세포 없는 단백질 발현을 위한 당사의 프로토콜은 단순하고 시간 효율적인 2단계 초음파 처리-원심분리 공정을 사용하여 제조되는 빠르게 성장하는 박테리아 Vibrio natriegens로부터 고활성 원유 추출물을 사용합니다. 원유 세포 추출물 제제 및 세포 없는 단백질 합성은 단일 사용자가 1~2일 이내에 달성하여 이 기술을 생물 생산 또는 합성 생물학 애플리케이션을 위한 파이프라인에 쉽게 통합될 수 있도록 합니다. 하룻밤 사이에 비브리오 나트리겐 문화의 1 밀리리터를 10, 600배 의 벤치탑 원심분리기로 원심분리하여 1분간 씻어주세요.
펠릿을 방해하지 않고 슈퍼나탈을 흡인하고 신선한 LB-V2 미디어의 1밀리리터로 재보선다. 1 밀리리터의 세척된 하룻밤 문화를 오토클레이브 4리터 당황한 에렌마이어 플라스크에 신선한 LB-V2 성장 매체 1리터로 접종하여 1-100개의 희석 배급을 달성합니다. 225 RPM으로 흔들면서 섭씨 30도에서 문화를 성장시다.
분광계를 사용하여 배양 OD 600을 모니터링합니다. 그리고 1.0 플러스 또는 마이너스 0.2에 도달하면 섭씨 4도에서 20 분 동안 3, 500 배 에서 두 개의 500 밀리리터 튜브에서 원심분리하여 문화를 수확한 다음 얼음 위에 놓습니다. 상류체를 흡인하고 펠릿을 즉시 처리합니다.
셀 리시스 시술을 시작하기 전에 신선하게 준비된 S30 용해 버퍼 pH 7.7에서 약 4도까지, 이 차가운 S30 용해 버퍼의 10 밀리리터를 사용하여 동일한 1리터 배양에서 발생하는 모든 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 그리고 서스펜션을 50 밀리리터 튜브로 이송합니다. 이 서스펜션은 섭씨 4도에서 10분 동안 3, 500배 g에서 10분간 이 서스펜션을 한 다음 펠릿을 방해하지 않고 초퍼를 흡인하고 얼음 위에 놓습니다.
차가운 방에서 일하는 것은 얼음 위에 놓인 50 밀리리터 튜브의 펠릿에 차가운 S30 용해 버퍼 500 마이크로리터를 추가합니다. 넓은 보어 파이펫 팁을 사용하여 펠릿을 재일시 중단하고 얼음 위에 있는 2밀리리터 튜브로 조심스럽게 이송하십시오. 매우 활성 원유 추출물을 생산하기 위해서는 세포가 S30 버퍼로 희석되지 않고 효율적인 초음파 처리를 위한 충분한 액체를 가지고 있는지 확인해야 합니다.
600밀리리터 비커를 얼음으로 채우고 얼음 위에 2밀리리터 튜브 홀더를 놓습니다. 세포를 균질화하기 위해 튜브를 잠시 소용돌이시다. 캡 의 하단에있는 모든 세포를 제거하고 캡을 열고 튜브 홀더에 배치합니다.
낮은 초음파 처리기는 튜브의 세포 현탁액으로 팁을 주어 액체 표면 바로 아래에 있습니다. 1/8인치 팁 직경의 초음파 처리기와 프로브를 사용하여 초음파 처리 설정을 준비합니다. 초음파 처리기는 20 킬로 헤르츠 주파수와 50 % 진폭으로 설정합니다.
펄스 온 시간 10초, 펄스 오프 시간 60초. 펄스 초음파 처리 프로토콜을 세 사이클로 실행합니다. 그리고 원심분리기 조세포 추출물은 16, 000배, 섭씨 4도에서 섭씨 30~45분 동안 000배 추출하여 세포 이물질이 없습니다.
초음파 처리가 수행됨에 따라 셀 리시스를 시각적으로 검사하는 것은 초음파 처리가 예상대로 작동하는지 확인하는 데 중요합니다. 차가운 방에서 일알리쿼트 50 새로운 2 밀리 리터 튜브에 결과 슈퍼 나티의 마이크로 리터는 펠릿을 방해하지 않도록. 이러한 원유 세포 추출물을 얼리려면 튜브를 침지 끈이 부착된 튜브 홀더에 넣고 액체 질소가 함유된 데워로 잠기고 얼어 붙었는지 확인합니다.
DNA 템플릿을 사용하여 세포 없는 단백질 발현을 수행하기 위해 실온에서 10X 에너지 솔루션 마스터 믹스, 4X 아미노산 마스터 믹스 알리쿼트 및 DNA 템플릿을 해동한다. 그런 다음 T7 RNA 폴리머라제 및 RNA효소 억제제 스톡을 영하 20도의 냉동고에서 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 일단 DNA 템플릿, 10X 에너지 솔루션 마스터 믹스, 4X 아미노산 마스터 믹스해동, 얼음에 배치.
각 성분을 얼음 위에 2밀리리터 튜브에 정확한 순서로 추가하여 세포 없는 반응 마스터 믹스를 준비하고, 마스터 믹스에 추가된 후 튜브를 부드럽게 쓸어넣습니다. 비브리오 나트리겐스 원유 셀은 영하 80도 냉동고에서 제거하여 해동될 때까지 10~20분 동안 얼음 위에 놓습니다. 해동된 조세포 추출물의 적절한 부피를 세포없는 반응 마스터 믹스에 넣고 파이펫을 사용하여 부드럽게 섞습니다.
써모사이클러를 사용하여 엔드포인트 세포 없는 단백질 발현을 수행하기 위해 먼저 96웰 PCR 플레이트의 하단에 셀 프리 반응 마스터 믹스 10마이크로리터를 추가하여 PCR 플레이트로 의 각 전달 사이에 튜브를 부드럽게 가볍게 쓸어가 마스터 믹스를 혼합합니다. 10초 동안 1, 000배 g의 플레이트원심분리기를 원심분리하여 우물 의 측면에 붙어있을 수 있는 마스터 믹스를 풀링합니다. 그리고 증발을 방지하기 위해 플레이트 접착제로 우물을 밀봉.
플레이트를 섭씨 26도에 설정된 열순환기에 넣고 105도의 가열된 뚜껑을 설치합니다. PCR 플레이트내의 반응을 최소 3시간 동안 배양한 후, 발현 단백질은 정제, 정량화 및 다운스트림 공정에 사용될 수 있다. 투명 유리 바닥이 있는 블랙 384-음 분석 플레이트의 바닥에 세포 없는 반응 마스터 믹스의 웰당 플레이트 판독기 파이펫 10 마이크로리터를 사용하여 세포 없는 단백질 발현 운동학을 모니터링한다.
그리고 증발을 방지하기 위해 투명 플레이트 접착제로 우물을 밀봉. 분석 플레이트를 섭씨 26도에 설정된 플레이트 판독기에 넣고 3~6시간 동안 배양하고 발현 된 단백질에 해당하는 적절한 형광/방출 파장을 모니터링합니다. 이 프로토콜에 기재된 세포 자유 발현 시스템은 플라스미드 DNA 템플릿을 통해 종점 및 운동 분석에 의해 도시된 것과 동일한 양의 선형 DNA보다 훨씬 더 많은 양의 단백질을 산출하여 최상의 결과를 달성한다.
생체 내 전사 반응에 의해 생성된 mRNA는 또한 사용될 수 있었습니다, 그러나 mRNA의 더 높은 양이 요구됩니다. 단백질 생산의 수율은 마그네슘과 칼륨 이온의 농도에 의해 현저하게 영향을 받았다. 최적화된 조건에서 최적의 마그네슘 이온 농도는 3.5 밀리몰러와 칼륨 이온, 80 밀리몰러인 것으로 나타났다.
따라서 이러한 최적의 이온 농도에서 편차는 단백질의 상당한 수율을 생성하기 위해 이 발현 시스템에 대한 용량 감소의 결과를 초래할 수 있다. 모든 시약을 얼음에 보관하거나 가능한 한 차가운 방에서 일하는 것이 중요합니다. 또한 적절하고 완전한 초음파 처리는 이 프로토콜의 성공에 매우 중요합니다.
이 프로토콜에 따라 사용자는 많은 다른 단백질의 활동을 위해 정제하고 화면에 사용할 수있는 높은 처리량 형식으로 단백질을 표현할 수있는 능력을 갖게됩니다. 이 기술은 세포 없는 발현을 위한 독특한 특성을 가진 새로운 유기체의 사용을 보여줍니다. Vibrio natriegens는 기존 모형 유기체에서 이전에 미개척되지 않은 단백질 또는 작은 분자의 발현을 위한 유일한 조건을 제공할 수 있는 할로필 급속하게 성장하는 박테리아입니다.
