유세포 분석은 단일 세포의 다중 매개변수 분석을 가능하게 하는 강력한 기술입니다. 수백만 개의 세포를 분석하여 초기 및 후기 세포 사멸의 바이오마커를 정확하고 신속하게 식별할 수 있습니다. 여러 세포 분자가 염색되고 동시에 검출됩니다.
특히, 벤치탑 유세포 분석은 비전문가 유세포 분석기에 의한 분석 및 해석을 가능하게 합니다. 이 절차를 시연하는 것은 비타민 D 암 그룹의 대학원생 인 Esther Zhou가 될 것입니다. 섭씨 37도의 가습된 CO2 환경에서 5% CO2로 세포 배양을 성장시키는 것으로 시작합니다.
실험을 위해 세포를 통과시키기 전에 세포 배양이 부모 플라스크에서 약 70% 융합되는지 확인합니다. 플라스크에서 배지를 제거하고 세포를 1X PBS로 세척합니다. 그런 다음 1 밀리리터의 트립신을 첨가하여 세포를 분리하십시오.
세포가 분리되기 시작한 후 세포를 계산하기 전에 10% 태아 송아지 혈청이 보충된 약 5밀리리터의 신선한 배양 배지를 추가하여 트립신을 중화합니다. 6 웰 세포 배양 플레이트에서 3 밀리리터의 세포 배양 배지에서 밀리리터 당 15, 000 세포로 종자 세포. 배양 플레이트를 섭씨 37도에서 5% CO2로 밤새 배양하여 세포가 웰 바닥에 부착될 수 있도록 합니다.
다음날, 실험 배양액을 액티노마이신 D 밀리리터당 100 나노그램으로 처리하고, 배지 및 용매 대조군을 각각 신선한 배양 배지 및 DMSO로 24시간 동안 처리한다. 우물에서 배지를 제거하고 15 밀리리터 튜브에 소비 된 배지를 수집하십시오. 세포를 1X PBS로 세척합니다.
500 마이크로 리터의 트립신을 첨가하여 세포를 분리하십시오. 배지 1밀리리터를 2-3회 부드럽게 백피펫팅하여 웰 바닥에 아직 부착된 나머지 세포를 기계적으로 제거합니다. 웰의 용액을 15 밀리리터 튜브에 넣은 다음 5 밀리리터의 신선한 배양 배지를 첨가하여 트립신을 중화시킵니다.
DNA 결합 염료를 함유하는 시약 450 마이크로리터를 미세원심분리기 튜브에 피펫팅한다. 50 마이크로리터의 세포 현탁액을 미세 원심분리 튜브에 추가합니다. 튜브를 실온에서 5분 동안 배양합니다.
유세포 분석으로 세포를 열거합니다. 모든 샘플을 세포자멸사 분석을 진행하기 전에 세포 배양 배지로 밀리리터당 10 내지 6분의 1의 농도로 희석한다. 아넥신 V를 사용하여 포스파티딜세린의 외부화를 검출하기 위해, 100 마이크로리터의 세포 현탁액을 마이크로원심분리기 튜브에 첨가한다.
여기에 형광 복합 아넥신 V와 7-AAD 시약의 1:1 혼합물 100마이크로리터를 추가합니다. 빛으로부터 보호하여 실온에서 20 분 동안 배양하십시오. 미토콘드리아 막 탈분극 분석을 위해 먼저 300배 G에서 100마이크로리터의 세포 현탁액을 5분 동안 원심분리한 다음 상청액을 버립니다.
1밀리리터의 1X PBS에 세포를 재현탁합니다. 각 샘플에 100 마이크로리터의 TMRE 염색 용액을 첨가하고 부드러운 백-피펫팅으로 현탁액을 혼합한다. 샘플을 깨끗한 알루미늄 호일로 싸서 빛으로부터 보호하고 섭씨 37도의 가습된 CO2 환경에서 20분 동안 세포를 배양합니다.
배양이 끝나면 7-AAD 작업 용액을 샘플에 넣고 혼합하십시오. 활성화된 말단 카스파제-3 및 7을 검출하려면 먼저 DMSO에서 DEVE 결합 DNA 결합 펩타이드를 멸균 1X PBS로 1:8의 비율로 희석하여 카스파제 검출 작업 용액을 만듭니다. 용액을 얼음에 보관하거나 빛으로부터 보호되는 섭씨 2도에서 8도를 더하십시오.
148마이크로리터의 1X PBS에 2마이크로리터의 7-AAD 스톡 용액을 추가하여 7-AAD 작업 솔루션을 만듭니다. 용액을 얼음 위에 보관하거나 섭씨 2도에서 8도까지 빛으로부터 보호하십시오. 50 마이크로리터의 세포 현탁액을 300배 G에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 버린다.
50 마이크로리터의 1X PBS에 세포를 재현탁한 다음, 5 마이크로리터의 카스파아제 검출 작업 용액을 넣고 완전히 혼합합니다. 튜브의 캡을 풀고 빛으로부터 보호되는 섭씨 30도의 가습된 CO2 환경에서 37분 동안 배양합니다. 150 마이크로 리터의 7-AAD 작업 용액을 각 샘플에 추가하고 혼합하십시오.
빛으로부터 보호되는 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 이중 가닥 DNA 파괴 및 총 DNA 손상의 검출을 위해, 먼저 50 마이크로리터의 세포 현탁액을 300배 G에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 버린다. 500 마이크로리터의 1X PBS에 세포를 재현탁하고 500 마이크로리터의 포름알데히드 기반 고정 완충액을 첨가하고 혼합합니다.
샘플을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 300배 G에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버린다. 미세 원심분리 튜브에서 90마이크로리터의 1X PBS에 세포를 재현탁합니다.
10 마이크로리터의 항체 용액을 미세 원심분리기 튜브에 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 1X PBS 100 마이크로리터를 첨가하고 300배 G.Discard에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 버리고 200 마이크로리터의 1X PBS에 세포를 재현탁한다.
샘플을 유세포 분석기에 로드하기 전에 부드럽게 백피펫팅하여 샘플을 혼합합니다. 기기의 시스템 검사 키트를 실행하여 유세포 분석기의 분석 성능을 검증하고 모든 검사가 완료되고 통과될 때까지 샘플 실행을 진행하지 마십시오. 먼저, 음성 대조군 샘플을 유세포 분석기에 로드하고 Run(실행), Adjust Settings(설정 조정)를 선택하여 기기가 샘플 흡인을 시작하고 감지된 이벤트의 실시간 미리보기를 제공합니다.
실시간 미리보기를 사용하여 형광 및 세포 크기에 대한 임계값을 조정합니다. 세포 집단 주위에 직사각형 게이트를 그리고, 임계값 마커를 끌어 세포 파편을 제외하고, 다음, Apoptosis Profile 설정을 선택하여 계속 진행합니다. 사분면 마커를 탭하고 드래그하여 세포 집단을 분리하고 감지된 이벤트를 실시간으로 플로팅합니다.
이 플롯을 사용하여 최종 사용자에게 사분면 마커의 적절한 배치를 안내합니다. Next, Verify Settings(다음, 설정 확인)를 선택하여 계측기가 설정 요약을 표시하도록 계속 진행합니다. 설정을 검토한 후 다음, 설정 완료 를 선택하여 실험 내의 모든 샘플에 이러한 설정을 적용합니다.
부드럽게 백피펫팅하여 첫 번째 샘플을 혼합하고 첫 번째 샘플을 유세포 분석기에 로드합니다. 다음을 선택한 다음, 샘플의 이름을 지정하고 실행을 선택하여 시스템에서 샘플 실행을 시작하도록 합니다. 필요한 경우 수집 후 게이트 또는 사분면 마커의 미세 조정을 수행합니다.
시스템의 파일 브라우저로 이동하여 조정이 필요한 실험을 찾고 실험을 엽니다. 플롯의 썸네일 미리보기를 탭하면 확대됩니다. 사분면 마커를 조정하려면 수직선과 수평선의 교차점을 클릭하여 마커를 그대로 이동하고 선을 클릭하고 핸들을 드래그하여 두 선의 각도를 조정합니다.
셀 게이팅을 미세 조정하려면 게이트 탭을 클릭하고 게이트의 치수를 조정합니다. 원하는 대로 마커를 조정하고 확인 표시 아이콘을 선택하고 모든 샘플을 표시한 다음 수락을 선택하여 실험의 모든 샘플에 이러한 설정을 적용합니다. 검정을 세 번 실행하고 사후 Bonferroni 검정으로 분산 분석을 실행하여 표본과 대조군 간의 유의한 차이를 평가합니다.
세포 수 및 생존율 결과는 샘플의 세포 중 95.2%가 살아 있고 4.8%가 죽었다는 것을 보여주었습니다. 세포 농도는 밀리리터 당 105 세포의 5.90 배인 것으로 밝혀졌다. 아넥신 V 및 세포 사멸 분석은 대조군에 비해 밀리리터당 100나노그램의 악티노마이신 D로 처리된 SiHa 세포에서 세포사멸 세포에서 상당한 증가를 보여주었습니다.
미토콘드리아 전기화학적 막횡단 전위 분석은 액티노마이신-D, 배지 대조군 및 용매 대조군 사이의 세포 건강 프로파일의 현저한 감소를 입증했으며, 이는 밀리리터당 100나노그램의 액티노마이신 D가 SiHa 세포에서 미토콘드리아 탈분극을 유도했음을 시사했습니다. 카스파제-3 및 7 분석은 대조군과 비교하여 밀리리터당 100나노그램의 악티노마이신 D로 처리된 SiHa 세포에서 말단 카스파제의 상당한 활성화를 입증했습니다. 액티노마이신 D는 DNA 손상 마커, ATM 및 H2A를 유의하게 유도했습니다.
SiHa 세포에서 X는 DNA 손상의 상당한 증가를 시사했습니다. 정확도를 높이려면 전체 세포 집단을 수확해야 합니다. 또한 제조업체에서 권장하는 세포 농도 및 염색 시간을 준수하십시오.
염색된 샘플을 빛으로부터 보호하여 광표백 또는 형광단을 방지합니다. 유세포 분석에 의한 세포 사멸의 생화학 분석은 현미경으로 뒷받침되어야한다. 이것은 고전적인 세포 사멸의 형태 학적 특징을 확인할 것입니다.
특징으로는 핵 응축, 세포막 혼합, 세포 사멸체 및 karyorrhexis가 포함됩니다.
