apoptotic 반전 세포의 진정한 인구의 고립은 크게 세포 사멸 반전의 결과에 대한 우리의 이해를 제한하는 이전에 문제가되었습니다. 이 프로토콜은 우리가 세포 반전 세포의 순수한 인구를 생성 할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 사용되는 재료와 장비가 다른 기관에서 널리 사용할 수 있다는 것입니다.
이 기술은 세포 의 반전을 겪은 세포의 순수한 인구를 격리하기 위해 쉽게 적용 할 수 있습니다. 이전에 보고된 바와 같이, 정상 세포는 또한 유방암 세포, 상이한 화학세포, 정상 세포뿐만 아니라, 개시될 수 있고 각종 세포 자극을 사용할 수 있다는 것을, 세포 사멸 반전을 겪을 수 있다. 반전 셀은 세포가 세포사멸과 빠른 정렬을 거쳤기 때문에 회복율은 일반적으로 낮습니다.
더 큰 시작 셀 수는 최종 수율을 높이기 위해 재조합됩니다. 시작하려면, 문화 MCF-7, MDA-MB-231, 시작하려면, 문화 MCF-7, MDA-MB-231, 및 T47D 셀, 텍스트 프로토콜에 따라. 그 후, PBS로 세포를 두 번 세척한 다음 0.05%의 트립신-EDTA의 2밀리리터를 MCF-7에 0.05% 트립신-EDTA에 추가합니다. MDA-MB-231 세포, MCF-7 및 MDA-MB-231 세포, T47D 세포에 0.25%의 트립신-EDTA와 2밀리리터의 2밀리리터.
T47D 셀에. 5%의 이산화탄소 세포 배양배에서 섭씨 37도에서 5분간 세포를 배양합니다. 세포가 배양하는 동안, 트립신-EDTA에 의한 과다 소화를 방지하기 위하여 현미경으로 세포의 분리를 확인하십시오.
세포의 90% 이상이 분리되면 완성된 RPMI 배지 5밀리리터를 접시에 넣고 셀 층 표면에 여러 번 파이펫을 넣습니다. 그런 다음 세포를 15 밀리리터 원내 튜브 및 원심분리기로 이송합니다. 상체를 버리고 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리구에서 FACS 버퍼로 펠릿을 다시 중단하십시오.
그런 다음 세포를 여러 튜브로 나눕니다. 튜브를 다시 한 번 원심 분리하고 상체를 폐기하십시오. 그런 다음 희석된 Fc 블록을 샘플에 추가합니다.
샘플을 다시 원심분리하기 전에 20분 동안 어둠 속에서 얼음에 샘플을 배양합니다. 이 후, 상체를 폐기. 다음으로, 인간 CD44 및 CD24에 대하여 불소크롬-공주된 단일클론 항체를 인간 CD44 및 CD24에 대하여, 각각 1-40, 및 1-10 희석제에 대하여, 이중 염색 단에 추가한다.
양성 대조군을 위해, CD44 항체를 첨가하여 양성 대조군을 위해, MDA-MB-231 세포에 CD44 항체를 추가하고, MDA-MB-231 세포에, CD24 항체를 MCF-7 세포 및 CD24 항체에 1~40, 1-10희석제, 각각 1~10개의 희석제에 첨가한다. PerCP-Cy5.5 마우스 IgG2b 카파를 추가하고, CD44 항체에 대한 동위원소 대조군으로서 세포에 대한 1 대 40 비율로 희석된 PerCP-Cy5.5 마우스 IgG2b 카파를 추가합니다. 이어서, PE 마우스 IgG2a Kappa를 추가한 다음, CD24 항체에 대한 동위원소 대조군으로서 세포에 1 대 10 비율로 희석된 PE 마우스 IgG2a Kappa를 첨가한다.
30 분 동안 어둠 속에서 섭씨 4도에서 샘플을 배양. 그런 다음 300g'sThen에서 샘플을 원심분리하고 샘플을 300g및 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다. 상체를 버리고 500 마이크로 리터의 PBS로 펠릿을 두 번 씻으십시오.
그런 다음 이전에 설명한 대로 원심분리를 반복합니다. PBS의 0.5 밀리리터에 펠릿을 다시 일시 중단하고 40 마이크로미터 나일론 메쉬를 통해 서스펜션을 필터링합니다. 그런 다음 형광 활성화 셀 선별기를 통해 서스펜션을 실행합니다.
CD44 음성, CD24 양성 마커를 수집하여 수집 배지의 1밀리리터를 포함하는 둥근 바닥 튜브에서 세포를 수집합니다. 그런 다음 튜브를 원심 분리하고 상체를 폐기합니다. 다음으로, 선별된 유방 비줄기 암세포를 신선한 수집 배지를 함유하는 배양 접시에 플레이트하여 추가 배양에 대한 배양.
먼저, DMSO에서 1밀리머 스타우로스포린을 사용하여 텍스트 프로토콜에 따라 2.5 마이크로 어금니 스타우로스포린을 매체로 준비한다. 그런 다음, 세포로부터 배양 배지를 제거한다. PBS의 2 밀리리터로 세포를 한 번 세척한 후, 6시간 동안 MSF-7 세포에 staurosporine 배지의 10 밀리리터를 추가하여 세포가 70% 컨실수일 때 세포가 석멸을 유도합니다.
다음으로, DMSO에서 밀리머 파클리탁셀 1개를 준비한다. 그런 다음 12.5 마이크로 리터를 추가한 다음 1밀리미터 파클리탁셀의 12.5 마이크로 리터를 T47D 세포의 완성된 배지에 추가하여 15 밀리리터 원컬 튜브에서 10 밀리리터의 최종 부피를 구성합니다. 세포에서 배양 배지를 제거하고 PBS의 2 밀리리터로 세포를 세척하십시오.
이어서, 세포가 70%의 합류에 도달할 때 세포가 세포에 10시간 동안 세포에 첨가하여 세포가 70%의 합류에 도달할 때 세포가 세포에 도달할 때 세포가 세포에 세포가 세포에 서멸을 유도하도록 유도한다. 그 후, 용매 처리 MCF-7 그룹에서 배지를 제거하고 PBS의 2밀리리터로 세척한다. 그런 다음, 0.25% DMSO 배지의 10 밀리리터를 추가한 다음, Staurosporine용 용매 제어로 6시간 동안 0.25% DMSO 배지의 10밀리리터를 추가합니다.
용매 처리 된 T47D 그룹에서 배양 배지를 제거하고 PBS의 2 밀리리터로 세포를 세척하십시오. 그런 다음, 0.05% DMSO 배지의 10 밀리리터를 추가한 다음, 파클리탁셀용 용매 제어로 10시간 동안 0.05% DMSO 배지의 10밀리리터를 추가합니다. 다음으로, 세포를 얼룩지게 하고 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다.
60배의 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 처리된 세포의 형태학적 변화를 관찰한다. 염색은 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 37도에서 30분 동안 어둠 속에서 세포 멸폐 유도제 및 용매 처리 MCF-7 및 T47D 세포와 용매 처리 MCF-7 및 T47D 세포를 모두 염색한다. 형광 활성화 세포 선별기를 사용하여, 수집 배지의 1 밀리리터를 포함하는 둥근 바닥 튜브에서 유도자 처리 된 그룹에서 양성 세포를 수집한다.
그런 다음, 이전에 설명한 바와 같이 튜브를 원심분리하고 상신을 폐기한다. 수집 배지의 1 밀리리터와 둥근 바닥 튜브에서 용매 처리 된 그룹에서 음의 세포를 수집합니다. 튜브를 원심 분리하고 상체를 폐기하십시오.
그런 다음 정렬된 셀을 신선한 수집 배지에서 다시 중단합니다. 12웰 조직 배양 판에 세포를 시드하고, 세포 배양 반전에 대한 7 일 동안 배양. 0.05% 트립신-EDTA를 유도하는 유도제 및 용매 처리 군 모두에서 반전된 MCF-7을 수확한다.
0.05%의 트립신-EDTA. 이어서, T47D 세포를 유도자 에서 수확한 다음, 0.25%의 트립신-EDTA를 유도하는 유도제 및 용매 처리 군 모두에서 T47D 세포를 수확한다. 인간 CD44 및 CD24에 대한 불소-공주 단일 클론 항체를 가진 세포를 얼룩.
세포 얼룩 동안, 이전에 설명한 대로 등색형 컨트롤을 준비한다. 마지막으로, 유동 세포계에서 세포를 실행하고 CD44 양성 및 CD24 음성 마커를 가진 세포의 백분율을 감지합니다. 이 프로토콜에서, 유방 비줄기 암세포에서 유방 CSC 같이 세포로의 전이가 관찰되었다.
비줄기 암세포의 분리는 MCF-7 세포에서 처음 수행되었다. 전형적인 형태학적 변화는 세포 유도제를 첨가한 후 관찰되었고, 세포는 약물 철수 후 유사한 형태를 가진 세포로부터 회복되었다. 카스페이스 활성화 된 세포는 카스페이스 활성화없이 세포보다 높은 형광 강도에 기초하여 표지및 분류되었다.
세포유도 과정에서 용매는 사실 절차 또는 용매 자체가 전환의 원인이 될 가능성을 배제하는 데 사용되었다. 세포-유도제 치료 군에서 Caspace 활성화 세포는 넥신 5 양성 및 PI 음성으로 발견되었으며, 이는 세포 세포임을 시사한다. 상기 세포세포는 용매 처리군에 비해 회복을 위해 수집및 배양되었고, 유동 세포측정 분석은 CD44 양성 및 CD24 음성 사분면에 나타나는 세포가 반전된 원래 유방암 비줄기암 세포 집단에서 나타나는 것으로 나타났다.
재갈은 유량 분석 및 세포 정렬에서 중요하며 실험실에서 충분한 제어를 준비해야합니다. 이 시험관 내 세포 세포 반전 절차는 순수한 세포 암세포를 분리하기 때문에, 생체 내 종양 발생 자산과 같은 실험은 실제 세포의 결과를 이해하기 위해 수행 될 수있다. 이 기술은 암 재발의 원인에 빛을 비추므로 암 환자의 재발을 잠재적으로 예방하기 위해 조사 될 수 있습니다.
기관에서 생물 안전 계층 규정에 따라 세포 배양 실험을 수행 할 때 제대로 자신을 보호해야합니다.
