무척추 동물 디스크 변성은 높은 수준의 장애와 통증으로 이어집니다. 우리의 프로토콜은 우리가 형태학적 디스크 개발과 변성의 변화를 조사 할 수 있습니다. 조밀한 콜라겐 유형 1 네트워크는 일반적으로 현미경 검사법에 의하여 무척추 디스크를 분석하기 어렵게 만듭니다.
광학 단면을 통해, 우리는 다른 조직 내에서 연골세포의 3D 배열을 조사 할 수 있습니다. 먼저 수술 내 수득, 인터무테뇌 디스크 또는 IVD 샘플을 DMEM에 배치하여 부피 페니실린-연쇄상 구균B에 의해 2%의 부피, 볼륨 Amphotericin B에 의한 1.2%의 부피로 보충되며, 즉시 수집 후, 추가 처리까지 IVD 샘플을 섭씨 4도에 저장합니다. 동결된 경우 인간 IVD 샘플을 실온에서 해동하고 대학 밀도 및 방향과 같은 미세한 특성에 기초하여 인간 IVD 조직의 기원을 식별한다.
소 디스크 조직을 수집하려면, 두 개의 인접한 척추와 함께 IVD로 구성된 운동 세그먼트를 취하고 수술 블레이드 번호(15)를 사용하여, 서브콘드리아 뼈로부터 전체 소 디스크를 해부하고, 디스크를 뒤집어 중앙 영역에 도달한다. 연골의 다른 영역을 식별 한 후, 수술 블레이드 번호 20 또는 22를 사용하여 전체 디스크에서 관심 영역을 잘라냅니다. 20센티미터 보다 작은 크라운 럼프 길이를 가진 소 배아에서 IVDs는 해부 없이 처리되어야 합니다.
원고에 설명된 바와 같이 조직의 탈화를 수행했습니다. 성공적인 탈균을 확인, 20 게이지 바늘이 디스크 조직을 관통하는 경우, 또는 주목할만한 저항없이 척추를 적용 하는 경우. PBS에서 하룻밤 사이에 4%포름알데히드 용액의 10배 부피에서 조직 샘플을 섭씨 4도에서 정밀히 확인합니다.
다음 날, 조직을 극저온노메 노브에 수용성 포함 배지에 배치하여 축 평면이나 수직절단하는 평면이 정상적으로 생성된다. 표준 Cryotome을 사용하여 임베디드 조직을 인간 샘플의 70 마이크로미터 두께와 소 샘플의 40 마이크로미터로 절제합니다. PBS로 섹션을 세 번 헹구기 전에 유리 슬라이드의 섹션을 수집하고 적절한 형광 염료를 추가하고 장착 매체를 추가하고 커버 슬립으로 섹션을 덮습니다.
구조물 조명 장치를 시작하여 플로레스세미온 현미경의 샘플 홀더에 얼룩 조직 섹션이 있는 슬라이드를 배치하여 형광 필터와 적절한 조명을 사용하여 단일 시야 이미징을 수행합니다. 플로레스세이스 현미경과 호환되는 이미지 최적화 소프트웨어를 사용하여 강도와 밝기를 최적화하여 그림을 처리합니다. 전체 섹션을 시각화하려면 도구 모음 패널에서 60 개의 획득 설정을 열고 모자이크 레지스터의 모자이크 설정을 조정하여 모자이크 이미징 기술을 사용합니다.
이렇게 하려면 나중에 하나의 개요 이미지로 병합되어야 하는 열 및 뷰 필드 이미지의 행수를 정의하고 설정을 누르고 개별 타일의 초점 보정을 조정합니다. 강도와 밝기를 최적화하여 사진을 후처리합니다. 공간 연골세포 조직을 분석하기 위해 시작/정지 버튼으로 Z 스택 설정을 조정하여 소프트웨어에 통합된 3d 함수를 사용하여 Z 축및 슬라이스 거리의 시작 및 정지 위치와 같은 스캐닝 파라미터를 정의합니다.
개별 세포 패턴을 식별하고 셀룰러 패턴의 정량 적 분석을 위해 셀 카운트 플러그인을 사용하고, 계산된 셀을 관심 영역의 크기로 나누어 세포 밀도를 계산한다. 아눌루스와 부드러운 핵에 조밀한 콜라겐 섬유 네트워크를 가진 IVD의 아키텍처는 축 및 처질 평면에서 찍은 모자이크 이미지에서 인식될 수 있다. 모자이크 이미지에서 확대 된 영역에서, 같은 연골 세포의 다른 공간 조직 패턴; 단일 세포, 쌍과 문자열이 발견되었다.
소 아눌루스 섬유증의 다른 발달 및 성숙 단계의 연구는 배아 디스크 개발 도중 세포 밀도에 있는 연속적인 감소를 표시했습니다. 한편, 변성 시 성인 인간 디스크에서 세포 밀도 및 클러스터 형성이 증가하는 것을 관찰하였다. 소 아눌루스 섬유증 및 소 핵 펄포서스의 IVD 발달 초기 단계에서 세포 밀도는 출생까지 급격히 감소하였다.
에피토메를 가진 IVD의 채널 이미징에 의해 세포질 및 핵과 같은 공간 패턴의 3D 아키텍처의 시각화를 허용함으로써, 온전한 IVD 싱글뿐만 아니라 연골세포 쌍에서 발견되었다. 변성 된 항문 세포 클러스터에서 반면 발견 되었다. 가장 어려운 부분은 조직을 그 기원에 할당하고 단면에 대한 임베디드를 수정하는 것입니다.
이는 신뢰할 수 있는 결과를 얻는 데 필수적입니다. 서로 다른 단계와 기원에서 IVD 조직을 올바르게 해부하고 선택하면 ELISA 또는 원자력 현미경 검사법과 같은 추가 생화학 적 및 생화학 적 분석으로 분석을 심화 할 수 있습니다.
