세포없는 유전자 발현 시스템의 사용에 의해 합성 유전자 네트워크를 프로토타이핑하는 것이 크게 향상됩니다. 당사의 프로토콜은 다층 미세 유체 흐름 반응기의 제조 공정을 설명하고 이러한 장치가 GFP의 장기간 세포 없는 발현에 사용될 수 있음을 보여줍니다. 미세 유체 유량 반응기와 결합된 세포 없는 단백질 발현은 합성 생물학적 장치의 설계를 위한 신속한 프로토타이핑 플랫폼을 제공합니다.
이 전체 설정은 매우 다재다능하며 높은 수준의 제어를 요구하는 생화학 적 또는 화학 반응의 전도에 적응 할 수 있습니다. 세포 없는 반응 용액의 안정성을 보장하는 것은 중요하고 달성하기 어렵다. 충분한 냉각을 제공하는 데 집중하고 이 프로토콜에 지정된 튜브를 활용하십시오.
실험 플랫폼을 제작하고 준비하려면 시각적 인 보조 없이 는 따라하기 어려울 수 있는 수많은 개별 구성 요소의 연결이 필요합니다. 먼저, 동반 텍스트 프로토콜을 따라 미세 유체 장치를 제조하고 이 장치에 중요한 밸브를 제어하는 데 사용되는 공압 제어 및 유압 조절을 설정합니다. 오프 칩 냉각을 설정하려면 펠티에 요소의 차가운 면에 PTFE 튜브의 길이를 코일링하고 테이프로 코일을 고정합니다.
PTFE 튜브의 한쪽 끝이 유동 층 압력 제어 시스템의 저장소에 연결되어 있고 다른 쪽 끝이 펠티에 표면에서 1센티미터 이상 튀어오르지 않도록 합니다. 다음으로 PTFE 튜빙의 돌출 끝에 PEEK 튜브의 5~ 10센티미터 길이를 삽입합니다. 펠티에 요소의 뜨거운 면에 충분한 양의 열 화합물을 적용하여 물 블록의 차가운 접시에 놓습니다.
튜브, 펠티에 요소 및 냉각 블록이 항상 서로 직접 접촉하고 있는지 확인합니다. 그런 다음 펠티에에 제공된 전압을 조절할 수 있도록 직렬 버스 커넥터를 사용하여 펠티에 요소를 온도 컨트롤러에 연결합니다. 그런 다음 펠티에 표면에 테미터를 단단히 배치하고 출력을 온도 컨트롤러에 연결합니다.
물 냉각기를 켠 후 온도가 섭씨 4도에서 안정될 때까지 펠티에공급된 전압을 조정합니다. 미세 유체 장치의 각 제어 채널에 대해 1미터 길이의 표준 튜브 길이를 절단합니다. 한쪽 끝에는 23 게이지의 핀, 반인치 루어 스텁을 삽입하고 다른 쪽 끝에는 스테인레스 스틸 연결 핀을 삽입합니다.
루어 스텁을 남성 Luer 3/32 인치 가시 나일론 커넥터에 연결하고 커넥터의 바브를 폴리우레탄 튜브 의 길이에 삽입합니다. 그런 다음 이 폴리우레탄 튜브를 솔레노이드 밸브 중 하나에 직접 삽입합니다. 다음으로 23 게이지 하프 인치 루어 스텁을 주사기에 부착하고 표준 튜빙의 3 ~ 4 센티미터 길이조각에 삽입합니다.
이 튜브의 열린 끝을 초순수 수의 저수지에 넣고 주사기를 초순수물로 채웁니다. 여기에 도시된 바와 같이 미세 유체 장치의 각 제어 채널을 번호. 4~29번 채널의 경우 해당 튜브를 찾아 주사기에 부착된 튜브의 열린 끝에 금속 핀을 삽입합니다.
그런 다음 길이의 절반이 채워질 때까지 제어 채널 튜브에 물을 주입합니다. 다음으로, 주사기에서 튜브를 분리하고 스테인레스 스틸 커넥터 핀을 미세 유체 장치의 해당 구멍에 삽입합니다. 모든 제어 채널에 대해 이 단계를 반복합니다.
이제 제어 인터페이스를 사용하여 솔레노이드 밸브를 모두 엽니다. 이렇게 하면 제어 채널 튜브 내의 유체가 미세 유체 장치로 강제로 유입되고 장치 내의 모든 멤브레인 기반 밸브를 닫습니다. 각 냉각시 시약은 저수지 출구를 미세유체 장치 입구에 연결하기 위해 표준 튜브의 미터 길이를 절단합니다.
튜브의 한쪽 끝을 가지고 튜브가 저수지의 바닥에 도달 할 수 있도록 저수지에 삽입합니다. 저수지 튜브 콘센트를 조여 밀폐 씰이 달성되어야 합니다. 그런 다음 스테인레스 연결 핀을 튜브의 열린 끝에 삽입합니다.
다음으로, 1 밀리리터 주사기의 끝에 23 게이지 반 인치 루어 스텁을 부착합니다. Luer 스텁에 짧은 길이의 표준 튜빙을 추가합니다. 튜브의 끝을 원하는 시약 용액에 넣고 시약으로 주사기를 채웁니다.
그런 다음 주사기에 연결된 폴리우레탄 튜브에 스테인레스 스틸 커넥터 핀을 삽입하고 시약으로 튜브를 채웁니다. 작은 반응 볼륨을 사용하는 경우, 시약은 저수지에 들어가지 않으며 튜브 자체는 저수지 역할을합니다. 완료되면 주사기를 분리하고 커넥터 핀을 미세 유체 장치의 유동 층 입구 구멍 중 하나에 삽입합니다.
그런 다음 압력 레귤레이터 소프트웨어를 사용하여 각 저장소에 압력을 가하여 시약을 미세 유체 장치로 강제로 넣습니다. 펠티에의 표면 온도가 섭씨 4도로 설정되어 물 냉각기와 펠티에 원소가 켜져 있는지 확인합니다. 냉각 설정을 가능한 한 미세 유체 장치에 가깝게 마운트하여 펠티에와 장치 입구 사이의 냉각되지 않은 부피를 최소화합니다.
그런 다음 1 밀리리터 주사기를 23 게이지 반 인치 루어 스텁에 연결하여 단부에 부착된 짧은 길이의 표준 튜브를 연결합니다. 시약을 냉각하여 주사기를 채우도록 그립니다. 다음으로 결합 튜브를 통해 PEEK 튜브를 주사기에 연결하고 PEEK 튜브를 통해 시약을 강제로 시약에 일정한 압력을 가하여 PTFE 튜브에 넣습니다.
마지막으로 주사기에서 PEEK 튜브를 분리하고 미세 유체 장치의 흐름 채널 입구에 직접 삽입합니다. 압력이 가해지면 냉각된 시약이 미세 유체 장치로 강제로 강제로 들어갑니다. 모든 제어 및 유동 층 튜브가 부착된 현미경 단계에서 미세 유체 장치가 안전한지 확인하고 인큐베이터의 모든 개구부를 닫습니다.
다음으로 인큐베이터의 주변 온도를 섭씨 29도로 설정합니다. 그런 다음 냉각 시스템이 켜져 있고 실험을 시작하기 전에 섭씨 4도로 설정되어 있는지 확인합니다. 유량 채널 압력 레귤레이터에 가해지는 압력이 800 밀리바로 설정되어 있고 소프트웨어를 사용하여 각 개별 유량 채널의 출력 압력을 20~100밀리바 사이로 설정합니다.
제어 채널 솔레노이드 밸브에 가해지는 압력이 채널 1~8개, 채널 9~29의 경우 3개의 막대가 있는지 확인합니다. 다음으로, 채널(29)을 가압하여 장치의 출구를 닫고 동시에 제어 채널을 1~3및 15~28로 우울화한다. 그런 다음 선택적으로 멀티플렉스의 제어 채널을 우울화하여 선택한 단일 시약이 장치로 흘러 들어갈 수 있도록 합니다.
현미경을 사용하여 공기 제거를 모니터링하고 기포를 도입하지 않고 모든 시약이 올바르게 흐르도록 합니다. 제공된 소프트웨어 패키지를 사용하여 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 교정 프로세스와 관련된 데이터 필드를 설정합니다. 이어서 교정 프로토콜을 실행하여 단일 유입 단계에서 각 반응기에서 변위된 유체 부피를 결정합니다.
제어 소프트웨어가 제시한 단계와 함께 교정 실험의 분석을 완료하고 미세 유체 장치에서 각 링 반응기의 새로 고침 비율을 결정합니다. 마지막으로 가상 제어 인터페이스 내에서 원하는 실험에 필요한 값을 설정합니다. 제어 인터페이스에서 수행 실험 버튼을 눌러 실험 프로토콜을 시작합니다.
교정 실험 중에 반응기는 각 희석 후 강도가 기록되는 불소로 소각로 가득 차 있습니다. 희석당 형광 강도의 감소는 정해진 수의 유입 단계에 대해 변위된 반응기 고리의 부피를 나타낸다. 이 볼륨을 새로 고침 비율이라고 합니다.
평균 새로 고침 비율과 표준 편차는 빨간색의 각 희석 단계에 대해 표시됩니다. 8개의 원자로 중 7개는 매우 유사한 동작을 보여주지만, 원자로 1개는 7차 희석 주기 이후 변동을 나타낸다. 이는 각 반응기에 대한 고유한 새로 고침 비율의 필요성을 강조합니다.
여기에 나타난 장기간의 체외 성적 증명서 및 번역 반응은 원자로 부피의 30 %가 14.6 분마다 대체되었습니다. 빈칸으로 사용되는 미세 유체 장치의 두 개의 반응기. 다른 모든 반응기는 시험관 내 전사 및 번역 반응 용액75%와 초순수수 또는 2.5 나노몰러 선형 DNA 템플릿코딩으로 구성되어 deGFP 단백질의 발현을 용인하였다.
DNA가 추가된 4개의 반응기 에서, 명확한 deGFP 발현이 있었습니다. 하나의 반응기는 낮은 형광 신호를 표시합니다. 이는 반응기에 들어가는 DNA가 적거나 반응기 치수의 변화로 인해 흐름의 차이로 인해 발생할 수 있습니다.
14 시간 후에, DNA를 포함하는 반응기의 신호에서 급격한 증가가 보입니다. 이는 미세 유체 장치의 유동층으로 유입되는 기포에 기인한다. 흐름이 재개되면 실험은 이전의 형광 강도로 돌아갑니다.
세포 없는 반응 솔루션은 충분히 냉각되지 않는 한 시간이 지남에 따라 저하될 수 있으며, 이 프로토콜에 설명된 냉각 공정을 중요하게 만듭니다. 플랫폼의 다재다능함으로 인해 다양한 생화학 및 화학 반응을 정밀하고 통제된 방식으로 수행할 수 있습니다. 미세 유체 유량 반응기의 적용은 이중 유전 회로 프로토타이핑을위한 연속 설계 빌드 테스트 주기를 가속화했다.
