋은&quot;결과를 얻을 수없는 경우에는, 2.9로 진행. </li><li> 균일 한 200 nm의 크기를 포함하는 POL 제어 현탁액을 제조ystyrene 입자를 레이저 현미경의 초점을 정렬하는 데 사용된다. 600 ± 100 입자가 라이브 뷰 화면 당 표시되도록 필요한 농도를 얻기 위해, 500㎖의 증류수에, 기기 제조업체에서 제공 현탁액 농축 한 방울을 추가. </li><li> 단계 2.3에 기재된 바와 같이 NTA 구에 정렬 현탁액을 주입한다. &quot;OK&quot;를 누르면 자동 정렬 시스템이 자동으로 두 초점의 최적 위치를 찾을 통해 자동화 된 루틴을 시작합니다. </li><li> 프롬프트는 시스템을 알리는 표시되면 측정을 시작하려면 확인을 클릭 이제 실험 준비가 된 것입니다. </li><li> 때때로, 에탄올 30 % 용액으로 세포를 세척하여 실험간에 수동으로 셀 채널을 청소. 소프트웨어가 자동으로 오류 보고서를 표시 할 때마다 채널을 청소합니다. </li></ol> 샘플 3. 측정 <ol><li> EA 전에 증류수 채널 플러시(단계 2.3에 기재된 바와 같이) CH 시료 측정. </li><li> 단계 2.3에 설명 된대로 채널에 (섹션 1에서 제조 된) 엑소 현탁액을 주입한다. </li><li> 필요에 따라 소프트웨어의 다음과 같은 주요 매개 변수를 조정합니다 <ol><li> 감도. 최적의 감도 범위를 찾기 위해, 서로 다른 감도 레벨 화면마다 측정 입자의 곡선을 표시하려면이 단추 &quot;감도 대 입자의 수​​&quot;를 클릭합니다. 곡선의 최대 기울기 전에 감도 레벨을 선택했다. 감도가 높을수록 레벨이 더 작은 입자의 시각화 할 수 있습니다뿐만 아니라 배경 잡음 관련된 문제를 증가시킨다. </li><li> 최소 밝기. 엑소 측정 필터로서이 기능을 사용하기위한 (20)의 출발 밝기를 선택했다. 밖으로 빈 강하게 광산란 입자까지이 매개 변수를 조절한다. 유물을 산란 약하게 증폭 아래로 조절한다. 실험을하는 동안 필요에 따라 밝기가 달라집니다. 참고 : 라이트 - 입자너무 강하게 중첩 캐터 실수로 분석에서 제외 될 수있다. </li><li> 최소 및 최대 크기입니다. 최소 및 최대 크기를 조절함으로써, 대형 입자 화소 불필요한 잡음을 제거하기 캐터 디지털 필터를 설정한다. 엑소 좀의 측정 10~500 화소의 범위를 사용한다. </li><li> 셔터. 카메라가 1/300 초에 열려있는 기간을 조정합니다. </li></ol></li><li> 읽어 매개 변수를 라이브 : <ol><li> &quot;라이브 이미지&quot;버튼을 클릭하여 임의의 지점에서 디지털 및 아날로그보기 잠정 사이를 전환합니다. </li><li> 전체 실험에​​서, 색상 코드 지표로 시료의 포화 상태를 표시 산란 강도 막대를 모니터링. 산란 줄이 빨간색 인 경우 엑소 좀을 분석하지 마십시오. 이러한 경우에 더욱 이러한 현상을 피하기 위해 샘플을 희석. 실험 조건 시험 용액의 조작을 금지하는 경우, 감도를 하향 조절 또는 소프트웨어 (S)의 휘도를 조절-ettings는 측정 결과를 향상시킬 수있다. 참고 : 입자의 매우 높은 농도의 시료를 분석 할 때 분산은 개개의 입자를 융합하고 그들은 하나의 단일 입자로 계산됩니다. </li><li> 디스플레이에서 시야에서 계산 된 입자의 개수를 참고. </li></ol></li><li> &quot;측정&quot;탭을 클릭합니다. </li><li> &quot;실행 옵션&quot;배열의 설정을 선택합니다. <ol><li> 각 인수하기 전에 반복 체크 입자 드리프트 테스트 &quot;체크 운동 &#39;을 선택합니다. 전체 분석을 시작하기 전에 한 번 이상 테스트를 수행합니다. 드리프트가 20㎛보다 높은 / 초이면, 샘플은 흐르지 않게되도록 측정을 계속하기 전에 대기. </li><li> 실험 번호 (5)과 이들 사이의 시간 지연 (0)를 선택한다. </li><li> &quot;샘플 검사 &#39;(필요한 경우)를 수행합니다. 이 시험은 시동 절차의 자동 정렬의 일부이며 나중에 필요에 따라 반복 될 수있다. </리&gt; </ol></li><li> 마지막으로 &quot;실행 영상 획득&quot;버튼을 클릭합니다. 새로운 윈도우에서, 사이클의 수 (15) 및 측정 위치의 수 (11)을 정의한다. 주 : 레이저 헤드와 현미경이 상이한 위치 (11) 입자 수를 분석하기 위해 이동 될 수있다. 실험 수요에 따라, 실험에 하나의 단일 위치 또는 다른 위치에서 수행되어야하는지 여부를 결정한다. <ol><li> 입자 비디오 해상도 (저)를 설정하여 하나의 개별 입자로 간주 될 찾아 갈 필요가있다 최소 지속 시간을 확인한다. 더 짧은 지속 시간 트래킹 저해상도 결과. </li><li> 파일 이름을 선택하고 측정을 시작하려면 &quot;OK&quot;를 클릭합니다. </li></ol></li></ol> 결과 4. 해석 <ol><li> &quot;결과&quot;탭을 측정 한 후 표시하면 다음과 같은 결과와 매개 변수를보기 : 추적 입자의 (1) 총 번호, 부품 (2) 평균 수위치, 및 (3) 입자 농도 당 icles. <ol><li> 입자 수의 비율로 입자 크기 (직경, 표면 및 체적)의 비율에 대한 수치 결과 평균 테이블을 볼뿐만 아니라 평균 및 표준 분화의 값. </li><li> 하나 이상의 피크가 그래픽 분석에있는 경우 피크 분석 테이블을 사용합니다. 이 표는 각각 제 2 피크 또는보다 작은 입자의 분포를 나타낸다. </li></ol></li><li> 크기에 따라 입자의 분포를 확인하기 위해 측정 한 후 계산 된 그래프를 볼 수 있습니다. 설정을 변경하는 표시 모드와 그래프 위의 아이콘을 사용. </li></ol>

<ol>
	<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., Bonifacino, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.+Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.+.">Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. .</a> Current protocols in cell biology / editorial board. (3.22), (2006).</li><li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling.">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).</li><li>Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes.">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> J. Vis. Exp. , e3037 (2012).</li><li>Konokhova, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-scattering+flow+cytometry+for+identification+and+characterization+of+blood+microparticles.">Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles.</a> Journal of biomedical. 17, 057006 (2012).</li><li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+current+knowledge+of+their+composition,+biological+functions,+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials.">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).</li><li>Sokolova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+exosomes+derived+from+human+cells+by+nanoparticle+tracking+analysis+and+scanning+electron+microscopy.">Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy.</a> Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).</li><li>Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antigen+presenting+cell+derived+exosomes,+based+on+immuno-magnetic+isolation+and+flow+cytometry.">Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry.</a> Journal of immunological. 247, 163-174 (2001).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> Amer. J. Phys. Renal Phys. 292, F1657-1661 (2007).</li><li>Carr, B., Warren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Company+profile:+NanoSight:+delivering+practical+solutions+for+biological+nanotechnology.">Company profile: NanoSight: delivering practical solutions for biological nanotechnology.</a> Nanomedicine. 7, 1129-1132 (2012).</li><li>Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma.">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> International immunology. 17, 879-887 (2005).</li></ol>

This work was supported by the institutional funds of the Dept. of Cardiovascular Surgery, Medical Faculty, HHU. The publication costs of this study were provided by Particle MetrixGmbH.

우리는 생물학적 유체 엑소 크기와 농도를 측정 할 수있는 새롭고 혁신적인 방법으로 혈액와 현재의 나노 입자 추적에서 엑소 분리에 대한 자세한 프로토콜을 보여줍니다. 제시된 실험에서는 인간 말초 혈액 엑소 좀의 원점으로 하였다. 그러나 등과 소변, 객담, 세포 배양 상등액, 다른 기원, 또한 시험 물질로서 사용될 수있다. 인간에서 엑소 농도의 생물학적 다양성에 기초하여, 다른 개인의 분석은 엑소 좀의 다양한 농도를 현저하게 마련되어있다. 그러나 생물학적 검사 프로브 입자의 농도는 결과에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 프로브의 희석 신뢰성 있고 표준화 된 접근 방식이 필요하다. 제시된 방법은 엑소 포함하는 플라즈마는 주변 전체 혈액의 9 ml의에서 생성되었습니다. 차등 원심 분리를 사용하여 엑소 좀 펠렛으로부터 분리 된 단계1 ml의 혈장과는 현탁 엑소 좀의 작업 샘플을 파생한다고 증류수 5ml에 재현 탁. 이 사전 정의 된 설정은 입자의 적절한 농도, NTA 동안 즉, 적절한 분산 강도와 함께 우리를 제공하고 있습니다. 볼륨 및 희석 양태 게다가, 사용되는 용액의 조성은 또한 중요하다. 우리는 엑소 좀의 최종 다시 서스펜션 증류수를 사용했다. 물론, 최종 희석 단계에 대해 다른 매체는 실험 장치의 요구 사항에 따라 이용 될 수있다. 그러나, 완충 능력을 시험 샘플과 함께, 특히 이온 용액의 제타 전위 측정의 경우, 난류없는 조건 신중한 희석 유용하다. 여러 샘플의 직접 비교를 위해 우리는 모든 샘플에 대해 동일한 희석 수준을 유지하는 것이 좋습니다. 감도 및 해상도의 영상을 제외한 모든 설정 ZetaView 분석 소프트웨어를 사용하여 나중에 변경 될 수있다. (10)와 함께 다른 이동기구 설계를 제공하는 다른 시스템을 채용했다. 우리는 결과의 시료 처리 및 재현성에 관한 실용적인 측면이 엑소 평가를위한 방법 론적 순서를 선택하는 중앙 중요하다 있다고 생각합니다. 또한 이상 검출 시스템이 측정의 결과를 방해 할 수 따라 사용자 요인을 제거해야한다고 판단된다. 여기에 제시되는 엑소 좀 분석 접근법은 고도로 취급 용이성 기준을 충족. 또 다른 장점으로, 샘플의 분석 반자동 단시간에 결과를 생성하는 과정에서 빠르게 수행된다. 엑소 좀의 온라인 시각화 조지아에 분석기를 돕는다엑소 특성, 예를 들면, 총 농도의 인스턴트 아이디어. 여기에 제시된 측정 기법에 매우 단순하지만 우아한 첨가 항체 표지 엑소 좀의 용도 및 검출기의 앞에 선행하는 필터를 이용하여 레이저 광 산란의 캡쳐이다. 이러한 방식의 엑소 소집단은 선택적 형광 염색법 기술적 접근 그들의 표면 항원 및 다른 중요한 생물학적 특성에 따라 구분 될 수있다. 우리 입자 추적 장비의 현재 버전의 하나의 단점은 매우 높은 민감도 수준에서 배경의 노이즈 아티팩트는 셀의 채널 벽에 기초하는, 본 될 수 있다는 사실이다. 현재의 시스템에 대한 기술적 인 해결책과 개선은 곧 제공 될 수있다. 채널 벽에 레이저 빛을 산란이 방법의 반사에 의해함으로써 증가, 감소 될 것이다<html> 측정 된 신호 및 데이터 획득 및 검출 한계를 낮추는 정도. 엑소 격리를위한 현재 사용되는 프로토콜은 잘 설립인가 입자 추적기구 30 nm의 낮은 크기 분포와 매우 정밀한 해상도를 가지고 있지만, 검출 된 입자가 실제로 완전히 사실 엑소 좀 있다는 보장이 없다. 이러한 죽은 세포 조각 또는 큰 단백질 복합체와 같은 다른 입자는 또한 엑소 서스펜션에 존재하는 거짓 긍정적 인 신호가 발생할 수 있습니다. 이러한 &quot;오염&quot;을 전자 현미경 (EM)의 송신 또는 EM 주사 EM 이어도 배제 할 수있는 하나의 신뢰할 수있는 방법. 이전에 제안 된 표면 마커의 수는 tetraspanin (Tspan), CD81, C63, CD9 등 (11)를 포함하여 관심의 증가 금액을 얻고있다하지만 불행하게도, 엑소 좀에 대한 일반 및 특정 마커는 지금까지 확인되지 않았다. &quot;&gt; 무관 엑소 생물학, 특히 엑소 특정 마커에 관한 연구의 미래의 진보, 여기에 제시되는 프로토콜 단리 엑소 좀의 검출을위한 강력한 방법을 제공하는 것이다. 농도와 크기가 용이하게 소프트웨어 보조 식으로 결정될 수있다 간단한 패션. 선택적 형광 마커 또는 형광 결합 항체의 추가 가능성이 더 NTA의 제시 방법의 응용 가능성을 향상시킬 것입니다.

순환하는 엑소 좀의 정확한 기능은 장기간 동안 알려지지 남았다. 지금도 엑소 좀의 전체 경로 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 엑소 좀을 가지고 있기 때문에 항원 단백질과 원산지 그들의 부모 세포, 세포 - 세포 신호 송신기로 그 기능에 관한 RNA (mRNA와 miRNA의)를 중심으로 우선 순위를 부여하고있다. 많은 다른 방법은 분리 및 1,2- 엑소 좀의 정량적 검출을 위해, 문헌에 기술되어있다. 그러나, &#39;황금 표준&#39;에 대한 합의에 도달 없습니다. 한편 엑소의 연구 분야에서 활동 과학자의 대부분은 격리의 일관된 방법은 매우 다른 보고서와 연구 사이의 비교의 높은 수준을 달성하기 위해 보증에 동의합니다. 형광 활성화 세포 분류 (FACS)는 엑소 분석 3 가장 일반적이고 널리 도구이다. FACS는 벤있다형광 라벨을 통해, 상이한 기원의 세포가 하나의 단계에서 비교 될 수있다을 더할. FACS의 주요 단점은 더 적은 크기를 측정하기 위해, 엑소 좀은 직경 5 30 ~ 120 nm의 사이에 일반적으로 반면이 방법은, 입자보다 작은 0.5 μm의 4를 식별 할 수있을만큼 민감하지 점이다. 주사 전자 현미경 (SEM) 및 투과형 전자 현미경 (TEM)은 입자 크기 및 형태의 엑소 좀의 다른 분석을위한 도구이다. 그러나, SEM 및 TEM 모두 샘플의 준비 시간이 많이 소요, 두 방법 모두 노동 집약적 인 단계를 포함 할 수있는 단점을 가지고 각각의 이슈 생성 될 위험이있다. 어느 방법은 높은 시료 처리 한 시료의 단일 입자의 수​​천의 특성에 적합하다. 더욱이, 샘플이 종종 임상 일상 용 정량 분석​​은 매우 짧은 기간에 동시에 또는 적어도된다 분석 할수행하기 어렵다. 차세대 기술은 지금 우리가 이전에 집중적 인 준비 작업 (예를 들어, 환경 SEM)없이 엑소 좀을 분석 할 수 있습니다. 이러한 최신 기술은 여전히 평균 개수 및 크기 분포를 결정하기 위해 6 엑소 좀을 대량 함유 현탁액을 분석 오히려 불편하다. 시각화 및 엑소 좀 분석을위한 또 다른 매우 중요한 방법은 나노 입자 추적 분석 (NTA)입니다. 이 방법은 물리학의 두 가지 원칙을 활용합니다. 먼저, 입자들이 레이저 빔이 조사 될 때 빛 산란에 의해 검출된다. 두 번째 현상은되는 따른 액체 현탁액 중의 입자들의 상이한 확산의 크기에 반비례하는, 브라운 운동으로 알려져있다. 후자의 경우, 이동도의 온도 및 액체의 점성에 의존한다. 그러나, 이러한 속도는 직접 입자 크기와 관련이 NTA에 의해 사용된다. 부드러운 사용웨어 기반의 분석은 단일 입자 산란광의 디지털 이미지가 기록됩니다. 산란 광 스폿의 플롯과 그들의 모션의 속도는 입자의 총 개수 및 크기 분포의 결정을 용이하게 데이터를 제공한다. 이 기술은 100nm 이하의 평균 입자 직경을 분석하는데 특히 강력하다. 크기와 농도 측정은 ZetaView 브라운과 전기 영동 모션 비디오 분석 현미경으로 수행됩니다. 이것은 (이하, 입자 추적기구 라 함), 액체 시료 반자동 탁상 나노 분석 도구이다. 이는 입자 분석기 추적뿐만 아니라, 데이터 분석에 사용되는 소프트웨어 노트북 이루어져있다. 이기종 생물학적 시료는 무기 입자의 더 균일 한 현탁액으로이 방법으로 적합하다. 비디오 카메라와 레이저 산란 현미경은 입자의 검출 및 obse에 사용그들의 운동의 rvation. 현미경 축이 수평 및 엑소 좀을 함유하는 현탁액으로 채워진 셀 채널에 초점을 맞추고 있지만, 레이저 빔은 수직 배향된다. 현미경 (도 1)를 통해 디지털 비디오 카메라에 의해 90 ° 아래에 기록되어, 레이저 광의 산란에 의해 조사 된 입자. 산란광 강도는 60 나노 미터보다 큰 입자 지름의 관찰을 허용한다. 이러한 설정에서 입자의 밝기 입경 용임 아니다. 어떠한 전계가인가되지 않는 경우, 입자 운동은 브라운 운동을 다음과 입경을 산출 지표로서 역할을 할 수있다. 그러나, 장비는 또한 셀의 채널을 가로 질러 전기장을인가 할 수있다. 이 필드를 실시 할 때, 전위, 극성 및 현탁 엑소 좀의 이온 전하의 레벨은 이동 방향의 상기 결정된다. 전기 영동 개월의 속도와 방향 결과내구 히스토그램. 고립 된 엑소 좀을 분석 할 수있는 최적의 방법을 찾는 것이 하나의 문제이지만, 또 다른 하나는 혈액, 복수, 소변, 우유, 양수 또는 세포 미디어 등 다양한 매체에서 엑소 좀의 효과적인 분리에있다. 다른 방법은 초 원심 (1)에 기초하는, 지금까지 설명되었다 (예 Exoquick 등) 산업 분리 시약 (7), (8)의 분리 또는 한외 여과를 이용한 항원 자성 비드 9 단계. 이 프로토콜에서는 초 원심 분리를 통하여 엑소의 전체 과정을 설명하고, 입자 트래킹기구를 통해 현탁액을 함유하는 생성 된 엑소 좀을 분석하는 방법을 보여준다. 인간 혈장 또는 세포 배양 배지 유래 엑소 좀의 분석에 대한 구체적인 고려 사항이 제공됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="645">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citrate tube</td>
			<td>BD</td>
			<td>364305</td>
			<td>BD Vacutainer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Distilled water</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3880087</td>
			<td>Aqua ad iniectabilia</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon tube</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>188271</td>
			<td>PP Tube, Steril 15ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultracentrifugation tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>357448</td>
			<td>Microfuge Tube Polyallomer 1,5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybead</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>07304</td>
			<td>2,6% Solids-Latex 
			Alignment Solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (Filter)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617053V</td>
			<td>5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (ZetaView)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606051V</td>
			<td>5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305180</td>
			<td>BD Blunt Fill Needle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td>16555</td>
			<td>Syringe filter, hydrophilic, 450&#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Material Name&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>L8-M</td>
			<td>Rotor: 70Ti Ser. No E21078</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZetaView</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>PMX 100, Type 101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>Rotor: A-4-44</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an innovative method for exosome quantification and size measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

이 데모에 사용 된 샘플은 85 %의 민감도, 감도 곡선의 최대 기울기 전에 (그림 2)와 측정을위한 최적의 설정을 보여줍니다. 프로토콜에서 권장하는대로 밝기, 분 / 최대 값이 선택되었다. 5.3 입자의 농도 / ㎖ X 입자의 평균 크기는 대부분이 0.137 μM의, 0.149 ㎛, 10 (6) 동안 측정 하였다. 측정 이후에 접수 된 값은 .pdf 인 파일 형식 또는 데이터베이스로 내보내기위한이 .txt로 보고서에 저장할 수 있습니다. 바람직한로서 프로토콜 (섹션 4)에서 기술 된 바와 같이 그래프가 조정될 수있다. 비디오 시퀀스는 저장되고 나중에 오프 - 라인 분석을 위해 다시 사용될 수있다. 하지만, 이러한 오프 - 라인 분석에서, 카메라의 사전 설정 취득 향적 변경할 수 없다. 측정을위한 최적의 파라미터 설정을 찾기 위해, 여기 설명 토륨100 nm의 폴리스티렌 표준 크기의 예에 장비 설정의 예를 최적화. 두 파라미터, 영상​​ 및 입자 크기 분포에 감도 및 최소 / 최대 크기의 영향을 상세하게 설명한다. 다른 모든 파라미터는 표 1에 요약되어있다. 아날로그 및 디지털 이미지에서 (50-94 범위)의 감도의 영향을 시각적 인상도 3에 가시화된다. 이미지로부터 유도 된 정량 정보는 표 1의 설정에 따라,도 4에 제시되어, 최소 사이즈 = 도 5 및 최대 크기 = 200 감도 대 검출 입자 수의 전형적인 관계는도 4a에 도시된다. 50과 90 사이에 감지 입자의 수​​는 감도 증가 90&gt; 민감도에 대한 극적으로 상승했다. 감도의 최적 범위는 66, 86 (A) 사이에서 발견되었다. 입도 분포는 DIF 얻어ferent 감도 설정도 4b에 표시됩니다. 입도 분포는 세 개의 개별 측정의 평균을 나타낸다. 오히려 가난한 통계 결과 몇 입자를 분석 하였다 너무 낮은 감도 (감도 = 62, 빨간색 곡선)를 참조하십시오. 분석 입자의 수​​는 민감도 증가 70 (노란색 곡선)과 86 (황갈색 곡선) 사이의 최적에 도달했습니다. 또한 작은 크기 (감도 = 94, 파란색 곡선)을 향해 이동 적하 입자 크기 분포의 개수 입도 분포의 열화 감도 이루어져.도 4c의 수를 기반 X50 직경의 추이 (50 %를 나타낸다 입자는 감도 함수로서)이 직경보다 작다. 적색 영역이 불량 통계 (감도가 너무 낮음) 또는 넓은 DISTRI의 결과&gt; 8 % RSD 나타내는 베이지 간격에서, 입자 크기의 RSD는 8 % 이하이고 A.에서 최적 간격에 해당작은 크기 (감도 너무 높은)에 시프트 시킴. 최소 크기, 최대 크기의 설정은 최소 크기보다 작고 최대 크기보다 큰 스폿 크기를 갖는 입자를 제거하기 위해 디지털 영상에 적용되는 필터이다. 빛을 산란 할 수있는 기능으로 인해 입자는 디지털 이미지에 특정 크기의 자리를 만듭니다. 스폿의 크기는 다수의 화소 (PX)로 측정된다. 입자가 아주 잘 (예를 들면, 입자&gt; 200 nm의 또는 집계를) 빛을 산란 할 때, 그 자리 크기는 예를 들어,&gt; 500 픽셀, 아주 큽니다. 스폿 크기는 입자 물질에 따라 작은 입자 (예를 들면, &lt;20 ㎚)에 대한 (예를 들면, &lt;10 PX) 확실히 작다. 그들이 동일하지 않은 이들 두 변수 사이에 직접적인 관계가 없기 때문에 스폿 사이즈 (PX)의 입자 크기 (㎚)로 상호 교환 될 수 없다. 최소 및 최대 크기의 최적화는 사용자가 응집체 (최대 크기) 또는 원하지 않는 작은 물체를 필터링 할 수 있도록이러한 배경 잡음 (최소 사​​이즈) 등의 개체. 100 nm의 표준 크기의 입자 크기 분포의 최대 / 최소 크기의 영향도 4d (감도 = 82)에 도시된다. 간격이 작은 스폿 크기로 설정되어있는 경우 (예를 들면, 분 = 1, 최대 = 52 주황색 곡선), 분석 된 입자의 수가 감소하고 개수를 기반 X50 직경이 약간 작은 크기쪽으로 시프트된다. 큰 반점의 설정 (분 = 40, 최대 = 1000; 붉은 곡선) 넓은 입자 크기 분포의 결과는 큰 크기를 향해 이동했다. 입자의 총 동일한 번호를 얻기 위해서, 오렌지 및 레드 모두 분포 구간 경계는 입자 (80)과 일치하도록 조정 하였다. 최적의 설정으로 분포 (분 = 5, 최대 = 200; 황갈색 곡선은) 360 입자로 구성되어 있습니다. 성공적인 일련의 실험 엑소 좀 초 원심 분리에 의해 단리하고 제시 NTA 시스템을 사용하여 측정하여 수행 하였다. 결과 데이터는 고도로 있었다일관성과 재현성의 높은 수준을 확인했다. 다른 분리 방법은 비슷한 결과를 보여 주어야한다. 그러나, 희석 단계는 특히 중요한 단계로서 식별하고, 산출 된 입자의 총 수에 미치는 영향을 재평가 할 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig1.jpg" /> NTA의 설정 그림 1. 도식. 현미경 / 비디오 축과 레이저 빔은 셀 채널 단면에서 횡단 서로 직교하도록 배향된다. 입자에 의해 산란 빛이 소프트웨어의 &quot;라이브 뷰&quot;창에 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig2.jpg" /> <stron감도 곡선 대 입자의 g&gt; 그림 2. 번호. 감도 곡선 대 입자의 수는 자동 감도 스캔하는 동안 한 순간에 하나의 위치에있는 입자를 표시합니다. 이 그래픽으로는 초기 측정을위한 최선의 환경 설정을 결정하는 데 사용된다. 감도 값이 그래프의 최대 기울기에 앞서 선택된다. 이 유물이 테스트 실험에서 제거되지 않고 그래프에 영향을 미칠 수 있다는 것을 기억하는 것이 중요하다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig3.jpg" /> 라이브 뷰 화면에서 입자의 아날로그 및 디지털 이미지. 시각화에 감도 그림 3. 영향은 모두 아날로그 (맨 윗줄) 50과 94 사이의 감도 표시됩니다D 디지털 (아랫 줄) 전망. 감도가 너무 낮 으면, 단 몇 입자 (왼쪽) 검출된다. 최적의 감도에서 입자는 서로 잘 (가운데)로부터 격리로 하나의 점을 나타납니다. 비교적 높은 감도 입자가 함께 이미지 품질 (오른쪽)로 이어지는 병합에. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig4.jpg" /> 제어 100 nm의 폴리스티렌 입자 샘플에 대한 민감도 최소 및 최대 크기 설정 그림 4. 영향 (A) 입자의 검출 수 대비 감도의 플롯.; 최적의 간격은 66-86 곡선의 최대 기울기에 앞서있다. (B) 입자 크기 분포는 여러 감도 설정 (62 94에 얻을); (62)이 너무 낮거나 너무 높은 대한 그래프 (94) 감도는 100 nm의 폴리스티렌 대조 시료에 대한 입도 분포를 포착하지 않는다. (C) 감도 대 번호 X50 기반 직경; 베이지 간격 X50의 오차는 8 % 이하가 최적의 간격 (66)에서 입자 크기 분포에 대한 최소 및 최대 크기 (86)의 (D)에 영향이다; 최적의 매개 변수 (분 = 5, 최대 = 200) 제어 샘플에 대한 정확한 분포를 캡처합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 사전 획득 매개 변수 </td></tr><tr><td> 감광도 </td><td> 변수 </td></tr><tr><td> 셔터 </td><td> (40) </td></tr><tr><td> 프레임 속도 </td><td> 30 프레임 </td></tr><tr><td> 해결 </td><td> 안녕GH </td></tr><tr><td> 사이클 </td><td> (10) </td></tr><tr><td> 여러 인수 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 위치 </td><td> (1) </td></tr><tr><td colspan="2"> 인수 후 매개 변수 </td></tr><tr><td> 최소 밝기 </td><td> (30) </td></tr><tr><td> 최대 크기 </td><td> 변수 </td></tr><tr><td> 최소 크기 </td><td> 변수 </td></tr></tbody></table> 입자 추적 장비의 설정에 대한 사전 및 사후 인수 매개 변수 표 1. 개요.

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An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

엑소 정량화 및 크기 측정을위한 혁신적인 방법

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

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Research

JoVE Journal

Biology

30.6K 조회수.  Heinrich-Heine-University Dusseldorf. A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

비디오: An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

단일 입자 수준에서 바이러스성 퓨전 속도론의 측정 방법

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

연구

생물학

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), and delta-cells (somatostatin) that are embedded in the exocrine tissues and comprise 1-2% of the entire pancreas. There is a close correlation between body and pancreas weight. Total beta-cell mass also increases proportionately to compensate for the demand for insulin in the body. What escapes this proportionate expansion is the size distribution of islets. Large animals such as humans share similar islet size distributions with mice, suggesting that this micro-organ has a certain size limit to be functional. The inability of large animal pancreata to generate proportionately larger islets is compensated for by an increase in the number of islets and by an increase in the proportion of larger islets in their overall islet size distribution. Furthermore, islets exhibit a striking plasticity in cellular composition and architecture among different species and also within the same species under various pathophysiological conditions. In the present study, we describe novel approaches for the analysis of biological image data in order to facilitate the automation of analytic processes, which allow for the analysis of large and heterogeneous data collections in the study of such dynamic biological processes and complex structures. Such studies have been hampered due to technical difficulties of unbiased sampling and generating large-scale data sets to precisely capture the complexity of biological processes of islet biology. Here we show methods to collect unbiased "representative" data within the limited availability of samples (or to minimize the sample collection) and the standard experimental settings, and to precisely analyze the complex three-dimensional structure of the islet. Computer-assisted automation allows for the collection and analysis of large-scale data sets and also assures unbiased interpretation of the data. Furthermore, the precise quantification of islet size distribution and spatial coordinates (i.e. X, Y, Z-positions) not only leads to an accurate visualization of pancreatic islet structure and composition, but also allows us to identify patterns during development and adaptation to altering conditions through mathematical modeling. The methods developed in this study are applicable to studies of many other systems and organisms as well.

Novel computer-assisted methods of large-scale procurement and analysis of immunohistochemically stained pancreatic specimens are described: (1) Virtual Slice capture of the entire section; (2) Mass analysis of large-scale data; (3) Reconstruction of 2D Virtual Slices; (4) 3D islet mapping; and (5) Mathematical analysis.

컴퓨터를 이용한 대규모 시각화 및 췌장 아일릿 질량, 크기 유통과 건축의 부량

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

랜덤 코니컬 틸트 메서드를 사용하여 Exosome 단지의 단일 입자의 전자 현미경의 재건

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Tangential Flow Ultrafiltration: A  &ldquo;Green&rdquo; Method for the Size Selection and Concentration of Colloidal Silver Nanoparticles

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to their powerful antimicrobial properties.3-6 These nanoparticle applications are strongly influenced by the AgNP size and aggregation state. Many challenges exist in the controlled fabrication7 and size-based isolation4,8 of unfunctionalized, homogenous AgNPs that are free from chemically aggressive capping/stabilizing agents or organic solvents.7-13 Limitations emerge from the toxicity of reagents, high costs or reduced efficiency of the AgNP synthesis or isolation methods (e.g., centrifugation, size-dependent solubility, size-exclusion chromatography, etc.).10,14-18 To overcome this, we recently showed that TFU permits greater control over the size, concentration and aggregation state of Creighton AgNPs (300 ml of 15.3 &mu;g ml-1 down to 10 ml of 198.7 &mu;g ml-1) than conventional methods of isolation such as ultracentrifugation.19
TFU is a recirculation method commonly used for the weight-based isolation of proteins, viruses and cells.20,21 Briefly, the liquid sample is passed through a series of hollow fiber membranes with pore size ranging from 1,000 kD to 10 kD. Smaller suspended or dissolved constituents in the sample will pass through the porous barrier together with the solvent (filtrate), while the larger constituents are retained (retentate). TFU may be considered a "green" method as it neither damages the sample nor requires additional solvent to eliminate toxic excess reagents and byproducts. Furthermore, TFU may be applied to a large variety of nanoparticles as both hydrophobic and hydrophilic filters are available.
The two main objectives of this study were: 1) to illustrate the experimental aspects of the TFU approach through an invited video experience and 2) to demonstrate the feasibility of the TFU method for larger volumes of colloidal nanoparticles and smaller volumes of retentate. First, unfuctionalized AgNPs (4 L, 15.2 &mu;g ml-1) were synthesized using the well-established Creighton method22,23 by the reduction of AgNO3 with NaBH4. AgNP polydispersity was then minimized via a 3-step TFU using a 50-nm filter (460 cm2) to remove AgNPs and AgNP-aggregates larger than 50 nm, followed by two 100-kD (200 cm2 and 20 cm2) filters to concentrate the AgNPs. Representative samples were characterized using transmission electron microscopy, UV-Vis absorption spectrophotometry, Raman spectroscopy, and inductively coupled plasma optical emission spectroscopy. The final retentate consisted of highly concentrated (4 ml, 8,539.9 &mu;g ml-1) yet lowly aggregated and homogeneous AgNPs of 1-20 nm in diameter. This corresponds to a silver concentration yield of about 62%.

Tangential Flow Ultrafiltration: A  &amp;ldquo;Green&amp;rdquo; Method for the Size Selection and Concentration of Colloidal Silver Nanoparticles

Tangential flow ultrafiltration (TFU) is a recirculation method used for the weight-based separation of biosamples. TFU was adapted to size-select (1-20 nm diameter) and highly concentrate a large volume of polydisperse silver nanoparticles (4 L of 15.2 &mu;g ml-1 down to 4 ml of 8,539.9 &mu;g ml-1) with minimal aggregation.

접선 흐름 Ultrafiltration : 콜로이드 실버 나노 입자의 크기 선택과 집중을위한 &quot;그린&quot;방법

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

비행 성능의 정확하고 빠른 측정을위한 개선 된 방법에<em&gt; 초파리</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&amp;#8217;s Esophagus Cells

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

바렛 식도 세포의 특성에 대한 면역 방법

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

공장 Polysom​​e 프로파일 링을위한 쉬운 방법

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. Three-dimensional (3D) cell culture techniques are a recent innovation developed to address the shortcomings of adherent cell culture. While several techniques for generating tissue analogues in vitro have been developed, these methods are frequently complex, expensive to establish, require specialized equipment, and are generally limited by compatibility with only certain cell types. Here, we describe a rapid and flexible protocol for aggregating cells into multicellular 3D spheroids of consistent size that is compatible with growth of a variety of tumor and normal cell lines. We utilize varying concentrations of serum and methyl cellulose (MC) to promote anchorage-independent spheroid generation and prevent the formation of cell monolayers in a highly reproducible manner. Optimal conditions for individual cell lines can be achieved by adjusting MC or serum concentrations in the spheroid formation medium. The 3D spheroids generated can be collected for use in a wide range of applications, including cell signaling or gene expression studies, candidate drug screening, or in the study of cellular processes such as tumor cell invasion and migration. The protocol is also readily adapted to generate clonal spheroids from single cells, and can be adapted to assess anchorage-independent growth and anoikis-resistance. Overall, our protocol provides an easily modifiable method for generating and utilizing 3D cell spheroids in order to recapitulate the 3D microenvironment of tissues and model the in vivo growth of normal and tumor cells.

Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.

3D 회전 타원체 생산을위한 효율적이고 유연한 셀 집계 방법

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY : 효모 성장의 다 변수 정량화를위한 ​​대규모 방법

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...