Name: mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system
Uploaded: 2014-03-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
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우리는 문화 기술과의 도움이 조언을 쥴리 고든 박사 낸시 맨리에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 어린이 녹내장 재단과 샤론 - 스튜어트 무 홍채 증 연구들에 의해지지를 받고 있습니다.

마우스 배아 문화 : 모든 실험 절차를 검토하고 지속적으로 규제 감독을 유지 조지아 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인 된 프로토콜 번호의 A2010 07-119, 다음의 건강 지침의 국립 연구소와 엄격한에 따라 실시되었다. 1. 문화 미디어의 준비 <ol><li> 녹아웃 DMEM 녹아웃 혈청 교체 (KSR) (10 %), N-2 보충 (1X), 알부민, 소 혈청에서 (2 %), 페니실린 (다음 금액에 시판 줄기 세포 미디어와 보충 교재를 사용하여 배지를 준비 50 IU / ㎖), 스트렙토 마이신 (50 ㎍ / ㎖) 및 암포 테리 신-B (1.25 ㎍ / ㎖). 제조 된 배양 배지는 이전에 다음과 같은 변경으로 15 기술과 유사하다 : 안티 mycotics의 추가 및 특정 시약 및 장비의 세부 사항에 대한 항생제의 두 배 농도 (리에게 참조를 사용하여재료의 성). 참고 : 이전에 사용 (. 무어 - 스콧 등 15) 등의 항생제 농도는 배아 문화가 24 시간 기간까지 실시에 충분했다. 문화가 24 시간 이상 지속 된 경우에는, 우리는 문화의 오염을 경험하고이 성공적으로 항생제 농도를 두 배로에 의해 제어되었다. </li><li> 4 ° C에서 나 제조업체의 권장 사항에 따라 -20 ° C에서 미디어 구성 요소를 저장합니다. KSR 및 N-2 보충을 반복 동결 융해를 방지하기 위해 -20 ° C에서 분주에 보관해야합니다. 한 번 개봉 녹아웃 DMEM 제조 업체의 권고에 따라 30 일 이내에 사용하여야한다. 사용하기 전에, 37 ° C의 물을 욕조에있는 구성 요소를 따뜻하게 </li><li> 멸균 조건에서 미디어를 준비합니다. 모든 장비와 문화 후드에 배치하기 전에 70 % 알코올 스프레이와 미디어 구성 요소를 포함하는 병의 표면을 소독. </li><li> 미디어 구성 요소는 무균 비이커에 직접 필터 시스템 (코닝)에서 하나를 혼합 할 수있다. 먼저 녹아웃 DMEM에 알부민 분말을 추가합니다. 알부민이 완전히 용해 될 때까지 부드럽게 흔들어 잘 섞는다. 그런 다음 N-2 보충, KSR 및 항생제를 추가하고 피펫을 사용하여 잘 혼합. 그 후 진공 흡인으로 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터를 사용하여 미디어를 살균 고를. 사용할 때까지 4 ° C에서 50 ML 원뿔 튜브 및 저장소에 미디어를 분배. 일단 제조 된 미디어 문화 4 ~ 5 일 이내에 사용해야합니다. </li></ol> 2. 문화 장비의 제조 <ol><li> 유리 배양 병 및 고무 마개를 소독. 알루미늄 호일의 문화 병을 감싸고 물을 비이커에 고무 병 코르크를 배치하고 고압 증기 멸균에 의해 소독. </li><li> 문화를 시작하기 전에 70 % 알코올 스프레이 따뜻한 37 ° C에와 문화 실 (정밀 보육 단위)를 소독. 문화 챔버는 전자입니다문화 병을 보유하고있는 중앙에 회전 디스크를 보이지 않네요. 챔버로 가스 흐름은 압력계에 의해 규제되고 유량 끝에 유리관에서 물을 통해 공기 방울의 유출을 관찰함으로써 조정될 수있다. 이 롤링 병 배양 장치는 새로운 Cockroft (17)에 의해 도입 된 원래 장치의 수정 된 버전입니다. </li><li> 배양 챔버에 95 %, O2 / 5 % CO 2의 혼합 가스를 함유하는 가스 실린더를 연결하고 50 CC / 분의 유량을 제공하고 충분한 산소 공급을 보장 &quot;초당 하나의 기포&quot;에 가스 흐름을 조절 문화 배아. </li></ol> 3. 마우스 배아 수집 및 문화를위한 준비 <ol><li> 야생형 마우스 배아를 얻으려면, 우리는 C57BL/6J 및 CD-1 (찰스 리버 연구소) 유전 적 배경 계통의 마우스를 이용했다. </li><li> 매일 아침 질 플러그의 암컷 생쥐를 확인합니다. 일을 찾는 일에 정오전자 질 플러그 E0.5 DPC (일 성교를 게시)로 간주되어야한다. </li><li> 표준 프로토콜 다음 임신 쥐를 안락사에 의해 E10.5 DPC에 마우스 배아를 수집합니다. 마우스는 미국의 의학 협회 (AVMA) 동물의 안락사 (2013)에 대한 지침에 지정된대로 CO 2 흡입 장치를 이용하여 안락사했다. 죽음을 보장하기 위해, 자궁 경부 전위는 CO 2에 노출 된 후 실시 하였다. </li><li> 악기에 복부 머리의 고착을 방지하기 위해 복부 복부 표면에 70 % 에탄올 스프레이. 그런 다음 날카로운 무딘 운영 가위와 자궁의 위치를​​ 집게를 microdissecting에서 4-3/4의 쌍을 사용하여 배쪽으로 복강을 엽니 다. microdissecting 집게에 4를 사용하면 전체 자궁을 들어 올려 자궁 몸에와 자궁 뿔의 끝에서 빛을 운영 가위로 절단하여 몸에서 분리. </li><li> 빨리 씻어 1X PBS에서 전체 자궁은 37 ° C로 가열자궁에있는 혈액의 고집을 제거하고 즉시 DMEM에 배치하는 페트리 접시에 37 ° C로 가열. 더 사용하기 전에 70 %의 에탄올 스프레이기구를 소독. 참고 : PBS, DMEM과 문화 매체를 포함하고, 전체 과정 동안 37 ° C에서 그들을 유지하는 솔루션을 예열하는 것은 좋습니다. </li><li> 해부 현미경, 자궁 준하는 빛 운영 가위로 해부한다. 이것은 (무딘 단부) 변경됨 microdissecting 용 핀셋 부드럽게 개구를 넓히기 위해 삽입 될 수있는 분할 된 자궁의 양쪽에 작은 개구 초래한다. 이것은 조심스럽게 레이 처트의 막을 정수리 난황 (PYS)를 노출 microdissecting 핀셋 한 쌍의 찢어에 의해 제거 될 수있다 태반 탈락의 노출을 허용합니다. 핀셋의 한쪽 가장자리를 사용하여 부드럽게 PYS와 함께 레이 처트의 막을 뚫고 일부터 분리전자 난황 (VYS를) 기본은 그대로 VYS으로 배아를 노출 층. ectoplacental 콘과 trophoectoderm 유도체는 태반의 탈락 또는 레이 처트의 막으로도 제거 할 수 있습니다. 치료는 태아가 즉시 팝업으로 VYS의 파열을 방지하기 위해주의해야합니다. </li><li> 그대로 VYS와 배아는 배양 배지는 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 37 ° C로 가열이 들어있는 페트리 접시에 전송해야합니다. 참고 : 바로 자궁에서 분리 한 후 배양 배지에 전송 문화 배아의 더 나은 발전을 위해 도움이됩니다. </li><li> 작은 구멍은 주요 혈관을 피하는 microdissecting 핀셋 한 쌍의 난황에서해야한다. 핀셋 샤프한 쌍 부드럽게 머리 영역에 인접 영역에 관통하여 개구부를 만들기 위해 사용될 수있다. 또는 무딘 핀셋 두 쌍의 난황을 잡고 조심스럽게 작은 구멍을 만들기 위해 눈물을 사용할 수 있습니다.그런 다음 부드럽게 배아의 머리에 맞게 충분한 크기로 족집게로 확장하여 개방을 확대. 밀접하게 배아를 포장하는 양막 부드럽게 떨어져 몸에서 개최 핀셋을 사용하여 찢어해야합니다. 15 주머니 노른자의와 배아 혈관의 무결성을 유지하면서 배아 머리 이후 전체 배아 부드럽게 난황에서 exteriorized해야한다. 참고 : 난황 혈관에 어떤 손상이 잠재적으로 문화 태아의 발달에 영향을 미칠 수있다. 손상된 혈관과 같은 배아는 배양을 위해 사용해서는 안되며 나중에 폐기 할 수있는 배아를 준비 사용할 수 있습니다. </li><li> 배아 준비 기준 : 몸과 머리의 크기, 사지 각 그룹에서 두 개 이상의 배아를위한 체절의 수 (들)을 계산하여 눈의 형태와 단계 등의 형태 학적 기준에 따라 해부 현미경 및 그룹에서 배아를 검사합니다. &lt;강한&gt; 참고 : 보통 자궁 내 발달에있는 같은 쓰레기의 차이에서 얻은 몸의 크기, 형태 학적 특징과 somites의 수에 차이가 배아. 그러나, 우리는 우리의 형태 학적 기준에 따라 분류 된 배아는 보통 비슷한 체절 번호 (± 1) 전시 것으로 나타났습니다. 이러한 이유로, 본 배양을 시작하는 시간을 지연하는 것처럼 각각의 배아위한 somites를 카운트 할 필요가 없다. 참고 : 문화 somites를 계산하는 데 사용 된 배아를 사용하지 마십시오. 배양 개시까지의 시간 지연을 방지하기 위해 다른 배아위한 배양을 시작한 후 somites 횟수. 자궁에서 분리 한 후 배양 연기 된 배아는 보통 가난한 개발을 나타낸다. </li><li> 매체는 37 ° C로 가열 신선한 문화를 페트리 접시에 즉시 배아를 전송하고 배아를 다시 멸균의 cultur와 페트리 접시에 전송해야하는 문화 후드로 가져전자 매체는 매체와 문화 병에 넣어 전에 문화를 시작합니다. 참고 : 배아에 대한 다수의 미디어 전송을 문화 배아 수집 및 해부의 여러 단계가 문화 후드에 설치되지 않은 해부 현미경을 수행 하였다으로 오염을 방지하는 데 도움이되기 전에. 참고 : 쓰레기의 크기 (&gt; 12 배아), 공정의 절반 배아 크고 문화를 시작하거나 배지와 함께 접시에 넣어 37 ℃에서 CO 2 배양기에 배치하는 경우 배아는 더 긴 기간 (&gt; 35 ~ 40 분) 밖에 서 왼쪽 때 우리는 천천히 그리고이 문화에 나중에 개발에 영향을 미칠 것입니다 심장 박동을 관찰했다. </li></ol> 4. 마우스 배아를 배양 <ol><li> 문화 후드에서 멸균 배양 병을 열고 적절하게 레이블을 붙입니다. 문화 매체의 이동 3 ㎖를 t에 각각 37 ° C로 가열그 병 후 마우스 배아 멸균 플라스틱 이전 피펫을 사용하여 배양 병으로 부드럽게 이송한다. 문화 병은 배양 장치의 회전 디스크에 문화 병을 유지하는 데 도움이 고무 병 코르크 덮인해야합니다. 참고 : 미디어와 문화 병 쥐를 안락사 전에 준비 및 배양 장치의 회전 디스크에 배치 할 수 있습니다. 이것은 배양 병에 배아의 전송 시간을 단축시킨다. 참고 : 마우스 배아는 개별적으로 또는 같은 문화 병 두 개 또는 세 개의 배아와 공 배양으로 배양 될 수있다. </li><li> 문화 병은 무균 적으로 37 ° C에서 배양 장치에 실시 단단히 고무 코르크 회전 디스크의 구멍에 후크해야합니다. EMBR의 무료 부상을 수 분 (RPM) 당 35 회전의 일정한 속도로 회전하는 회전 디스크를 켭니다또한 언론과의 YOS은 배아 조직으로 무료 가스 교환에 도움이됩니다. 문화 실에 연결된 실린더에서 가스는 문화 병에 회전 디스크와 고무 마개를 통해 흐른다. </li><li> 정기적으로 문화 16-40 시간 동안 배아 및 가스 유출 및 문화 챔버 온도를 확인합니다. 참고 : 마우스 배아의 조작을 문화 : 배아가 적어도 30 분 동안 배양 조건에 적응하자. 그런 저조한 수행 미약 하트 비트를 나타내는 배아는 폐기 될 수 있고, 나머지는 상기 배아 조작 연구에 이용 될 수있다. 이러한 일렉트로의 5,9,16, microinjections 18, 구슬 주입 16, 약물 치료 및 기타 절차 등의 배아 조작은이 시간에 수행 할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 초기 눈 개발에 자신의 역할을 연구하는 특정 신호 전달 분자로 취급 아피 - 겔 아가로 오스 비즈의 주입을 수행 하였다. 배아 후조작은 새로운 매체에 다시 반환과 문화에 계속 될 수있다. </li><li> 9 ~ 10 시간과 문화의 18 ~ 19 시간 배양 40 시간 동안 계속 된 후 특정 간격으로 완전히 새로운 미디어와 문화 매체를 교체합니다. 참고 : 문화가 16 ~ 18 시간에 의해 정지되는 경우 문화 미디어 교체가 필요하지 않을 수 있습니다. </li><li> 문화의 성공의 측정 : 문화의 배아 성장이 신체 크기의 증가, 체절 번호와 머리, 사지, 심장, 눈의 형태 개발에 의해 평가되어야한다 동안 문화 배아의 생존이 몸에 볼 심장 박동과 혈액 순환에 의해 결정되어야한다. </li><li> E11.0 DPC (~ 40-41들)과 E12.0 DPC (~ 49 ~ 50 초)에서 자궁 개발 배아에서 각각 16 ~ 18 시간과 38 ~ 40 시간, 배양 한 배아를 비교하기위한 대조군으로 사용되어야한다. </li><li> 문화 동안과 자궁의 단계에 대해 서로 다른 시점에서 배아 발달은 존을 할 수 있습니다해부 현미경 하에서이라는 군. 스팟 이미징 소프트웨어는 이미지를 캡처하기 위해 이용 이상 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 처리 하였다. </li></ol>

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우리는 어떤 경쟁하는 금융 이익이 없습니다.

중간 임신 단계 마우스 배아는 37 ° C에서 95 % O 2 / 5 더 롤링 병 배양 장치에서 %의 CO 2의 분위기에 혈청이없는 배지에서 배양 하였다 배아 개발 EX의 자궁은 자궁이 문화의 완성 (그림 1)에 안락사 생쥐에서 분리되는 순간부터 절차를 수행하는 동안 각 단계에서 여러 요인에 결정적으로 의존했다. 발전을 좌우하는 가장 중요한 요소는 배양을 시작하는 데 ...

체외에서 전체 배아를 이용한 배양 방법은 자궁에 접근하기 어려운 배아의 기관 형성에 관여 메커니즘을 신호 공부하기에 적합합니다. 전체 배아 조직의 무결성을 제공하고 필수적인 메커니즘을 신호의 적시 발생에 매우 중요한 조직의 상호 작용에 대한 적절한 지원 기관 형성 기간 동안 다른 세포 과정에 대한. 전체 배아 문화는 등 이식 연구, 유전자 및 조직 조작 구슬 주입 연구, 독성 연구, 같은 응용 프로그램의 과다를위한 플랫폼을 제공하는 반면., 현재 사용 배아 배양 시스템은 태아의 적절한 성장과 유지 보수를위한 혈청에 주로 의존 문화 1-9. 혈청 배양 배지 6 ~ 8, 10, 11의 10-100%에 이르기까지의 주요 구성 요소의 하나로서 활용되고 있습니다.하지만, 혈청의 조성물은 잘 정의되지 않은 동물 및 동물에 따라 다를 수 있고, 각 시간은 혈청을 수집한다. 혈청 실험 준비 시간을 소모하고 엄격한 절차를 포함하는 동안, 조달 혈청 상업적으로 다른 많은 사이에 상당한 변화를 전시 및 실험 비용을 발생시킵니다. 이러한 추가, 혈청은 잠재적으로 특정 실험의 결과에 영향을 미칠 수있는 성장 인자, 호르몬, 또는 다른 단백질, 조직의 상호 작용에 중요한 신호 분자의 연구를 포함하는 특히 알 수없는 요소를 포함 할 수있다. 연구는 문화 혈청의 첨가가 잠재적으로 순환 아데노신 monophosphate (캠프) 및 세포 분열 신호 및 phosphoinositide 3에 관련된 단백질 (PI 3) - 키나제 경로 12-14 신호와 같은 특정 신호 전달 분자의 세포 내 수준을 변경할 수있는 것으로 나타났습니다. 이들과는 반대로, 무 혈청 배양 시스템은 항원이없는 환경의 이점을 제공한다세포 프로세스를 변경할 수 생물학적 활성 효소 절제 실험 사이의 일관성을 가능하게합니다. 본 연구에서는 37에서 95 % O 롤링 병 배양 장치의 2 / 5 % CO 2의 분위기에서 문화 중반 태동 단계 전체 배아에 상업적으로 이용 가능한 줄기 세포 미디어 보충제 제조 된 무 혈청 배지를 이용 C 15, 16 °. 이러한 정의 된 조건에서 16-40 시간 동안 배양 한 쥐의 배아 세포의 증식, 이동, 분화 및 조직 상호 작용의 적절한 수준을 나타내는 등의 심장, 사지, 뇌, 눈 등 전체 배아 몸과 다른 구조의 형태 개발 진행을 보였다. 같은 눈과 같은 복잡한 장기 시스템 중 하나에 대한 문화의 배아 발달의 분자 분석은 EMBR에 안구 조직의 관찰과 일치하는 눈 개발을 발표YOS는 (준비, Kalaskar과 로더데일) 자궁에서 개발. 따라서 우리는 중앙 임신 단계에서 배양 한 쥐의 배아가 자궁에서 개발 태아에서 관찰 된 것과 유사한 진보적 인 성장과 형태 개발을 전시 것을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Stock: 100x</td></tr><tr><td>Albumin, from Bovine Serum</td><td>Sigma</td><td>A9418-50G</td><td>Stock: 100%</td></tr><tr><td>Antibiotic - Antimycotic Solution</td><td>Cellgro</td><td>30-004-Cl</td><td>Stock: Penicillin (10,000 IU/ml); Streptomycin (10,000 &amp;micro;g/ml; Amphotericin (250 &amp;micro;g/ml)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Precision Incubator Unit</td><td>B.T.C. Engineering Milton Cambridge England</td><td>Id.No. 840-374</td><td></td></tr><tr><td>Glass Bottles for Rotating Unit</td><td>B.T.C. Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicone Rubber Cork</td><td>B.T.C. Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Cylinder</td><td>AirGas Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi SV6 Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Water Jacketed Incubator</td><td>Forma Scientific</td><td>Model: 3110</td><td></td></tr><tr><td>Culture Hood</td><td>Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2</td><td>Model: Nu-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>IsoTemp205</td><td></td></tr><tr><td>Weigh Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>AG285</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Tube, 50 ml</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>Light Operating Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>Operating Sharp-Blunt Scissors&amp;nbsp;</td><td>Roboz</td><td>RS-6812</td><td></td></tr><tr><td>Microdissecting Forceps, 4 in</td><td>Roboz</td><td>RS-5211</td><td></td></tr><tr><td>Microdissecting Forceps - Hudson (cWALD), 4-3/4 in</td><td>Roboz</td><td>RS-5237</td><td></td></tr><tr><td>Microdissecting Tweezers (5/45)</td><td>Roboz</td><td>RS-5005</td><td>Modified - Sharp ends were made blunt</td></tr><tr><td>Microdissecting Tweezers (5)</td><td>Roboz</td><td>RS-5060</td><td>Modified - Sharp ends were made blunt</td></tr><tr><td>Microdissecting Tweezers (55)</td><td>Roboz</td><td>RS-5063</td><td>Modified - Sharp ends were made blunt</td></tr><tr><td>Instrument Tray</td><td>Roboz</td><td>RT-1401S</td><td></td></tr><tr><td>Instrument Tray Lid</td><td>Roboz</td><td>RT-1401L</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish-100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>087571Z</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish-60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish-35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875711YZ</td><td></td></tr><tr><td>Filter System ( 0.22 &amp;micro;m Cellulose Acetate)-150 ml</td><td>Corning</td><td>431153</td><td></td></tr><tr><td>Filter System (0.22 &amp;micro;m Cellulose Acetate)-250 ml</td><td>Corning</td><td>430756</td><td></td></tr><tr><td>Filter System (0.22 &amp;micro;m Cellulose Acetate)-500 ml</td><td>Corning</td><td>430758</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-aid Pipettor</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>D57849</td><td></td></tr><tr><td>Serological Pipette-10 ml</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Serological Pipette-25 ml</td><td>Corning</td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipette - 7.7 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>202-20S</td><td></td></tr></tbody></table>

mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system

중간 회임 스테이지 마우스 배아 산소화 롤링 병 배양 시스템에서 시판 줄기 세포 미디어 보조제로부터 제조 무 혈청 배지를 이용하여 배양 하였다. E10.5에서 마우스 배아는 신중 그대로 난황과 자궁에서 분리하고, 난황과 태아의 혈관 연속성을 유지하면서 정확한 수술 기동을 포함하는 과정에서 배아는 부드럽게 난황에서 exteriorized했다. 그대로 난황 또는 제거 난황을 준비 배아에 비해,이 배아는 우수한 생존율과 유사한 조건에서 배양 개발 진행을 보였다. 우리는이 마우스 배아 때 16-40 시간 동안 37 ° C에서 95 % O 롤링 병 배양 장치의 2 / 5 % CO 2의 분위기에 정의 된 배지에서 배양, 비교 형태의 성장과 발전을 전시 것을 보여 배아는 자궁에 개발. 우리는 토륨 생각방법은 배아의 기관 형성에 중요한 신호의 상호 작용을 연구하기 위해 전체 배아 문화를 활용할 필요가 조사에 유용 할 것입니다.

마우스 배아의 개발은 전 자궁 자궁이 배아는 배양 시간에 몸에서 분리 될 때부터 여러 요인에 따라 달라집니다. 그림 1에 도시 된 바와 같이, 절차는 몸에서 임신하는 자궁의 분리 (그림 1A), 그대로 난황 (그림 1B)와 배아의 분리를 포함하여 일련의 단계를 포함, 난황에서 배아의 exteriorization ( 그림 1C), 37 ° C에서 95 % O 롤링 병 배양 장치의 <s...

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Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

배아 배양에 활용 혈청 특히 신호의 상호 작용을 포함하는 연구 실험의 결과에 영향을 미칠 수있는 알 수없는 구성 요소가 포함되어 있습니다. 여기서 우리는 혈청 산소 배양 시스템을 활용하고 16-40 시간 동안 배양 한 중간 회임 마우스 배아가 자궁에서 개발 태아에 비해 형태 개발을 전시 것을 보여줍니다.

무 혈청 전체 배아 배양 시스템에서 마우스 배아 개발

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

mouse-embryonic-development-serum-free-whole-embryo-culture

Research

JoVE Journal

Biology

25.8K 조회수.  University of Georgia.  배아 배양에 활용 혈청 특히 신호의 상호 작용을 포함하는 연구 실험의 결과에 영향을 미칠 수있는 알 수없는 구성 요소가 포함되어 있습니다. 여기서 우리는 혈청 산소 배양 시스템을 활용하고 16-40 시간 동안 배양 한 중간 회임 마우스 배아가 자궁에서 개발 태아에 비해 형태 개발을 전시 것을 보여줍니다. 

비디오: Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

혈청이없는 단층 문화 마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

연구

발생학

Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

Genetic mouse models are an important tool in the study of mammalian neural tube closure (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010). However, the study of mouse embryos in utero is limited by our inability to directly pharmacologically manipulate the embryos in isolation from the effects of maternal metabolism on the reagent of interest. Whether using a small molecule, recombinant protein, or siRNA, delivery of these substances to the mother, through the diet or by injection will subject these unstable compounds to a variety of bodily defenses that could prevent them from reaching the embryo. Investigations in cultures of whole embryos can be used to separate maternal from intrinsic fetal effects on development.
Here, we present a method for culturing mouse embryos using highly enriched media in a roller incubator apparatus that allows for normal neural tube closure after dissection (Crockett, 1990). Once in culture, embryos can be manipulated using conventional in vitro techniques that would not otherwise be possible if the embryos were still in utero. Embryo siblings can be collected at various time points to study different aspects of neurulation, occurring from E7-7.5 (neural plate formation, just prior to the initiation of neurulation) to E9.5-10 (at the conclusion of cranial fold and caudal neuropore closure, Kaufman, 1992). In this protocol, we demonstrate our method for dissecting embryos at timepoints that are optimal for the study of cranial neurulation. Embryos will be dissected at E8.5 (approx. 10-12 somities), after the initiation of neural tube closure but prior to embryo turning and cranial neural fold closure, and maintained in culture till E10 (26-28 somities), when cranial neurulation should be complete.

A method allowing for direct pharmacological manipulation of mouse embryos during neurulation that bypasses maternal metabolism is described. The technique can be adapted to study different aspects of neurulation by varying the time point and pharmacological agent.

마우스 배아 전체 문화 신경 튜브 폐쇄

Genetic mouse models are an important tool in the study of mammalian neural tube closure (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010).  However, the study of mouse ...

신경과학

Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.

This protocol provides a method for the collection of mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) derived from serum (fetal bovine serum, FBS)- and feeder (mouse embryonic fibroblasts, MEFs)-free conditions for a cell-free approach. It may be applicable for the treatment of aging and aging-associated diseases.

무 혈청의 수집 및 공급 장치없이 마우스 배아는 세포 자유로운 접근을위한 세포 조절 중간 줄기

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

조기 칙 태아 예 생체내 (새로운 문화)의 문화에 대한 방법

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

생물학

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

조류 배아 배아 Cardiomyocytes의 생체 내 주입에 대 한 microinjection 기반 시스템

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

전 비켜</em이미징 및 미세 애플 리케이션에 적합> 치킨의 배아 문화 시스템

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. Platforms have been recently developed for highly robust and prolonged ex utero culture of mouse embryos from egg-cylinder stages until advanced organogenesis. These platforms enable appropriate and faithful development of pregastrulating embryos (E5.5) until the hind limb formation stage (E11). Late gastrulating embryos (E7.5) are grown in rotating bottles in these settings, while extended culture from pregastrulation stages (E5.5 or E6.5) requires a combination of static and rotating bottle cultures. In addition, sensitive regulation of O2 and CO2 concentration, gas pressure, glucose levels, and the use of a specific ex utero culture medium are critical for proper embryo development. Here, a detailed step-by-step protocol for extended ex utero mouse embryo culture is provided. The ability to grow normal mouse embryos ex utero from gastrulation to organogenesis represents a valuable tool for characterizing the effect of different experimental perturbations during embryonic development.

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

An enhanced platform for whole-embryo culture allows continuous and robust ex utero development of postimplantation mouse embryos for up to six days, from pregastrulation stages until advanced organogenesis. In this protocol, we detail the standard procedure for successful embryo culture using static plates and rotating bottle systems.

엑스 우테로 사전 배후에서 고급 유기발생에 이르는 마우스 배아의 배양

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. ...

Live Imaging of Early Cardiac Progenitors in the Mouse Embryo

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail specific developmental stages in a still snapshot, live imaging captures dynamic morphogenetic events, such as cell migration, shape changes, and differentiation, by imaging the embryo as it develops. This complements fixed analysis and expands the understanding of how organs develop during embryogenesis. Despite its advantages, live imaging is rarely used in mouse models because of its technical challenges. Early mouse embryos are sensitive when cultured ex vivo and require efficient handling. To facilitate a broader use of live imaging in mouse developmental research, this paper presents a detailed protocol for two-photon live microscopy that allows long-term acquisition in mouse embryos. In addition to the protocol, tips are provided on embryo handling and culture optimization. This will help understand key events in early mouse organogenesis, enhancing the understanding of cardiovascular progenitor biology.

We present a detailed protocol for mouse embryo culture and imaging that enables 3D + time imaging of cardiac progenitor cells. This video-toolkit addresses the key skills required for successful live imaging otherwise hard to acquire from text-only publications.

생쥐 배아에서 초기 심장 전구체의 생생한 영상

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

포유류의 전체 배아 문화에 적합 쥐 혈청의 제조

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Evaluating Embryo Adhesion in an In Vitro Co-Culture Model with Ishikawa Cells(이시카와 세포를 이용한 체외 공동 배양 모델에서의 배아 접착 평가)

Establishment of an Embryo Implantation Model In Vitro

Embryo implantation is the first step in the establishment of a successful pregnancy. An in vitro model for embryo implantation is critical for basic biological research, drug development, and screening. This paper presents a simple, rapid, and highly efficient in vitro model for embryo implantation. In this protocol, we first introduce mouse blastocyst acquisition and human endometrial adenocarcinoma cells (Ishikawa)&#160;preparation for implantation, followed by the co-culture method for mouse embryos and Ishikawa cells. Finally, we conducted a study to assess the impact of varying concentrations of 17-&#946;-estradiol (E2) and progesterone (P4) on embryo adhesion rates based on this model. Our findings revealed that high concentrations of E2 significantly reduced embryo adhesion, whereas the addition of progesterone could restore the adhesion rate. This model offers a simple and fast platform for evaluating and screening molecules involved in the adhesion process, such as cytokines, drugs, and transcription factors controlling implantation and endometrial receptivity.

저자 스포트라이트: 배아-자궁내막 상호작용 분석을 통한 임신율 향상을 위한 치료 전략 발전

This protocol describes methodologies to establish simple and efficient embryo implantation in vitro model for evaluating the relevant molecules affecting the embryo implantation process.

In vitro 배아 이식 모델 확립

Embryo implantation is the first step in the establishment of a successful pregnancy. An in vitro model for embryo implantation is critical for basic ...