당사의 방법은 클로닝 대신 무세포 발현 시스템 및 PCR을 사용하여 유전 부분의 신속한 특성 분석을 가능하게 합니다. 이 기술의 주요 장점은 일반적으로 세포에서 며칠에서 몇 주가 걸리는 작업을 이 방법을 사용하여 몇 시간에서 며칠 내에 수행할 수 있다는 것입니다. 당사의 프로토콜에는 자체 무세포 발현 시스템을 만드는 단계가 포함되어 있으며, 이는 여러 곳에서 까다로울 수 있으며 사용 사례에 따라 조정이 필요할 수 있습니다.
처음 시작할 때는 상용 키트로 시작하는 것이 좋습니다. 원고의 지침에 따라 PCR 마스터 믹스를 준비하고 얼음에 보관하십시오. 마스터 믹스의 30 또는 40 마이크로리터를 결정된 수의 PCR 튜브에 분취하고, 적절하게 표지된 PCR 튜브에 각각 10마이크로리터의 5개의 마이크로몰 가변 프라이머를 첨가한다.
PCR 튜브를 열순환기에 넣고 텍스트 원고에 언급된 대로 PCR 프로그램을 실행합니다. 그런 다음 반응을 섭씨 4도에서 유지하십시오. 원래 주형이 혈장 DNA인 경우 1마이크로리터의 DpnI 제한 효소를 추가하여 원래 주형을 소화하고 반응을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.
180볼트에서 20분 동안 1%아가로스 겔을 사용하여 분리하여 각 PCR 산물의 5마이크로리터를 분석합니다. 선택한 코어 시퀀스와 추가된 부품의 길이에 따라 달라지는 올바른 밴드 크기를 확인합니다. 상용 PCR 정제 키트를 사용하여 선형 주형을 정제합니다.
겔 전기 영동에 의해 여러 밴드가 존재하는 경우 제조업체의 지침에 따라 겔에서 관심 밴드를 제거하고 상업용 젤 추출 키트를 사용하여 DNA를 정제합니다. 분광 광도계를 사용하여 각 DNA 주형을 정량화하고 260에서 280 나노 미터 비율이 약 1.8인지 확인하여 품질을 평가합니다. 얼음에서 모든 성분을 해동하고 원고에 언급 된대로 모든 성분을 피펫으로 완전히 혼합하여 마스터 믹스를 준비하십시오.
특히 아미노산 혼합물의 경우 강수량을 피하기 위해 세심한주의를 기울이십시오. 마스터 믹스를 얼음 위에 보관하십시오. 384웰 플레이트를 얼음 위에서 식히고 마스터 믹스를 9마이크로리터 분취량으로 각 웰에 분배합니다.
리프레서 단백질을 얼음에서 해동하고 음향 액체 취급 소스 플레이트에 분배하여 사용된 소스 플레이트 유형에 필요한 적절한 양의 데드 볼륨이 포함되도록 합니다. 리프레서 단백질을 1마이크로리터 부피로 액체 처리기를 통해 적절한 대상 웰에 분배합니다. 정제된 리포터의 연속 희석액 또는 적절한 화학 표준물질을 플레이트에 포함하여 결과를 다른 연구 및 다른 실험실과 비교합니다.
실험의 예상 발현 범위에서 사용되는 리포터에 적합한 농도 범위를 선택하십시오. 플레이트 리더를 섭씨 30도까지 예열합니다. 가능하면 기기에서 섭씨 1도의 수직 온도 구배를 설정하여 씰의 응결을 제한하십시오.
플레이트 리더가 흔들림 없이 코어 시퀀스에 사용되는 리포터에 적합한 설정에서 읽도록 설정합니다. 증발을 방지하기 위해 384웰 플레이트를 불침투성 플라스틱 씰로 밀봉합니다. 384웰 플레이트를 플레이트 홀더에 놓고 읽기를 시작합니다.
tetO 서열에 대한 T7 프로모터의 거리에서만 변하는 15개의 선형 주형을 PCR에 의해 제조하고, 각 프로모터 변이체를 추가하도록 설계된 프라이머와 함께 슈퍼폴더 녹색 형광 단백질 리포터를 증폭시켰다. 전체 T7 tetO 조합 세트에 대한 총 540 개의 반응 데이터 분석 결과, T7 RNA 중합 효소는 T7 전사체의 시작부터 13 개의 염기쌍 다운 스트림까지 T7 구동 발현을 동일하게 하향 조절하는 것으로 나타났습니다. 음향 액체 처리기를 사용하여 일련의 8개의 목적지 웰에 걸쳐 보다 일관된 분주는 5마이크로리터 이송이 별도의 1마이크로리터 분주로 분할되었을 때 관찰되었습니다.
당사의 프로토콜은 새로운 바이오 센서의 스크리닝 또는 유전 부품의 라이브러리 구축에 관계없이 유전 성분을 신속하게 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다.
