이 프로토콜은 개별 적인 macropinosomes의 lumen 내의 각종 프로세스 및 생화확적인 파라미터의 실시간 평가를 허용합니다. 이러한 방법은 거시피노세포증의 세포 생물학에서 약물 발견에 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 세포 및 세포 기관 수준 모두에서 이질성을 드러내는 이점을 제공합니다.
분석 종자 Raw264.7 세포의 밀도가 5배 10배, 우물당 100 마이크로리터, 검은 면이 있는 유리 바닥 96웰 플레이트에서 세포의 힘에 10배. 분석 당일 우물이 적어도 70 % 컨실수 있는지 확인하십시오. 그런 다음 모든 우물을 섭씨 37도에서 예온한 HBSS 100 마이크로리터로 씻으시다.
다음으로, 70킬로달톤 dextran으로 표시된 TMR의 밀리리터당 0.025 밀리그램을 함유한 HBSS 100마이크로리터와 각 우물에 70킬로달톤 데엑스트라로 표시된 플루오레세인 밀리리터당 0.025 밀리그램을 추가한 다음 세포를 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 인큐베이션이 완료되면 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 HBSS 100 마이크로리터로 세포를 6번 세척합니다. 마지막 세척 후 세포에 미리 따뜻해진 HBSS의 100 마이크로리터를 추가한 다음 가열된 단계와 챔버가 있는 현미경에 플레이트를 놓습니다.
필요에 따라 TMR 및 형광에 대한 발수 및 방출 파라미터를 조정한 후 각 우물 사이에 두 형광을 번갈아 가며 각 우물에서 각 우물에서 이미지를 얻습니다. 첫 번째 획득 후 모든 우물이 전체 플레이트에 초점을 맞추고 있는지 확인한 다음 원하는 시간 동안 1~15분 간격으로 각 웰의 이미지를 수집합니다. 영상 습득 시, 필요에 따라 10개의 어금반 염산 또는 10개의 어금반 칼륨을 사용하여 25밀리몰러 HEPES에서 7.5로 완충된 칼륨이 풍부한 용액의 50 밀리리터 알리쿼트의 pH를 조정한다.
그런 다음 25 밀리머 MES로 버퍼링된 칼륨 이 풍부한 용액의 350 밀리리터 알리쿼트의 pH를 pH 6.5, pH 5.5 및 pH 5.0으로 조정한다. 이미지 수집이 완료되면, 세포를 포함하는 96웰 플레이트에서 HBSS를 제거하고 pH 7.5에서 칼륨이 풍부한 용액을 추가한다. 그런 다음 밀리리터 당 10 마이크로 그램의 최종 농도에서 나이지리아인을 추가합니다.
플레이트를 현미경에 다시 배치하고 이전에 설명한 것과 동일한 획득 설정을 사용하여 각 웰의 이미지를 획득합니다. macropinosomes 내의 산화 적 이벤트를 측정하기 위해, 종자 RAW264.7 세포는 이전에 입증 된 바와 같이 분석 하루 전에 96 웰 플레이트에서 세포. 그런 다음 분석 당일 에 모든 우물을 세척 100 HBSS의 마이크로 리터는 섭씨 37도에 예동.
다음으로, TMR 라벨이 부착된 TMR의 밀리리터당 0.025 밀리그램을 함유한 100마이크로리터와 H2DCFDA의 밀리리터당 0.025 밀리그램을 각각 70킬로달톤 데슈톤으로 표시한 다음 세포를 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 인큐베이터에서 플레이트를 제거한 후 HBSS의 100 마이크로리터로 세포를 6번 세척한다. 마지막 세척 후, 각 우물에 100 개의 미세 리터를 추가하고 현미경에 접시를 놓습니다.
필요에 따라 TMR 및 H2DCFDA에 대한 흥분 및 방출 매개 변수를 조정한 후 이전에 설명한 대로 각 웰의 이미지를 1~15분 간격으로 획득합니다. macropinosomes 내에서 단백질 소화를 측정 하기 위해, 씨앗 RAW264.7 세포 분석 하루 전에 세포, 이전에 설명 한 바와 같이. 그런 다음 분석 당일 모든 우물을 세척하고 100 마이크로리터의 HBSS가 섭씨 37도에 예동을 유지합니다.
다음으로 100개의 미암초를 첨가하여 TMR의 밀리리터 당 0.025 밀리그램을 함유하고 있으며, 70킬로달톤 디엑스트라인은 밀리리터 BODIPY 라벨이 부착된 ovalbumin당 0.2 밀리그램으로 표시됩니다. 그런 다음 접시를 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 인큐베이터에서 세포를 제거 한 후 HBSS의 100 마이크로 리터로 6 번 세척하십시오.
마지막 세척 후 각 우물에 HBSS의 100 마이크로 리터를 추가 한 다음 현미경에 접시를 놓습니다. 필요에 따라 TMR 및 BODIPY에 대한 여기 및 방출 매개 변수를 조정한 후 이전에 설명한 대로 각 웰의 이미지를 1~15분 간격으로 획득합니다. macropinosomes에서 pH, 산화 이벤트 또는 단백질 분해를 측정할 때, 산성화의 역학은 사용되는 세포 유형에 따라 달라지는 dextran 로딩 단계에 대응하는 일정 기간 동안 측정할 수 없습니다.
거형 pH를 측정할 때, 형광염 대 TMR 비율은 점진적으로 작아지고 취득 후 15분 이내에 고원이 될 것이다. 이 고원은 대략 리소좀의 pH와 일치하는 대략 5의 pH에 해당합니다. 각 인수가 끝나면 In situ 교정이 수행됩니다.
형광대 TMR 비율은 pH 7.5의 교정 버퍼 내에서 가장 크어야 하며 교정 버퍼가 산성화됨에 따라 점진적으로 작아져야 합니다. 이렇게 하면 교정 곡선을 생성할 수 있습니다. 매크로피노좀 내에서 산화 적 이벤트를 측정할 때, H2DCFDA에서 TMR에 대한 비율은 점진적으로 더 커지고 활성화된 RAW264.7 세포에서 처음 20~30분 내에 고원이 될 가능성이 높습니다.
거형 단백질 소화를 측정할 때, ovalbumin이 소화됨에 따라 점진적으로 강한 형광 신호가 해방됩니다. RAW264.7 세포에서 소화된 BODIPY 라벨ovalbumin로부터 해방된 형광의 증가는 처음 30분 이내에 고원하게 될 것이다. 항상성에 있는 이 새로운 역할 및 암 병리에 새로 발견된 관련성으로, 르네상스 적인 macropinocytosis 연구는 현재 진행되고 있습니다.
이러한 방법은 이러한 연구 분야에 대한 거시적 세포증의 기여를 탐구하기 위한 도구 상자에 제공되었습니다.
