연구 Spagnoli 실험실. Helmholtz 협회, FP7-IRG-2008-ENDOPANC 교부금 및 ERC-2009-시작 HEPATOPANCREATIC 교부금으로 운용되고 있습니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 원래 퍼시벌과 슬랙 9 설명 및 공 촛점 현미경에 최적화 된 기술로 조정되었습니다. 1. 유리 바닥 문화 요리의 코팅 다음 단계는 층류 후드에 무균 조건 하에서 수행되어야한다. <ol><li> 췌장 explants는 20 mm 직경 유리 microwell 하단에 (예 : MatTek 공사)와 35 mm 배양 접시에 배양되어 있습니다. explant 문화 당과 문화의 전체 기간에 대해 하나의 유리 바닥 요리를 사용합니다. 췌장 꽃 봉오리, 코트 fibronectin과 유리 바닥 microwells의 해부 및 절연 전날 있습니다. </li><li> 50 μg / ML 최종 농도로 세포 문화 수준의 물에 살균 fibronectin을 희석하여 전체 유리 표면 (그림 1E)를 덮고있는 MatTek 플레이트의 20 mm microwell에 최소 볼륨을 (~ 150 μl)를 추가합니다. 요리를 놓으십시오밤새 잠복을위한 4 ° C 냉장고 인치 </li><li> 해부의 날, fibronectin을 기음 세포 문화 수준의 물 microwell을 씻어 BME 150 μl (자연적으로 흐르는 것과 중 이글) 펜 / 패 혈성 (1 %), 글루타민 (1 %로 보충 매체의 최소 볼륨을 추가 ) 50 μg / ML Gentamicin [분해 매체]. 판 explants을 준비 할 때까지 층류 후드에 코팅 요리를 둡니다. </li></ol> 모든 fibronectin 코팅 요리를 사용하는 경우는 4 ° C.에서 1 주일에 저장 될 수 요리, 건조 분해 매체로를 입력하고 냉장고에 넣어 두지 마십시오. fibronectin뿐만 아니라, 췌장 explants이 성공적으로 이러한 laminin 9 matrigel 10,11 또는 미세 멤브레인 12 다양한 기판에 배양되었습니다. 때문에 분기에 미치는 영향, 우리는 기판으로 fibronectin 9를 사용합니다. 2. D의 해부E11.5에서 orsal 췌장 버드 - E12.5 마우스 태아 <ol><li> 배아 일 (E) 11.5 또는 12.5에서 시간 제한이 초과 임신 여성 쥐들이 희생되고 배아는 이전에 70 %의 에탄올과 청소 해부 악기를 사용하여 수집하고 있습니다. 50 μg / ML의 gentamicin과 보충 얼음처럼 차가운 PBS를 포함하는 10 cm 플레이트에서 해부 자궁를 놓습니다. </li><li> 부드럽게 decidua에 둘러싸여 거리에 자궁 근육과 각각의 배아를 제거 껍질을 벗기면 작은 가위 또는 뒤몽의 집게를 사용하여 개별 배아 세그먼트에 위, 별도의 자궁에서 조명과 stereomicroscope 아래. 배아를 노출하고 난황 주머니와 양막을 제거하는 13 표준 배아 분해 기술을 사용합니다. 그 후, 배의 상부 기관 (간 위)과 꼬리 영역을 제거합니다. 이 내부 장기 (그림 1B)의 노출을 할 수 있습니다. 얼음처럼 차가운 BME의 해부 매체를 포함하는 10 cm 플레이트에 태아의 중간 몸을 전송합니다. </li><li> 지금시각화하고 stereomicroscope 아래 등쪽 췌장 꽃 봉오리를 해부 아래에서 단 transillumination을 사용합니다. 부드럽게, 집게와 측면 절개를하여 배의 중간 몸을 엽니 다. 위와 비장을 찾습니다. 등쪽 췌장 봉오리 위의 뒤쪽 지역 (그림 1C)에 옆으로 부착된다. 뒤몽의 집게를 사용하여, 이러한 위장과 비장 등의 인접 구조에서 등쪽 췌장 꽃 봉오리을 멀리 해부하지만, (그림 1D) 상피 주위에 몇 가지 mesenchyme 둡니다. 유리 파스퇴르 피펫 사용하여, 10 % 태아 송아지 혈청 [문화 매체]로 보충 차가운 BME의 해부 매체를 포함하는 35 mm 페트리 접시에 격리 된 맥주를 전송할 수 있습니다. 모든 pancreata이 분리 될 때까지이 단계를 반복합니다. 다른 genotypes의 pancreata 고립 된 경우,이를 Nunc 4 잘 접시를 사용하여 별도의 유지. </li></ol> 3. 췌장 Explants의 도금과 문화 최종 오십시오explants의 ING는 문화의 신체적 인 움직임을 최소화하기 위해 조직 문화 공간 및 / 또는 조직 문화 인큐베이터에서 가까운 거리에 수행됩니다. <ol><li> 층류 흐름 후드의 무균 조건 하에서 BME 문화 매체의 150 μl와 fibronectin - 코팅 MatTek 요리 37 미리 예열 ° C.에 BME 분해 매체를 대체 </li><li> 조심스럽게, 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 장기 문화의 코팅 MatTek 요리 (요리 당 하나의 explant)로 췌장 explants를 전송할 수 있습니다. 문화 중에 확산되도록하려면 explants을 둘러싼 mesenchyme가 약간 좋은 바늘로 필요한 경우, 찢어진 할 수 있습니다. </li><li> 부드럽게, 조직 문화 인큐베이터에있는 문화 장소 (37 ° C, 5퍼센트 CO 2) explants가 유리 하단 microwells에 부착하게하는 몇 시간 동안. 일단은 미리 데워 37 BME 문화 매체의 1.5 ML 2 ML로 MatTek 요리를 기입 °, 부착 C. 해부의 날은 일 공라고도합니다. </li><li> 사람췌장 explant 문화의 ipulation은 층류 후드에 무균 조건 하에서 수행됩니다. 실험 조건이 다른 타이밍을 (화학 약품과 explants의 예 부화) 지시하지 않는 한 BME 문화 매체는 매일 변경됩니다. explants 한 일주일 5 일 동안이 조건에서 배양 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 췌장 Explants에 대한 전체 마운트 Immunofluorescence 얼룩 프로토콜 immunofluorescence 프로토콜의 모든 단계 (고정에서 영상까지) 플라스틱 바닥 요리보다 이미지를 얻을 동일한 MatTek 요리에서 수행됩니다. 고정 후, 췌장 explant 문화는 무균 조건 하에서 보관 할 필요가 없습니다. <ol><li> BME 문화 매체를 대기음 2 ML 1X PBS로 한 번 explant을 씻는다. </li><li> explant 고정 2 ML 얼음처럼 차가운 4 % paraformaldehyde (PFA)와 PBS를 교체하고 20 분에 얼음 접시를 놓습니다. 로 시간의 판 부드럽게 소용돌이시간,하지만 explant가 분리 하듯이, 흔들 플랫폼을하지 마십시오. </li><li> PFA를 제거하고 실내 온도 (RT)에서 10 분 각각에 대한 1X PBS 2 ML과 explant 세 번 씻는다. </li><li> 2 ML 차단 솔루션 블록 (1X PBS + 0.1 % 트리톤 - X + 3 % 돈키 세럼) RT 적어도 30 분에. </li><li> 솔루션을 차단에 차 항체를 희석와 4에서 하룻밤 배양을위한 전체 explant 표면 ° C.를 덮고있는 MatTek 플레이트의 20 mm microwell에 직접 희석의 150 μl를 추가합니다 물리적 움직임을 최소화 직접 추운 방 (4 ° C)의 explants에 차 항체를 추가 할 수 있습니다. 증발을 방지하기 위해 항체를 추가하기 전에, 습기 챔버에 MatTek 판을 놓습니다. </li><li> 그 다음 날은 항체 솔루션을 제거 2 ML 1X PBS로 세 번 씻어 + 0.1 % 십대 초반-20 RT 30 분 각각에 대해 (PBT). </li><li> 솔루션을 차단에 차 항체를 희석 [제조업체의 권장 사항에 따라, 우리는 당나귀 알렉사 형석 염료에게 보조 백신을 사용1:750 희석]와 어둠 속에서 RT에서 1-2 시간의 배양을 위해 전체 explant 표면을 덮고있는 MatTek 플레이트의 20 mm microwell로 직접 희석의 150 μl를 추가로 기관. 핵 counterstaining를 들어, 차 항체 희석과 함께 Hoechst가 포함되어 있습니다. 증발을 방지하기 위해 항체를 추가하기 전에, 습기 챔버에 MatTek 판을 놓습니다. </li><li> 2 ML 1X PBS로 세 번 씻어 + 0.1 % 30 분 RT에서 각 십대 초반 - 2​​0 (PBT). </li><li> 설치하기 전에, 십대 초반-20을 제거 1X PBS로 한 번 씻는다. MatTek 플레이트의 20 mm microwell에 수성 장착 매체 중 하나 드롭 (안티 - 변색이있는)를 추가하여 장착합니다. 부드럽게, 유리 coverslip으로 explant을 다룹니다. 공기 거품을 피하십시오. </li><li> MatTek 판에 Explants는 실험의 목적에 따라 표준 위상 대비 현미경 또는 공 촛점 현미경 아래에서 볼 수 있습니다. 공 촛점 현미경 분석에 우리는 Zeiss의 LSM 700 역 설정을 사용합니다. 우리 fluorophores에 적합한 레이저를 설정거구나. 목표를 선택하는 것 이미지 췌장 explant의 원하는 영역을. 10X 물 침지 목표는보기의 분야에서 전체 explant를 유지하는 데 적합합니다. 40X 물 또는 기름 침지 목표는 더 큰 해상도를 가진 췌장 explant의 특정 지역에 초점을하기 적합합니다. explants 광학 sectioned 후 취득 Z-스택이 적절한 소프트웨어를 사용하여 3D로 복원 할 수 있습니다. </li></ol> 5. 췌장 Explants의 라이브 셀 이미징 프로토콜 <ol><li> 환경 챔버 설정 : 환경 인클로저와 작은 배양 챔버를 사용하는 현미경 무대에 앉아 [온도와 CO 2 제어]. 배아 췌장의 적절한 배양은 37 ° C와 humidified 5 % CO 2의 제어 분위기의 안정적인 온도를 필요로합니다. 적합 방은 여러 공급 업체에서 제공하는 (예를 들어, Zeiss, 니콘, 올림푸스). 히터 상자를 조립하고 전원을 켭니다이미징 전에 t 이상 1 시간은 장비가 몸을 따뜻하게하고 5 % CO 2 컨텐츠를 평형 할 수 있도록 시작합니다. </li><li> 췌장 explant 문화의 시간 경과 영상의 경우, 우리는 Zeiss의 LSM 700 역 현미경을 사용합니다. 레이저 및 목표 선택에 대한 포인트 4.10을 참조하십시오. </li><li> 췌장 explant의 라이브 영상을 시작하기 전에 잘 유리 바닥 요리에 연결 봅시다. [우리는 일반적으로 라이브 영상은 1 일부터 수행]. 층류 흐름 후드에서 대기음 및 최적의 영양 조건을 시작하는 신선한 BME 문화 매체로 explant 매체를 교체하십시오. </li><li> 부드럽게 현미경 방으로 explants를 전송하고 공 촛점 현미경의 표본 홀더에 배양 챔버에 MatTek 요리를 놓습니다. </li><li> 목표를 준비 (예 : 집중 목적의 선택에 따라 기름이나 물 매체를 추가)과 explant에 대한 관심의 지역에 초점을 맞 춥니 다. 환경 챔버를 제대로 닫습니다. 시간이 경과하는 동안 증발을 방지하려면물 대신에 물 침지 목표로 인수는, 그것은 (예 : Zeiss Immersol W) 상업적으로 사용할 수 있습니다 점성 집중 유체를 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 레이저 강도, Z-스택 인수 매개 변수와 시간 간격을 (문제 해결에도 토론 참조) 설정합니다. 실험을 시작합니다. </li><li> 이미징, 수출 Z 스택 및 모든 시간 지점 이후 해당 소프트웨어를 (예 : ImageJ, Volocity, Imaris, 호이겐스)를 사용하여이를 분석 할 수 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 등쪽 췌장 꽃 봉오리는 (함께 주변 mesenchyme 포함) E11.5 및 E12.5 직접 유리 바닥 문화 요리 (그림 1)에 도금 사이의 마우스 배아 분석하던되었습니다. 혈관은 상피를 둘러싼 mesenchyme에 존재하며 내피 마커 Pecam 12 (데이터가 표시되지 않음)에 대해 immunostaining으로 시각화 할 수 있습니다. 문화, 췌장 explants 숙녀의 두 일 후에상당한 성장을 erwent과 그의 핵 췌장 전사 인자에 양성 반응했다 분지 상피 구조, Pdx1 (그림 2A-C)로 자신을 구성하기 시작했다. 문화의 일 3 췌장 explants의 평균 Z-두께는 60-80 μm이다. explants의 표면과 볼륨이 적절한 소프트웨어 (예 : 호이겐스)를 사용하여 측정 할 수 있습니다. 형태론과 immunofluorescence 분석은 췌장 explants는 생체 초기 췌장 차별화 및 morphogenetic 이벤트 5,10,11,14 (그림 2)에 recapitulated이 프로토콜을 사용하여 배양 것으로 나타났다. 문화의 일 4 췌장 explants은 전형적인 &#39;팁과 트렁크 &quot;cpa1를 표시 상피 8 분리, + 트렁크 내부 클러스터로 구성된 상피 가지 (그림 2C)와 차별화 된 인슐린 +과 글루카곤 + 세포의 끝 전구 세포 (그림 2D를 받았습니다 ). 또한, pancreati예 생체 문화의 C 상피는 기저 멤브레인 (빨간색 그림 2E)의 꼭대기 F-고를의 국산화 (그림 2E, 녹색) 및 B1-인테그린과 적절한 세포 골격의 조직과 세포 극성을 보여 주었다. (; 마우스 스트레인 잭슨 연구소의 이용이 가능합니다 MT / MG) (그림 3) 실시간으로 분기 췌장 공부를하기 위해 태아의 췌장 explants는 이중 색 형광 기자 마우스 변형 membrane-Tomato/membrane-Green 15 일부터 고립되었다. 아직도 문화에 성장 MT / MG 췌장 explants의 시간 경과 영화의 프레임은 그림 3에 표시됩니다. 막 구조에 산 형광 단백질의 지방화는 세포 형태를 설명하고 시간이 지남에 따라 세포 리모델링 및 마이그레이션을 추적 할 수 있도록, 고급 세포 프로세스의 해상도를 할 수 있습니다. 12 시간 시간 경과 실험 후 산 형광 신호는 가능한 및 dete 남아ctable, 그 강도가 가장 가능성이 photodamage로 인해 (그림 3), 감소에도 마찬가지입니다. photodamage 및 광독성을 피하거나 줄일 수있는 기술 솔루션은 토론 섹션에 설명되어 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig1.jpg" /> 그림 1. E12.5 마우스의 배아에서 등쪽 췌장의 꽃 봉오리의 해부의 개략도. E12.5 마우스 배아의 (A) Brightfield 이미지입니다. 배 (간 위)과 꼬리 지역의 상반신은 중간 바디 (B)를 분리 제거됩니다. 절개은 빨간색 점선으로 표시됩니다. 위와 십이지장 지역의 노출 (점선 상자로 표시)에서 (C) 또한 분해 결과입니다. 등쪽 췌장 버드 (빨간색 점선 원을 참조) 위와 비장의 primordium 옆에의 기지에 위치해 있습니다. 해부 등쪽의 췌장 꽃 봉오리 (D)는 BME 배양액을 포함하는 유리 바닥 요리의 microwell (E에 파스퇴르 피펫으로 전송됩니다, F). 약어 : 스토 (위), SP (비장), DP (등쪽 췌장 꽃 봉오리), 듀오 (십이지장). 스케일 바, 1000 μm (A, C). <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig2.jpg" /> 그림 2. 췌장 explant 문화의 전체 마운트 공 촛점 immunofluorescence 분석. 일 1 예 생체 문화의 일 2 췌장 explants의 (A) Brightfield 이미지. 레드 점선은 상피의 분기의 개시를 나타냅니다. 전체 마운트의 (B) 3D 재건은 3 일 췌장 문화 Pdx1에 immunostaining. 췌장 explants는 문화의 48 시간으로 다양한 분기를 겪고 Pdx1 + 세포의 tubules을 보여 주었다. basolateral 막 마커 E-cadherin (Ecad), 팁 전구 마커, Carboxypeptidase 1 (Cpa1)와 phospho-히스톤 H3 (pHH3)에 대한 항체가있는 3 일 췌장 explant의 (C) 전체 마운트 immunostaining. 활성 mitotic pHH3 + 세포의 대부분은 Cpa1 + 세포와 주변 팁에 colocalize. 점선 리터아이 네스는 가지의 팁을 나타냅니다. 내분비 계보 (Lineage) 마커, 인슐린 (기능) 및 일 3 글루카곤 (Gluca)을 (D) 전체 마운트 immunostaining. 노란색 화살표는 기능의 클러스터 +와 Gluca + 셀을 나타냅니다. 삽입 (D &#39;), 내분비 세포 클러스터의 하나의 높은 배율. Pdx1, β1 인테그린 (β1int)와 F-고를 (사실)에 대한 3 일 췌장 explant의 (E) 전체 마운트 immunostaining. Pdx1 양성 상피 세포들 사이 사이 중간 엽 세포 (별표). C, D 및 E에 표시되는 이미지는 Z-시리즈 단일 공 촛점 광학 섹션입니다. 스케일 바, 100 μm (A, B), 50 μm (CE). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig3.jpg" /> 그림 3. 예를 생체 교양 췌장 explant 대표 라이브 셀 이미징. MT / MG 마우스 유전자 변형의 배아에서 췌장 explant의 시간 경과 영화에서 (AD) 프레임. 분 영상의 시간은 시간에 표시됩니다. explant는 1 일부터 시작 이미징되었다. Z-스택 이미지40X 기름 침지 목표 15 시간의 총 매 12 분을 인수했다. 점선은 상피와 mesenchyme 사이의 지점과 국경의 팁을 나타냅니다. 규모 바, 50 μm.

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	<li>Slack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+biology+of+the+pancreas.">Developmental biology of the pancreas.</a> Development. 121, 1569-1580 (1995).</li><li>Pan, F., Wright, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreas+organogenesis:+from+bud+to+plexus+to+gland.">Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland.</a> Dev. Dyn. 240, 530-565 (2011).</li><li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Plasticity+within+the+Pancreas-+Lessons+Learned+from+Development.">Cellular Plasticity within the Pancreas- Lessons Learned from Development.</a> Developmental Cell. 18, 342-356 (2010).</li><li>Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+endoderm+to+pancreas:+a+multistep+journey.">From endoderm to pancreas: a multistep journey.</a> Cell. Mol. Life Sci. 64, 2378-2390 (2007).</li><li>Hick, A. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+primitive+duct+formation+in+the+pancreas+and+submandibular+glands:+a+role+for+SDF-1.">Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1.</a> BMC Dev. Biol. 9, 1-17 (2009).</li><li>Villasenor, A., Chong, D., Henkemeyer, M., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+dynamics+of+pancreatic+branching+morphogenesis.">Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis.</a> Development. 137, 4295-4305 (2010).</li><li>Kesavan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42-Mediated+Tubulogenesis+Controls+Cell+Specification.">Cdc42-Mediated Tubulogenesis Controls Cell Specification.</a> Cell. 139, 791-801 (2009).</li><li>Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multipotent+Progenitor+Domain+Guides+Pancreatic+Organogenesis.">A Multipotent Progenitor Domain Guides Pancreatic Organogenesis.</a> Developmental Cell. 13, 103-114 (2007).</li><li>Percival, A., Slack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pancreatic+development+using+a+cell+lineage+label.">Analysis of pancreatic development using a cell lineage label.</a> Exp. Cell Res. 247, 123-132 (1999).</li><li>Miralles, F., Czernichow, P., Ozaki, K., Itoh, N., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+fibroblast+growth+factor+receptor+2b+plays+a+key+role+in+the+development+of+the+exocrine+pancreas.">Signaling through fibroblast growth factor receptor 2b plays a key role in the development of the exocrine pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6267-6272 (1999).</li><li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+embryonic+pancreas+development+using+real-time+imaging.">Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging.</a> Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).</li><li>Magenheim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+restrain+pancreas+branching,+differentiation+and+growth.">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, 4743-4752 (2011).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2003).</li><li>Horb, L. D., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cell+division+in+branching+morphogenesis+and+differentiation+of+the+embryonic+pancreas.">Role of cell division in branching morphogenesis and differentiation of the embryonic pancreas.</a> Int. J. Dev. Biol. 44, 791-796 (2000).</li><li>Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

췌장의 운명이 지정되면, 췌장 전구 세포는 결국 성숙하고 기능 오르간 2,4를 형성하기 위해 광범위한 확산, 차별화 및 morphogenesis을 받고있다. 현재 분기하는 방법은 췌장에서 일어난 방법은 전구 증식과 분화에 연결되어 대부분 알 수 있습니다. 췌장 explant 문화는 이러한 프로세스에게 예 생체 5,9,11을 명료하게하다 할 수있는 이상적인 시스템을 나타냅니다. 초기 췌장 꽃 ?...

<table border="1"><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 항체 : Carboxypeptidase E-cadherin F-고를 글루카곤 인슐린 β1-인테그린 Pdx1 Pdx1 Phospho-히스톤 H3 </td><td> 아브드 Serotec Invitrogen 분자 프로브 ImmunoStar Millipore Millipore Abcam 하이 브리 도마 은행 셀 Signalling </td><td> 1810-0006 13-1900 A-12373 20,076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 </td><td></td></tr><tr><td> 기저 매체 독수리 (BME) </td><td> 시그마 </td><td> B1522-500ML </td><td> 멸균 조건에 보관 </td></tr><tr><td> 세포 배양 등급 물 </td><td> PAA </td><td> S15-012 </tD&gt; <td> 멸균 조건에 보관 </td></tr><tr><td> 문화 요리 (유리 바닥), 35-mm </td><td> MatTek 공사 </td><td> P35G-0-20-C </td><td></td></tr><tr><td> 당나귀 세럼 </td><td> Chemicon </td><td> S30-100 ML </td><td></td></tr><tr><td> 태아 송아지 혈청 골드 </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td><td> 멸균 조건에 보관 </td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> Invitrogen </td><td> 330100-8 </td><td> 주식 솔. 세포 배양 등급 물 1 MG / ML </td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> Invitrogen </td><td> 15750-037 </td><td> 멸균 조건에 보관 </td></tr><tr><td> 글루타민 </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-024 </td><td> 멸균 조건에 보관 </td></tr><tr><td> 4 잘 Multidishes </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 : 역 공 촛점 현미경 (LSM 700) Stereomicroscope (디스커버리 V12) </td><td> Zeiss Zeiss </td><td></td><td> 목표 : C-고차 색지움 0.45 / 10X W M27 (work. 지구 1.8 mm,. 이미징 깊이 ~ 100 ㎜), C-고차 색지움 1.2 W Corr M27 (work. 지구 0.28 mm., ~ 영상 깊이 50 μm) / 40X 위에서 아래에서 광섬유 조명의 Transillumination </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 로스 </td><td> 0335.3 </td><td> 증권 솔루션 20% </td></tr><tr><td> 파스퇴르 Pipet (유리), 150mm </td><td> VWR </td><td> HECH567 / 1 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td><td> 멸균 C에 보관onditions </td></tr><tr><td> 배양 접시, 60mm </td><td> Greiner 바이오 하나 </td><td> 628102 </td><td></td></tr><tr><td> 배양 접시, 35mm </td><td> Greiner 바이오 하나 </td><td> 627161 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS, pH7.4 </td><td> PAA </td><td> H15-002 </td><td> 멸균 조건에 보관 </td></tr><tr><td> 봄 가위 8mm 블레이드가 휘어 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 15023-10 </td><td></td></tr><tr><td> 트리톤 - X100 </td><td> 로스 </td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> 시계 제조 인의 foreceps 뒤몽 # 5 </td><td> 로스 </td><td> K342.1 </td><td></td></tr></table>

a system for ex vivo culturing of embryonic pancreas

췌장은 소화 효소와 혈당 수치 1 규제의 생산을 포함한 우리 몸의 중요한 기능을 제어합니다. 지난 십 년간 많은 연구가 췌장 organogenesis을 이해하기위한 견고한 기초에 공헌했지만, 중요한 틈 초기 췌장 형성이 우리의 지식에 유지됩니다. 이러한 초기 이벤트의 전체 이해는이 기관의 개발에 대한 통찰력을 제공하지만, 또한 당뇨병이나 췌장암으로 췌장를 타겟팅하는 불치의 질병으로합니다. 마지막으로,이 정보는 당뇨병의 맥락에서 세포 교체 요법을 개발하기위한 청사진을 생성합니다. embryogenesis 동안, 췌장 배아 일의 등쪽과 복부 foregut의 endoderm 마우스 배아 3,4에서 (E) 9.5의 고유 한 배아 outgrowths에서 유래 된 것입니다. 두 outgrowths은 단단한 상피 조직으로 주변 mesenchyme에 evaginate완전히 성숙 장기 2,5,6을 생성하기 위해 분기와 차별화, 확산을 받아야 난 꽃 봉오리. 최근 증거는 인슐린 생산 β-세포 등의 췌장 세포 lineages, 성장과 차별화는 분기 췌장 상피 7,8 내의 적절한 조직 아키텍처, 상피 리모델링 및 셀 위치에 따라 달라집니다 것을 제안했습니다. 그러나, morphogenesis을 가지 방법을하면 발생 췌장의 증식과 분화로 조정됩니다 것은 대부분 알 수 있습니다. 이 morphogenetic 이벤트는 매우 동적 한편 개발 프로세스에 대한 최신 지식, 고정 표본의 분석에 거의 대부분 의존 하였다는 사실로 인해 일부입니다. 여기, 우리는 해부 및 개발 췌장 (그림 1)를 직접 시각화를 허용 유리 바닥 요리에 배양 마우스 배아 췌장 꽃 봉오리의 예를 생체에 대한 방법을보고합니다. 이 컬트우레 시스템은 이상적으로 특히, 라이브 셀 이미징에 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경을 위해 고안하고 있습니다. 췌장 explants가 아니라 야생 타입 마우스 배아에서 준비뿐만 아니라, 유전 공학 마우스 변종 (예 : 유전자 변형 또는 녹아웃)에서 돌연변이 phenotypes의 실시간 연구를 허용 할 수 있습니다. 또한,이 전 생체 문화 시스템은 증식과 성장, 연신율, 브랜칭, tubulogenesis과 차별화에 대한 정량적 데이터를 얻을 수있게 췌장 개발에 화학 화합물의 효과를 연구 할 가치가있다. 결론적으로, 고해상도 영상과 함께 전직 생체의 췌장 explant 문화 방법의 개발은 그들이 개발 마우스의 배아에서 발생하는 morphogenetic과 차별화 이벤트를 관찰위한 강력한 플랫폼을 제공합니다.

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A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

여기, 우리는 마우스 배아 췌장의 고립, 문화, 조작하는 방법을 설명합니다. 이 훌륭한을 나타냅니다<em&gt; 예 생체</emmorphogenesis, 차별화 및 성장 등의 췌장 개발의 다양한 측면을 공부&gt; 시스템입니다. 췌장 꽃 봉오리의 explants는 며칠 동안 배양 및 전체 마운트 immunofluorescence, 라이브 영상 등의 다양한 응용 프로그램의 범위에서 사용할 수 있습니다.

위한 시스템<em&gt; 예 생체</em배아 췌장의&gt; 배양

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

13.6K 조회수.  Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine. 여기, 우리는 마우스 배아 췌장의 고립, 문화, 조작하는 방법을 설명합니다. 이 훌륭한을 나타냅니다 예 생체 시스템입니다. 췌장 꽃 봉오리의 explants는 며칠 동안 배양 및 전체 마운트 immunofluorescence, 라이브 영상 등의 다양한 응용 프로그램의 범위에서 사용할 수 있습니다.

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Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

조기 칙 태아 예 생체내 (새로운 문화)의 문화에 대한 방법

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

전 비켜</em이미징 및 미세 애플 리케이션에 적합> 치킨의 배아 문화 시스템

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

뉴트의 렌즈 재생을 공부 Culturing 이리스 안료 상피 세포에 대한 시스템

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not regenerate very efficiently in vivo; and as a result, osteoarthritis leads to irreversible cartilage loss and is accompanied by chronic pain and immobility 1,2. Cartilage tissue engineering offers promising potential to regenerate and restore tissue function. This technology typically involves seeding chondrocytes into natural or synthetic scaffolds and culturing the resulting 3D construct in a balanced medium over a period of time with a goal of engineering a biochemically and biomechanically mature tissue that can be transplanted into a defect site in vivo 3-6. Achieving an optimal condition for chondrocyte growth and matrix deposition is essential for the success of cartilage tissue engineering. 
 In the native joint cavity, cartilage at the articular surface of the bone is bathed in synovial fluid. This clear and viscous fluid provides nutrients to the avascular articular cartilage and contains growth factors, cytokines and enzymes that are important for chondrocyte metabolism 7,8. Furthermore, synovial fluid facilitates low-friction movement between cartilaginous surfaces mainly through secreting two key components, hyaluronan and lubricin 9 10. In contrast, tissue engineered cartilage is most often cultured in artificial media. While these media are likely able to provide more defined conditions for studying chondrocyte metabolism, synovial fluid most accurately reflects the natural environment of which articular chondrocytes reside in.
 Indeed, synovial fluid has the advantage of being easy to obtain and store, and can often be regularly replenished by the body. Several groups have supplemented the culture medium with synovial fluid in growing human, bovine, rabbit and dog chondrocytes, but mostly used only low levels of synovial fluid (below 20&#37;) 11-25. While chicken, horse and human chondrocytes have been cultured in the medium with higher percentage of synovial fluid, these culture systems were two-dimensional 26-28. Here we present our method of culturing human articular chondrocytes in a 3D system with a high percentage of synovial fluid (up to 100&#37;) over a period of 21 days. In doing so, we overcame a major hurdle presented by the high viscosity of the synovial fluid. This system provides the possibility of studying human chondrocytes in synovial fluid in a 3D setting, which can be further combined with two other important factors (oxygen tension and mechanical loading) 29,30 that constitute the natural environment for cartilage to mimic the natural milieu for cartilage growth. Furthermore, This system may also be used for assaying synovial fluid activity on chondrocytes and provide a platform for developing cartilage regeneration technologies and therapeutic options for arthritis.

A 3D system of culturing human articular chondrocytes in high levels of synovial fluid is described. Synovial fluid reflects the most natural microenvironment for articular cartilage, and can be easily obtained and stored. This system thus can be used for studying cartilage regeneration and for screening therapeutics for treating arthritis.

활액 유체에 Culturing 인간 관절 Chondrocytes을위한 3D 시스템

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Culturing 인간의 배아와 유도 Pluripotent 줄기 세포에 적합 마우스 배아 Fibroblast 세포의 준비

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

소설<em&gt; 생체</em배아 마우스 사랑을&gt; 문화 방법

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

배아 배양하는 방법<em&gt; C. 엘레</em&gt; 셀

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

마우스 배아의 피부와 Melanoblast 이주의 라이브 영상의 생체 문화

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 문화 시스템 갑상선 개발을 연구하는

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The three-dimensional culture method described in this protocol recapitulates pancreas development from dispersed embryonic mouse pancreas progenitors, including their substantial expansion, differentiation and morphogenesis into a branched organ. This method is amenable to imaging, functional interference and manipulation of the niche.

분산 된 마우스 배아 전구 세포에서 생체 췌장 기관 형성에

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...