우리는 문화 기술과의 도움이 조언을 쥴리 고든 박사 낸시 맨리에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 어린이 녹내장 재단과 샤론 - 스튜어트 무 홍채 증 연구들에 의해지지를 받고 있습니다.

마우스 배아 문화 : 모든 실험 절차를 검토하고 지속적으로 규제 감독을 유지 조지아 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인 된 프로토콜 번호의 A2010 07-119, 다음의 건강 지침의 국립 연구소와 엄격한에 따라 실시되었다. 1. 문화 미디어의 준비 <ol><li> 녹아웃 DMEM 녹아웃 혈청 교체 (KSR) (10 %), N-2 보충 (1X), 알부민, 소 혈청에서 (2 %), 페니실린 (다음 금액에 시판 줄기 세포 미디어와 보충 교재를 사용하여 배지를 준비 50 IU / ㎖), 스트렙토 마이신 (50 ㎍ / ㎖) 및 암포 테리 신-B (1.25 ㎍ / ㎖). 제조 된 배양 배지는 이전에 다음과 같은 변경으로 15 기술과 유사하다 : 안티 mycotics의 추가 및 특정 시약 및 장비의 세부 사항에 대한 항생제의 두 배 농도 (리에게 참조를 사용하여재료의 성). 참고 : 이전에 사용 (. 무어 - 스콧 등 15) 등의 항생제 농도는 배아 문화가 24 시간 기간까지 실시에 충분했다. 문화가 24 시간 이상 지속 된 경우에는, 우리는 문화의 오염을 경험하고이 성공적으로 항생제 농도를 두 배로에 의해 제어되었다. </li><li> 4 ° C에서 나 제조업체의 권장 사항에 따라 -20 ° C에서 미디어 구성 요소를 저장합니다. KSR 및 N-2 보충을 반복 동결 융해를 방지하기 위해 -20 ° C에서 분주에 보관해야합니다. 한 번 개봉 녹아웃 DMEM 제조 업체의 권고에 따라 30 일 이내에 사용하여야한다. 사용하기 전에, 37 ° C의 물을 욕조에있는 구성 요소를 따뜻하게 </li><li> 멸균 조건에서 미디어를 준비합니다. 모든 장비와 문화 후드에 배치하기 전에 70 % 알코올 스프레이와 미디어 구성 요소를 포함하는 병의 표면을 소독. </li><li> 미디어 구성 요소는 무균 비이커에 직접 필터 시스템 (코닝)에서 하나를 혼합 할 수있다. 먼저 녹아웃 DMEM에 알부민 분말을 추가합니다. 알부민이 완전히 용해 될 때까지 부드럽게 흔들어 잘 섞는다. 그런 다음 N-2 보충, KSR 및 항생제를 추가하고 피펫을 사용하여 잘 혼합. 그 후 진공 흡인으로 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터를 사용하여 미디어를 살균 고를. 사용할 때까지 4 ° C에서 50 ML 원뿔 튜브 및 저장소에 미디어를 분배. 일단 제조 된 미디어 문화 4 ~ 5 일 이내에 사용해야합니다. </li></ol> 2. 문화 장비의 제조 <ol><li> 유리 배양 병 및 고무 마개를 소독. 알루미늄 호일의 문화 병을 감싸고 물을 비이커에 고무 병 코르크를 배치하고 고압 증기 멸균에 의해 소독. </li><li> 문화를 시작하기 전에 70 % 알코올 스프레이 따뜻한 37 ° C에와 문화 실 (정밀 보육 단위)를 소독. 문화 챔버는 전자입니다문화 병을 보유하고있는 중앙에 회전 디스크를 보이지 않네요. 챔버로 가스 흐름은 압력계에 의해 규제되고 유량 끝에 유리관에서 물을 통해 공기 방울의 유출을 관찰함으로써 조정될 수있다. 이 롤링 병 배양 장치는 새로운 Cockroft (17)에 의해 도입 된 원래 장치의 수정 된 버전입니다. </li><li> 배양 챔버에 95 %, O2 / 5 % CO 2의 혼합 가스를 함유하는 가스 실린더를 연결하고 50 CC / 분의 유량을 제공하고 충분한 산소 공급을 보장 &quot;초당 하나의 기포&quot;에 가스 흐름을 조절 문화 배아. </li></ol> 3. 마우스 배아 수집 및 문화를위한 준비 <ol><li> 야생형 마우스 배아를 얻으려면, 우리는 C57BL/6J 및 CD-1 (찰스 리버 연구소) 유전 적 배경 계통의 마우스를 이용했다. </li><li> 매일 아침 질 플러그의 암컷 생쥐를 확인합니다. 일을 찾는 일에 정오전자 질 플러그 E0.5 DPC (일 성교를 게시)로 간주되어야한다. </li><li> 표준 프로토콜 다음 임신 쥐를 안락사에 의해 E10.5 DPC에 마우스 배아를 수집합니다. 마우스는 미국의 의학 협회 (AVMA) 동물의 안락사 (2013)에 대한 지침에 지정된대로 CO 2 흡입 장치를 이용하여 안락사했다. 죽음을 보장하기 위해, 자궁 경부 전위는 CO 2에 노출 된 후 실시 하였다. </li><li> 악기에 복부 머리의 고착을 방지하기 위해 복부 복부 표면에 70 % 에탄올 스프레이. 그런 다음 날카로운 무딘 운영 가위와 자궁의 위치를​​ 집게를 microdissecting에서 4-3/4의 쌍을 사용하여 배쪽으로 복강을 엽니 다. microdissecting 집게에 4를 사용하면 전체 자궁을 들어 올려 자궁 몸에와 자궁 뿔의 끝에서 빛을 운영 가위로 절단하여 몸에서 분리. </li><li> 빨리 씻어 1X PBS에서 전체 자궁은 37 ° C로 가열자궁에있는 혈액의 고집을 제거하고 즉시 DMEM에 배치하는 페트리 접시에 37 ° C로 가열. 더 사용하기 전에 70 %의 에탄올 스프레이기구를 소독. 참고 : PBS, DMEM과 문화 매체를 포함하고, 전체 과정 동안 37 ° C에서 그들을 유지하는 솔루션을 예열하는 것은 좋습니다. </li><li> 해부 현미경, 자궁 준하는 빛 운영 가위로 해부한다. 이것은 (무딘 단부) 변경됨 microdissecting 용 핀셋 부드럽게 개구를 넓히기 위해 삽입 될 수있는 분할 된 자궁의 양쪽에 작은 개구 초래한다. 이것은 조심스럽게 레이 처트의 막을 정수리 난황 (PYS)를 노출 microdissecting 핀셋 한 쌍의 찢어에 의해 제거 될 수있다 태반 탈락의 노출을 허용합니다. 핀셋의 한쪽 가장자리를 사용하여 부드럽게 PYS와 함께 레이 처트의 막을 뚫고 일부터 분리전자 난황 (VYS를) 기본은 그대로 VYS으로 배아를 노출 층. ectoplacental 콘과 trophoectoderm 유도체는 태반의 탈락 또는 레이 처트의 막으로도 제거 할 수 있습니다. 치료는 태아가 즉시 팝업으로 VYS의 파열을 방지하기 위해주의해야합니다. </li><li> 그대로 VYS와 배아는 배양 배지는 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 37 ° C로 가열이 들어있는 페트리 접시에 전송해야합니다. 참고 : 바로 자궁에서 분리 한 후 배양 배지에 전송 문화 배아의 더 나은 발전을 위해 도움이됩니다. </li><li> 작은 구멍은 주요 혈관을 피하는 microdissecting 핀셋 한 쌍의 난황에서해야한다. 핀셋 샤프한 쌍 부드럽게 머리 영역에 인접 영역에 관통하여 개구부를 만들기 위해 사용될 수있다. 또는 무딘 핀셋 두 쌍의 난황을 잡고 조심스럽게 작은 구멍을 만들기 위해 눈물을 사용할 수 있습니다.그런 다음 부드럽게 배아의 머리에 맞게 충분한 크기로 족집게로 확장하여 개방을 확대. 밀접하게 배아를 포장하는 양막 부드럽게 떨어져 몸에서 개최 핀셋을 사용하여 찢어해야합니다. 15 주머니 노른자의와 배아 혈관의 무결성을 유지하면서 배아 머리 이후 전체 배아 부드럽게 난황에서 exteriorized해야한다. 참고 : 난황 혈관에 어떤 손상이 잠재적으로 문화 태아의 발달에 영향을 미칠 수있다. 손상된 혈관과 같은 배아는 배양을 위해 사용해서는 안되며 나중에 폐기 할 수있는 배아를 준비 사용할 수 있습니다. </li><li> 배아 준비 기준 : 몸과 머리의 크기, 사지 각 그룹에서 두 개 이상의 배아를위한 체절의 수 (들)을 계산하여 눈의 형태와 단계 등의 형태 학적 기준에 따라 해부 현미경 및 그룹에서 배아를 검사합니다. &lt;강한&gt; 참고 : 보통 자궁 내 발달에있는 같은 쓰레기의 차이에서 얻은 몸의 크기, 형태 학적 특징과 somites의 수에 차이가 배아. 그러나, 우리는 우리의 형태 학적 기준에 따라 분류 된 배아는 보통 비슷한 체절 번호 (± 1) 전시 것으로 나타났습니다. 이러한 이유로, 본 배양을 시작하는 시간을 지연하는 것처럼 각각의 배아위한 somites를 카운트 할 필요가 없다. 참고 : 문화 somites를 계산하는 데 사용 된 배아를 사용하지 마십시오. 배양 개시까지의 시간 지연을 방지하기 위해 다른 배아위한 배양을 시작한 후 somites 횟수. 자궁에서 분리 한 후 배양 연기 된 배아는 보통 가난한 개발을 나타낸다. </li><li> 매체는 37 ° C로 가열 신선한 문화를 페트리 접시에 즉시 배아를 전송하고 배아를 다시 멸균의 cultur와 페트리 접시에 전송해야하는 문화 후드로 가져전자 매체는 매체와 문화 병에 넣어 전에 문화를 시작합니다. 참고 : 배아에 대한 다수의 미디어 전송을 문화 배아 수집 및 해부의 여러 단계가 문화 후드에 설치되지 않은 해부 현미경을 수행 하였다으로 오염을 방지하는 데 도움이되기 전에. 참고 : 쓰레기의 크기 (&gt; 12 배아), 공정의 절반 배아 크고 문화를 시작하거나 배지와 함께 접시에 넣어 37 ℃에서 CO 2 배양기에 배치하는 경우 배아는 더 긴 기간 (&gt; 35 ~ 40 분) 밖에 서 왼쪽 때 우리는 천천히 그리고이 문화에 나중에 개발에 영향을 미칠 것입니다 심장 박동을 관찰했다. </li></ol> 4. 마우스 배아를 배양 <ol><li> 문화 후드에서 멸균 배양 병을 열고 적절하게 레이블을 붙입니다. 문화 매체의 이동 3 ㎖를 t에 각각 37 ° C로 가열그 병 후 마우스 배아 멸균 플라스틱 이전 피펫을 사용하여 배양 병으로 부드럽게 이송한다. 문화 병은 배양 장치의 회전 디스크에 문화 병을 유지하는 데 도움이 고무 병 코르크 덮인해야합니다. 참고 : 미디어와 문화 병 쥐를 안락사 전에 준비 및 배양 장치의 회전 디스크에 배치 할 수 있습니다. 이것은 배양 병에 배아의 전송 시간을 단축시킨다. 참고 : 마우스 배아는 개별적으로 또는 같은 문화 병 두 개 또는 세 개의 배아와 공 배양으로 배양 될 수있다. </li><li> 문화 병은 무균 적으로 37 ° C에서 배양 장치에 실시 단단히 고무 코르크 회전 디스크의 구멍에 후크해야합니다. EMBR의 무료 부상을 수 분 (RPM) 당 35 회전의 일정한 속도로 회전하는 회전 디스크를 켭니다또한 언론과의 YOS은 배아 조직으로 무료 가스 교환에 도움이됩니다. 문화 실에 연결된 실린더에서 가스는 문화 병에 회전 디스크와 고무 마개를 통해 흐른다. </li><li> 정기적으로 문화 16-40 시간 동안 배아 및 가스 유출 및 문화 챔버 온도를 확인합니다. 참고 : 마우스 배아의 조작을 문화 : 배아가 적어도 30 분 동안 배양 조건에 적응하자. 그런 저조한 수행 미약 하트 비트를 나타내는 배아는 폐기 될 수 있고, 나머지는 상기 배아 조작 연구에 이용 될 수있다. 이러한 일렉트로의 5,9,16, microinjections 18, 구슬 주입 16, 약물 치료 및 기타 절차 등의 배아 조작은이 시간에 수행 할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 초기 눈 개발에 자신의 역할을 연구하는 특정 신호 전달 분자로 취급 아피 - 겔 아가로 오스 비즈의 주입을 수행 하였다. 배아 후조작은 새로운 매체에 다시 반환과 문화에 계속 될 수있다. </li><li> 9 ~ 10 시간과 문화의 18 ~ 19 시간 배양 40 시간 동안 계속 된 후 특정 간격으로 완전히 새로운 미디어와 문화 매체를 교체합니다. 참고 : 문화가 16 ~ 18 시간에 의해 정지되는 경우 문화 미디어 교체가 필요하지 않을 수 있습니다. </li><li> 문화의 성공의 측정 : 문화의 배아 성장이 신체 크기의 증가, 체절 번호와 머리, 사지, 심장, 눈의 형태 개발에 의해 평가되어야한다 동안 문화 배아의 생존이 몸에 볼 심장 박동과 혈액 순환에 의해 결정되어야한다. </li><li> E11.0 DPC (~ 40-41들)과 E12.0 DPC (~ 49 ~ 50 초)에서 자궁 개발 배아에서 각각 16 ~ 18 시간과 38 ~ 40 시간, 배양 한 배아를 비교하기위한 대조군으로 사용되어야한다. </li><li> 문화 동안과 자궁의 단계에 대해 서로 다른 시점에서 배아 발달은 존을 할 수 있습니다해부 현미경 하에서이라는 군. 스팟 이미징 소프트웨어는 이미지를 캡처하기 위해 이용 이상 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 처리 하였다. </li></ol>

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우리는 어떤 경쟁하는 금융 이익이 없습니다.

중간 임신 단계 마우스 배아는 37 ° C에서 95 % O 2 / 5 더 롤링 병 배양 장치에서 %의 CO 2의 분위기에 혈청이없는 배지에서 배양 하였다 배아 개발 EX의 자궁은 자궁이 문화의 완성 (그림 1)에 안락사 생쥐에서 분리되는 순간부터 절차를 수행하는 동안 각 단계에서 여러 요인에 결정적으로 의존했다. 발전을 좌우하는 가장 중요한 요소는 배양을 시작하는 데 ...

체외에서 전체 배아를 이용한 배양 방법은 자궁에 접근하기 어려운 배아의 기관 형성에 관여 메커니즘을 신호 공부하기에 적합합니다. 전체 배아 조직의 무결성을 제공하고 필수적인 메커니즘을 신호의 적시 발생에 매우 중요한 조직의 상호 작용에 대한 적절한 지원 기관 형성 기간 동안 다른 세포 과정에 대한. 전체 배아 문화는 등 이식 연구, 유전자 및 조직 조작 구슬 주입 연구, 독성 연구, 같은 응용 프로그램의 과다를위한 플랫폼을 제공하는 반면., 현재 사용 배아 배양 시스템은 태아의 적절한 성장과 유지 보수를위한 혈청에 주로 의존 문화 1-9. 혈청 배양 배지 6 ~ 8, 10, 11의 10-100%에 이르기까지의 주요 구성 요소의 하나로서 활용되고 있습니다.하지만, 혈청의 조성물은 잘 정의되지 않은 동물 및 동물에 따라 다를 수 있고, 각 시간은 혈청을 수집한다. 혈청 실험 준비 시간을 소모하고 엄격한 절차를 포함하는 동안, 조달 혈청 상업적으로 다른 많은 사이에 상당한 변화를 전시 및 실험 비용을 발생시킵니다. 이러한 추가, 혈청은 잠재적으로 특정 실험의 결과에 영향을 미칠 수있는 성장 인자, 호르몬, 또는 다른 단백질, 조직의 상호 작용에 중요한 신호 분자의 연구를 포함하는 특히 알 수없는 요소를 포함 할 수있다. 연구는 문화 혈청의 첨가가 잠재적으로 순환 아데노신 monophosphate (캠프) 및 세포 분열 신호 및 phosphoinositide 3에 관련된 단백질 (PI 3) - 키나제 경로 12-14 신호와 같은 특정 신호 전달 분자의 세포 내 수준을 변경할 수있는 것으로 나타났습니다. 이들과는 반대로, 무 혈청 배양 시스템은 항원이없는 환경의 이점을 제공한다세포 프로세스를 변경할 수 생물학적 활성 효소 절제 실험 사이의 일관성을 가능하게합니다. 본 연구에서는 37에서 95 % O 롤링 병 배양 장치의 2 / 5 % CO 2의 분위기에서 문화 중반 태동 단계 전체 배아에 상업적으로 이용 가능한 줄기 세포 미디어 보충제 제조 된 무 혈청 배지를 이용 C 15, 16 °. 이러한 정의 된 조건에서 16-40 시간 동안 배양 한 쥐의 배아 세포의 증식, 이동, 분화 및 조직 상호 작용의 적절한 수준을 나타내는 등의 심장, 사지, 뇌, 눈 등 전체 배아 몸과 다른 구조의 형태 개발 진행을 보였다. 같은 눈과 같은 복잡한 장기 시스템 중 하나에 대한 문화의 배아 발달의 분자 분석은 EMBR에 안구 조직의 관찰과 일치하는 눈 개발을 발표YOS는 (준비, Kalaskar과 로더데일) 자궁에서 개발. 따라서 우리는 중앙 임신 단계에서 배양 한 쥐의 배아가 자궁에서 개발 태아에서 관찰 된 것과 유사한 진보적 인 성장과 형태 개발을 전시 것을 보여줍니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<tbody>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10829-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Stock: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418-50G</td>
			<td>Stock: 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic - Antimycotic Solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-004-Cl</td>
			<td>Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 &#181;g/ml; Amphotericin (250&#181;g/ml)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;&#160;</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Incubator Unit</td>
			<td>B.T.C. Engineering Milton Cambridge England</td>
			<td>Id.No. 840-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottles for Rotating Unit</td>
			<td>B.T.C. Engineering</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Rubber Cork</td>
			<td>B.T.C. Engineering</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2/5% CO2 Cylinder</td>
			<td>AirGas Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi SV6 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Water Jacketed Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>Model: 3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Hood</td>
			<td>Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2</td>
			<td>Model: Nu-425-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IsoTemp205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh Balance</td>
			<td>Mettler Toledo&#160;</td>
			<td>AG285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube &#8211; 50ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Operating Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Sharp-Blunt Scissors&#160;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps &#8211; 4&#8221;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps - Hudson (cWALD) &#8211; 4-3/4&#8221;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (5/45)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5005</td>
			<td>Modified - Sharp ends were made blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (5)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5060</td>
			<td>Modified - Sharp ends were made blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (55)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5063</td>
			<td>Modified - Sharp ends were made blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Tray</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RT-1401S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Tray Lid</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RT-1401L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish-100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>087571Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish-60mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish-35mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0875711YZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-aid Pipetter</td>
			<td>Drummond Scientific Co.</td>
			<td>D57849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipette-10ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serological Pipette-25ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipette - 7.7ml</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>202-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system

중간 회임 스테이지 마우스 배아 산소화 롤링 병 배양 시스템에서 시판 줄기 세포 미디어 보조제로부터 제조 무 혈청 배지를 이용하여 배양 하였다. E10.5에서 마우스 배아는 신중 그대로 난황과 자궁에서 분리하고, 난황과 태아의 혈관 연속성을 유지하면서 정확한 수술 기동을 포함하는 과정에서 배아는 부드럽게 난황에서 exteriorized했다. 그대로 난황 또는 제거 난황을 준비 배아에 비해,이 배아는 우수한 생존율과 유사한 조건에서 배양 개발 진행을 보였다. 우리는이 마우스 배아 때 16-40 시간 동안 37 ° C에서 95 % O 롤링 병 배양 장치의 2 / 5 % CO 2의 분위기에 정의 된 배지에서 배양, 비교 형태의 성장과 발전을 전시 것을 보여 배아는 자궁에 개발. 우리는 토륨 생각방법은 배아의 기관 형성에 중요한 신호의 상호 작용을 연구하기 위해 전체 배아 문화를 활용할 필요가 조사에 유용 할 것입니다.

마우스 배아의 개발은 전 자궁 자궁이 배아는 배양 시간에 몸에서 분리 될 때부터 여러 요인에 따라 달라집니다. 그림 1에 도시 된 바와 같이, 절차는 몸에서 임신하는 자궁의 분리 (그림 1A), 그대로 난황 (그림 1B)와 배아의 분리를 포함하여 일련의 단계를 포함, 난황에서 배아의 exteriorization ( 그림 1C), 37 ° C에서 95 % O 롤링 병 배양 장치의 <s...

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Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

배아 배양에 활용 혈청 특히 신호의 상호 작용을 포함하는 연구 실험의 결과에 영향을 미칠 수있는 알 수없는 구성 요소가 포함되어 있습니다. 여기서 우리는 혈청 산소 배양 시스템을 활용하고 16-40 시간 동안 배양 한 중간 회임 마우스 배아가 자궁에서 개발 태아에 비해 형태 개발을 전시 것을 보여줍니다.

무 혈청 전체 배아 배양 시스템에서 마우스 배아 개발

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

mouse-embryonic-development-serum-free-whole-embryo-culture

Research

JoVE Journal

Biology

25.6K 조회수.  University of Georgia.  배아 배양에 활용 혈청 특히 신호의 상호 작용을 포함하는 연구 실험의 결과에 영향을 미칠 수있는 알 수없는 구성 요소가 포함되어 있습니다. 여기서 우리는 혈청 산소 배양 시스템을 활용하고 16-40 시간 동안 배양 한 중간 회임 마우스 배아가 자궁에서 개발 태아에 비해 형태 개발을 전시 것을 보여줍니다. 

비디오: Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

인간 배아 줄기 세포의 문화 및 유지 관리

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

연구

생물학

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of the lung endoderm with its surrounding mesenchyme and mesothelium. Lung mesenchyme has been shown to be the source of inductive signals for lung branching morphogenesis. Epithelial-mesenchymal-mesothelial interactions are also critical to embryonic lung morphogenesis. Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system (in the absence of maternal influence and blood flow). More importantly this technique can be readily done in a serumless, chemically defined culture media. Gain and loss of function can be achieved using expressed proteins, recombinant viral vectors and/or analysis of transgenic mouse strains, antisense RNA, as well as RNA interference gene knockdown.

Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system.

마우스 배아의 폐 문화, 분기의 분자 메커니즘을 평가하는 시스템

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

전 비켜</em이미징 및 미세 애플 리케이션에 적합> 치킨의 배아 문화 시스템

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

회전 형 바틀 문화 시스템을 사용 로던트 전체 엠브료 문화의 방법

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

가스 투과 재료 기술로 HYPERStack 용기를 사용하여 닫힌 체계의 세포 배양 프로토콜

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

배아 림브 스킨 Vasculature에 대한 전체 마운트 Immunohistochemical 분석 : 엠브료에 혈관 분기 Morphogenesis를 공부하는 모델 시스템

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

위한 시스템<em&gt; 예 생체</em배아 췌장의&gt; 배양

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

소설<em&gt; 생체</em배아 마우스 사랑을&gt; 문화 방법

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 문화 시스템 갑상선 개발을 연구하는

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.