스트레스에 노출되면 단백질 응집을 일으킬 수 있으며 박테리아의 표현성 행동에 상당한 변화를 초래할 수 있습니다. 이 비디오에 설명된 절차는 스트레스 치료 후 단백질 골재의 추출 및 시각화를 허용합니다. 다른 게시된 절차와 는 달리, 이 프로토콜은 더 낮은 세포 수를 요구하고 복잡한 물리적 중단 프로세스뿐만 아니라 시간이 많이 소요되는 세척 및 잠복 단계를 기권합니다.
이 프로토콜은 그램 음성 및 그람 양성 박테리아의 다양한 단백질 응집을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 유전자 삭제의 효과를 분석하거나 프로테오독성 화합물의 효능을 비교할 수 있습니다. 대장균 균주 MG1655 및 비뇨기요법 대장균 균주 CFT073의 단일 콜로니를 리소게니 국물 또는 LB, 배지의 5밀리리터로 접종하여 시작한다.
두 국물 문화를 섭씨 37도, 300rpm에서 14~16시간 동안 배양합니다. 각 변형을 600 나노미터 또는 OD600의 광학 밀도로 0.1을 70 밀리리터의 MOPS-g 배지를 포함하는 500 밀리리터 플라스크로 희석시다. 플라스크를 37도 및 300 rpm에서 중간 로그 단계에 도달할 때까지 배양합니다.
인큐베이션 후, 각 문화의 20 밀리리터를 3개의 미리 따뜻하게 한 125밀리리터 플라스크로 옮기고 섭씨 37도, 300rpm에서 2분간 배양합니다. MOPS-g 배지에서 밀리리터당 2밀리그램 의 항균 화합물 용액을 준비합니다. 이 솔루션을 각 배양에 추가하여 원하는 농도에 도달하고 처리되지 않은 컨트롤에 필요한 양의 MOPS-g 배지를 추가합니다.
45분간의 스트레스 치료 후 각 배양의 OD600을 결정합니다. 각 샘플에 대해, 15 밀리리터 원심분리기 튜브에 하나의 OD600와 문화의 4 밀리리터를 알리쿼트. 얼음 차가운 용해 버퍼의 50 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
얼음에 30 분 동안 샘플을 배양. 360 마이크로리터의 얼음 냉간 버퍼 A를 샘플에 넣고 파이펫팅으로 부드럽게 섞습니다. 샘플을 약 2밀리리터 마이크로센심심분리기 튜브로 옮기고 약 200마이크로리터의 0.5밀리미터 유리 구슬을 전달합니다.
1400 rpm에서 흔들리는 ThermoMixer에서 섭씨 8도에서 30 분 동안 튜브를 배양하십시오. 유리 구슬을 정착시키기 위해 흔들리지 않고 5 분 동안 얼음에 튜브를 배양하십시오. 그런 다음 세포 용액의 200 마이크로 리터를 1.7 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 옮킨다.
원심 분리세포는 16, 000배, 섭씨 4도에서 20분 동안 용액을 흘린다. 나중에 수용성 단백질 샘플로 사용될 상체를 수집합니다. 파이펫을 사용하여 20분 동안 튜브의 얼음 냉기 버퍼 A.원심분리기 200마이크로리터에서 펠릿을 재보페한다.
그런 다음 신중하게 초상적 인 것을 완전히 제거하십시오. 파이펫을 사용하여 200마이크로리터의 얼음 냉간 완충B.원심분리기에서 펠릿을 조심스럽게 재보페하고, 상체를 조심스럽게 제거한다. 그런 다음 버퍼 A.resuspend 100 마이크로 리터S SDS 샘플 버퍼를 감소, 95 섭씨에서 ThermoMixer에서 5 분 동안 끓인다.
100%TCA의 1부피를 이전에 수집한 용해성 단백질 샘플 4부와 혼합하고 단백질 강수량에 대해 섭씨 4도에서 10분 동안 배양합니다. 샘플을 21, 000배, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리하여 침전을 얻고 상체를 제거합니다. 200 마이크로리터의 얼음 차가운 아세톤을 사용하여 펠릿을 세척하고 셀룰러 이물질을 제거하십시오.
침전을 얻기 위해 시료를 다시 원심분리하고 상체부를 제거합니다. 펠릿에서 나머지 아세톤을 제거하려면 ThermoMixer의 미세 원심 분리기 튜브를 뚜껑을 열어 섭씨 37도에서 유지합니다. 그런 다음 1x의 마이크로리터 100기를 추가하여 SDS 버퍼를 완전히 녹여 펠릿을 완전히 녹이고 샘플을 섭씨 95도에서 5분간 끓입니다.
즉시 분리를 위해 SDS 폴리아크릴아미드 젤에 샘플을 적재하거나 샘플을 영하 20도에서 저장하여 나중에 진행합니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 두 개의 분리 젤을 준비합니다. 1밀리리터 파이펫을 사용하여 유리 플레이트 사이에 젤을 부어 상부 2센티미터가 혼합물이 없도록 합니다.
분리 젤 위에 70%에탄올을 추가하여 두 레이어 사이에 짝수 인터페이스를 만듭니다. 분리 젤이 중합되면 텍스트 원고의 지침을 사용하여 스태킹 젤을 준비하십시오. 그런 다음 분리 젤에서 에탄올을 제거하고 스태킹 젤 용액을 추가합니다.
기포를 도입하지 않고 원하는 포켓 수의 빗을 조심스럽게 삽입하고 겔이 20~30분 동안 중합되도록 합니다. 각 샘플의 4개의 마이크로리터와 단백질 사다리를 별도의 우물에 적재합니다. 그런 다음 실온에서 45분 동안 144볼트에서 트리스 글리신 러닝 버퍼로 젤을 실행합니다.
미리 데워진 Fairbanks 솔루션 A를 사용하여 로커에 젤을 30분 동안 염색하고 페어뱅크스 솔루션 D를 미리 데워서 원하는 배경이 달성될 때까지 로커에 젤을 색칠할 수 있습니다. 세포가 밀리리터 당 175 마이크로그램과 항균제당 200 마이크로그램으로 치료될 때 형성된 단백질 골재의 양에서 증가가 관찰되었다. 불용성 단백질 분획의 증가는 더 민감한 MG1655 균주에서 더 두드러졌다.
세포가 밀리리터 당 175 마이크로그램과 항균제의 밀리리터 당 200 마이크로그램으로 치료될 때 수용성 단백질의 양에서 감소가 관찰되었다. 이 프로토콜을 시도할 때, 600 나노미터에서 광학 밀도로의 정규화는 시료의 단백질 응집 정도비교에 중요하다는 점에 유의하십시오.
