무세포 자동 유도 방법은 기능성 세포 추출물을 생산하는 데 필요한 연구자의 감독과 시간을 줄여줍니다. 이것은 더 많은 시간과 집약적이었던 이전의 시험관내 단백질 합성 프로토콜을 단순화합니다. 이 기술은 덜 복잡하고 수율이 높기 때문에 더 많은 청중이 세포없는 표현을 구현할 수 있습니다.
이 방법은 세포 성장 중 및 무세포 반응 내에서 에너지 대사의 중요성을 강조합니다. 960 밀리리터의 무세포 자동 유도 배지를 준비하여 시작하십시오. 그런 다음 섭씨 121도에서 30 분 동안 오토클레이빙하여 2.5 리터 배플 플라스크에서 미디어를 멸균하십시오.
다음으로, 40 밀리리터의 설탕 용액을 준비한 후, 별도의 오토클레이브 유리 용기에 필터-멸균한다. 오토클레이빙 후, 배양 배지가 섭씨 40도 이하로 냉각되었을 때, 필터-멸균된 설탕 용액을 배지에 직접 첨가한다. 다음으로, 이전에 줄무늬가 있는 신선한 E.coli BL21 별판으로부터 콜로니로 가득 찬 루프를 스와이프하고 루프를 배지에 직접 삽입하여 배지를 접종한다.
루프를 컨테이너의 측면을 만지지 않고 미디어로 소용돌이치십시오. 이어서, 접종된 배지를 섭씨 30도 배양기에 밤새 놓고 200 RPM에서 진탕시킨다. 다음날, 배지 1리터를 1리터 원심분리기 병으로 옮기고 섭씨 4~10도 사이에서 5, 000배 G에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수확한다.
상청액을 버린 후, 멸균 주걱을 사용하여 펠렛을 미리 냉각되고 이전에 칭량된 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 다음에, 펠릿을 30 내지 40 밀리리터의 차가운 S30 버퍼로 한번 세척하고, 얼음 위에서 휴식 기간으로 30초 파열로 볼텍싱을 통해 펠릿을 재현탁시킨다. 펠렛이 완전히 재현탁된 후, 세포를 재현탁시키고, 상청액을 버리고, 깨끗한 조직을 사용하여, 펠릿을 건드리지 않고 50밀리리터 튜브의 내벽으로부터 과량의 상청액을 닦아낸다.
그런 다음 플래시 냉동 전에 펠렛을 액체 질소에서 칭량하고 추가 사용 될 때까지 영하 80도에 보관하십시오. 세포 추출물을 제조하기 위해, 동결된 세포 펠릿의 그램 당 1 밀리리터의 S30 버퍼를 첨가하고, 펠릿이 30 내지 60분 동안 얼음 위에서 해동되도록 한다. 그런 다음, 가시적 인 세포 덩어리가 남지 않을 때까지 얼음 위에 휴식 기간으로 30 초의 버스트에서 볼텍싱을 통해 해동 된 펠릿을 재현탁하십시오.
세포 용해를 위해, 세포 현탁액의 1.4 밀리리터 분취량을 1.5 밀리리터 마이크로퍼지 튜브로 옮긴다. 그런 다음 얼음 욕조에서 사이클 당 59 초의 휴식으로 45 초의 세 번의 버스트에 대해 20 킬로 헤르츠 및 50 % 진폭의 주파수로 각 튜브의 세포 현탁액을 초음파 처리하십시오 사이클 사이에 튜브를 반전시키고 마지막 초음파 처리 사이클 후에 즉시 4.5 마이크로 리터의 원몰 디티오 트레이톨을 첨가하십시오. 세포 현탁액을 모든 튜브에서 초음파 처리한 후, 튜브를 원심분리하고, 600-마이크로리터 분취액에서 상청액을 신선한 1.5-밀리리터 마이크로퍼지 튜브로 수집한다.
플래시 동결 및 추가 사용 될 때까지 영하 80도에서 분취량을 저장합니다. 15 마이크로리터의 무세포 단백질 합성 반응을 사분면의 1.5 밀리리터 마이크로퍼지 튜브에서 수행하려면, 세포 추출물의 1 분취량을 해동시킨다. 각 15-마이크로리터 반응 혼합물을 준비한 후, 섭씨 37도에서 적어도 네 시간 동안 반응을 실행시킨다.
리포터 단백질을 정량화하려면 pH 7.2에서 48마이크로리터의 50밀리몰 HEPES 버퍼를 검은색 폴리스티렌 96웰 플레이트에서 각 무세포 단백질 합성 반응 생성물 2마이크로리터와 결합한다. 초폴더 녹색 형광 단백질 또는 sfGFP의 형광 강도를 여기파장 485 및 방출 파장 528 나노미터를 사용하여 정량한다. 이어서, 정제된 pJL1 sfGFP 플라스미드를 사용하여 표준 곡선을 생성함으로써 상대적 형광 단위를 sfGFP의 부피 수율로 전환시킨다.
여기에 나타낸 것은 600 나노미터에서 측정된 상이한 광학 밀도에서 세포 수확 후 무세포 자동 유도 배지 펠릿이다. 광학 밀도 10으로 성장한 배지는 광학 밀도 2.5로 성장한 배지보다 전체 추출물에서 더 많은 양의 세포 펠릿을 생성하였다. 총 단백질 농도의 추가 분석은 두 추출물 사이의 전체 단백질에서 유의 한 차이가 없음을 입증했다.
배지가 상이한 광학 밀도 수준으로 성장했음에도 불구하고, 두 추출물 모두 sfGFP를 발현하는 무세포 반응에서 유사한 결과를 입증하였다. 배지와 설탕 용액을 준비하면서 멸균 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 이 CFAI 세포-추출 방법은 무세포 발현의 대부분의 적용에 사용될 수 있다.
이들은 생명 공학 교육에서 단백질 공학뿐만 아니라 진료 시점 진단에 이르기까지 다양합니다. 이 방법은 필요한 시간과 기술 기술을 줄이고 재현성을 향상 시키며 더 많은 양의 추출물을 생산합니다.
