이 프로토콜은 섬유아세포가 정의된 기계적 조건하에서 자체 환경을 구축하고 구성할 수 있게 합니다. 이들은 세포의 자연 환경에 필적하는 뻣뻣함과 매트릭스 조성을 가진 이색성 조직을 초래합니다. 이 방법을 사용하면 최대 48개의 조건을 병렬로 비교할 수 있습니다.
사용된 세포 유형 및 배양 조건에 대하여 유연합니다. 잘 정의된 몇 가지 구성 요소만 사용함으로써 실험실 간에 재현할 수 있습니다. 프로 섬유성 인자 또는 항섬유성 약물을 적용함으로써, 이 프로토콜은 어떤 종류의 섬유증 질환의 근본적인 프로세스 및 치료를 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 우리 실험실에서 박사 과정 학생인 알리사 데그레이브(Alisa Degrave)가 될 것입니다. 우선, 유리병이 소량의 얼음만 남을 때까지 약 2분간 섭씨 37도에서 수조에서 저온 보존 된 심장 섬유아아를 해동하십시오. 다음으로, 섬유아세포 성장 배지의 10밀리리터를 함유한 적절한 멸균 원심분리기 튜브로 2밀리리터 세로지학적 파이펫을 사용하여 세포 서스펜션을 드롭방향으로 전달한다.
최적의 세포 검색을 위해 극저온 바이알을 FGM 1밀리리터로 헹구고 원심분리기 튜브로 옮김합니다. 부드럽게 세포를 다시 중단하고 세포 배양 플라스크로 전송합니다. 5 일 동안 또는 세포가 80 %의 합류에 도달 할 때까지 매일 FGM을 보충합니다.
배양 된 세포에서 배지를 심은 후, PBS및 흡량의 6 밀리리터로 세포를 세척한 다음 세포 해리약6 밀리리터를 세포에 추가하고 세포 분리가 보일 때까지 배양합니다. 세포 협회 시약에 있는 빠진 세포에 FGM의 6-12 밀리리터를 추가하여 효소 활동을 중화합니다. 10 밀리리터 세로지컬 파이펫을 사용하여 4~8회 부드럽게 파이펫을 사용하여 단일 셀 서스펜션을 보장하고 세포를 신선한 50 밀리리터 수집 튜브로 이송합니다.
제조업체의 지시에 따라 자동화된 셀 카운터의 도움으로 수율을 확인하고 셀 아래로 펠릿을 사용하십시오. 원심 분리 후, 상류체를 흡인, 펠릿을 빼내고 FGM에서 세포를 다시 중단하는 튜브를 쓸어. 다음으로, 40 마이크로미터 메쉬 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 변형한 다음 자동화된 셀 카운터를 사용하여 전기 전류 배제에 의한 셀 수와 생존가능성을 평가하여 엔지니어링 된 결합 조직 또는 ECT 준비를 진행하기 전에 신뢰할 수있는 세포 수를 보장합니다.
ECT를 준비하려면 FGM을 추가하여 밀리리터당 890만 개의 세포 현탁액을 섭씨 20~25도에서 조절하고 세포를 얼음 위에 유지합니다. ECT 하이드로겔 혼합물의 개별 성분을 함유한 다른 모든 튜브를 얼음에 옮기고 빈 50밀리리터 원심분리기 튜브를 미리 냉각하여 혼합물을 준비한다. 기포 형성을 피하는 사전 냉각된 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 텍스트에 설명된 구성 요소를 추가하여 ECT 하이드로겔 혼합물을 준비하기 시작합니다.
첫째, 산 수용성 콜라겐 타입 I 하이드로겔을 넓은 보어 팁이 있는 서학적 파이펫으로 피펫. DMEM을 추가하여 적절한 혼합을 위해 튜브를 부드럽게 소용돌이시켜 콜라겐 용액의 소금 함량을 조정합니다. pH를 중화하려면 튜브를 소용돌이치면서 0.2 개의 어금니 나트륨 수산화나트륨을 추가하고 페놀 레드 인디케이터의 적색을 관찰하여 중화를 확인합니다.
그런 다음 튜브를 부드럽게 소용돌이치는 동안 셀 서스펜션을 드롭와이즈로 추가합니다. 거품 형성을 피하고 전단 응스트레스를 최소화하기 위해 넓은 보어 팁이 있는 세로지학적 파이펫을 사용하여 한 번만 위아래로 부드럽게 배관하여 서스펜션을 섞습니다. 튜브를 10번 부드럽게 소용돌이어 철저한 혼합을 합니다.
주조 과정 전반에 걸쳐 얼음에 ECT 하이드로겔 혼합물을 함유한 원심분리기 튜브를 보관하십시오. ECT 하이드로겔 혼합물에 1밀리리터 파이펫 팁을 적재한 다음, 콜라겐 매트릭스 조립의 무결성에 영향을 미칠 수 있는 과도한 전단 력을 피하고 전체 플레이트가 15~20분 안에 완료되도록 하는 과도한 전단력을 피하고 48웰 주조 판의 각 금형에 180 마이크로리터의 하이드로겔 혼합물을 고르게 분배한다. ECT 혼합물의 불연속 분포로 금형 내에서 완전한 루프가 형성되어 완전한 ECT 링 형성을 방지할 수 있습니다.
균일하고 기능적인 조직 형성을 위해 균일한 ECT 하이드로겔 주조를 보장하기 위해 파이펫팅 중에 내부 우물로 파이프팅하고 거품을 형성하는 것을 피하십시오. ECT 하이드로겔 혼합물을 15~30분 동안 재구성하기 위해 세포 배양 인큐베이터 내부에 48웰 주조 판을 조심스럽게 배치한다. 잠복 후, 젤과 같은 불투명한 것처럼 보입니다.
바닥에서 ECT 분리를 피하기 위해 벽을 따라 부드럽게 섭씨 37도의 600 마이크로리터를 부드럽게 넣습니다. 분석될 때까지 매일 500마이크로리터의 FGM마이크로리터로 배지를 교체하십시오. 원하는 시점에서 스테레오 현미경을 사용하여 ECT의 상단 및 측면 뷰의 현미경 이미지를 기록합니다.
이미지 처리 프로그램을 사용하여 라인 스캔 분석을 수행합니다. 스케일을 설정하고 직선 도구를 사용하여 각 이미징 평면에서 암당 최소 6개의 위치에서 ECT 직경을 추적하고 측정합니다. 고해상도 흑백 이미지 센서와 거의 UV 광원이 장착된 고정 된 거리에 배치 된 통합 영역 스캔 카메라가있는 레코딩 장치 아래에서 48 웰 주조 플레이트를 이미지합니다.
콘트라스트를 최대화하기 위해 형광염을 함유한 폴 팁의 자동 검출을 수행합니다. 소프트웨어에서 녹화된 이미지를 실행하여 어두운 배경이나 이미지 처리 프로그램에서 고대비 밝은 픽셀을 감지하여 자동화된 분석을 사용하여 일일 레코드의 극 사이의 거리를 측정합니다. 옹극에서 ECT를 제거하고 전송 후크 및 ECT 루프를 삽입합니다.
그런 다음 ECT를 고정된 팔에 고정된 두 개의 후크와 PBS로 채워진 섭씨 37도의 연성 장기 목욕이 장착된 확장동적 기계식 리오미터의 트랜스듀서 암으로 이송합니다. 리오미터를 초당 후크 사이의 초기 거리의 약 1%로 설정하여 일정 선형 속도로 동축 장력을 적용합니다. 초당 0.03밀리미터의 일정한 스트레칭 속도를 일반적인 ECT 치수와 함께 사용할 수 있습니다.
트랜스듀서의 힘을 찢고 스트레칭을 시작합니다. 단면 면적에 의해 측정된 힘을 정상화한 후 ECT 파열 지점까지 기록을 유지하고 다른 생체 역학 적 파라미터를 결정하는 응력 -변형 곡선을 플롯한다. 조직이 미세 골절을 시작하기 직전에 탄성 영역의 상한은 수율 지점에 해당하며 그 균주는 조직 탄성의 척도입니다.
플라스틱 영역은 수율 점과 실패 지점 사이에 있습니다. 실패 점은 조직의 파열로 인한 스트레스의 급격한 하락에 해당하며, 조직 확장성의 척도인 궁극적 인 변형을 정의합니다. 세 번째 측정점은 조직이 스트레치 중에 깨지지 않고 견딜 수 있는 가장 높은 스트레스에 의해 정의된 최대 강도에 해당합니다.
곡선 아래 영역에 의해 주어진 탄력성과 인성은 각각 수율 점 및 실패 지점까지 조직에 의해 흡수되는 에너지에 해당한다. 각 획득 된 곡선에 대해, 탄성 영역의 선형 부분의 경사는 탄성 계수라고도 영의 계수에 해당합니다. 조직의 강성을 측정하는 기계적 특성입니다.
이 프로토콜을 사용하여 제어 조건하에서 ECT 다짐 및 수축이 있었고 FCS의 존재는 주조 후 몇 시간 후에 계속되었으며 특히 5 일째까지 증가했습니다. ECT가 액틴 중합 억제제 라트룬쿨린 A로 처리되었을 때, ECT 다짐은 대조군에 비해 상당히 높은 단면 영역에 의해 표시된 바와 같이 감소되었다. 조직의 수축은 문화의 5 일 동안 평가되었다.
라트룬큘린 A가 없을 경우, 수축은 5일째까지 점차 증가하여 약 40%의 수축률을 기록했다. 그러나, Latrunculin A 존재는 단지 대략 20%의 최대 수축의 결과로 조직 수축에 영향을 미쳤습니다. 액틴 중합 억제는 대조군에 대한 조직 강성에 약 50%의 현저한 감소를 주도하였다.
이러한 결과는 액틴 세포골격무결성이 ECT 다짐, 수축 및 경직에 필수적이라는 것을 보여줍니다. 신뢰할 수 있는 고품질 콜라겐 솔루션을 선택하고 생존가능성이 높은 단일 셀 서스펜션을 사용하여 엔지니어링 된 결합 조직을 재구성하는 것이 중요합니다.
