이 프로토콜은 합성 시설에서 받은 작은 유전자 단편으로부터 세포 없는 반응에 사용하기 위해 대량의 DNA 템플릿을 신속하게 생성하는 방법을 자세히 설명하기 때문에 중요합니다. 롤링 서클 증폭은 전통적인 복제보다 많은 양의 DNA를 빠르게 생성할 수 있습니다. 따라서 합성 DNA 라이브러리에서 더 높은 처리량 설계 빌드 테스트 학습 주기를 지원합니다.
이러한 기술은 필요한 많은 단계와 적은 볼륨으로 인해 새 사용자에게 큰 고유의 가변성을 가질 수 있습니다. 주의 깊게주의를 기울여야하며 연습은 완벽합니다. 시작하려면 단일 PCR 튜브에 PCR 키트의 모든 구성 요소를 추가합니다.
그런 다음 다시 중단된 유전자 단편의 마이크로리터 1개를 추가합니다. 5~10초 동안 중간 설정에서 소용돌이를 통해 혼합물을 부드럽게 균질화합니다. 키트 제조업체의 프로토콜에 따라 써모사이클러를 프로그래밍한 후 PCR을 실행합니다.
PCR이 완료되면 PCR 정리 키트를 사용하여 반응 혼합물에서 DNA를 정화합니다. 1.5 밀리리터 튜브에서 DNA 결합 버퍼와 PCR 샘플을 5 대 1 비율로 추가합니다. 이 혼합물을 스핀 컬럼과 원심분리기로 1분 동안 16, 000회 G로 옮긴다.
흐름을 폐기합니다. DNA 세척 버퍼 200마이크로리터를 컬럼에 넣고 실온에서 1분간 배양합니다. 열을 다시 원심분리하고 흐름 통과를 삭제합니다.
입증 된 바와 같이 DNA 세척 버퍼로 컬럼을 다시 한 번 씻으시다. 두 번째 세척에서 흐름 스루를 제거한 후 열을 원심분리하여 남은 버퍼를 1~2분 간 추가로 제거합니다. DNA를 엘로우기 위하여는, 새로운 1.5 밀리리터 관으로 컬럼을 전송합니다.
그런 다음 46 마이크로리터의 이중 증류수를 열에 넣습니다. 1 분 잠복 후 원심 분리에 의해 튜브로 DNA를 수집합니다. 및 분광계를 사용하여 정제된 DNA를 정량화한다.
DNA를 소화하고 순환하기 위해 필요한 반응 완충제 5개 소리터, HindIII 제한 효소 20단위, 정제된 DNA 45마이크로리터를 PCR 튜브에 결합한다. 파이펫을 사용하여 이 혼합물을 부드럽게 균질화합니다. 그런 다음 온도 37도에서 15 분 동안 열순환기에서 배양하십시오.
인큐베이션이 완료되면, 열은 섭씨 80도에서 20분 동안 배양하여 힌드III 효소를 비활성화합니다. 그런 다음 새로 소화된 DNA에 T4 Ligase 버퍼 5개와 T4 리구아제 800유닛을 추가합니다. 파이펫과 부드럽게 혼합한 후, 혼합물을 섭씨 25도에서 1시간 동안 배양하여 순환 반응을 수행합니다.
반응이 완료되면 이전에 설명한 대로 PCR 정리 키트를 사용하여 DNA를 정화합니다. 그런 다음 DNA를 정량화합니다. 롤링 서클 증폭을 수행하려면, 단일 튜브에 정제 된 원형 식 템플릿의 모든 반응 구성 요소와 하나의 마이크로 리터를 결합합니다.
혼합물을 파이펫과 알리쿼트 10 마이크로리터로 균질화하여 혼합물을 4개의 개별 튜브로 균일화합니다. 튜브를 섭씨 30도에서 4~18시간 동안 배양한 다음, 10분 동안 섭씨 65도에서 배양하여 효소를 비활성화합니다. 열 불활성화 후, 5 분 동안 섭씨 12도에서 배양하여 튜브의 바닥에 응축을 장려.
다음으로 각 튜브에 15마이크로리터의 이중 증류수를 추가하여 생성된 용액을 희석시 희석합니다. 이전에 입증된 바와 같이 DNA를 정화하고 정량화하기 전에 각 튜브의 내용을 결합합니다. 세포 없는 반응을 수행하기 위해 필요한 다양한 성분을 튜브에 넣고 이중 증류수로 최종 원하는 부피에 희석합니다.
용액의 절반을 10~20회 위아래로 파이프로 완전히 섞는다. 15 마이크로리터 알리쿼트에서 반응 혼합물을 마이크로티터 플레이트내의 원하는 우물로 옮기. 그런 다음 무색 밀봉 필름으로 접시를 밀봉하여 습도를 유지하고 증발을 방지합니다.
밀봉된 플레이트를 플레이트 판독기에 놓고 반응이 완료되도록 합니다. 세포없는 시스템을 사용하여 서브틸리신 BPN 유전자를 표현하는 경우, 이중 증류수의 94 마이크로리터와 10 마이크로 몰라 PNA의 1 마이크로 리터를 평평한 바닥, 무색 96 웰 플레이트에 표현한다. 그런 다음 완성된 세포 없는 반응의 5마이크로리터를 추가하고 섭씨 25도의 온도를 유지하면서 10분 동안 20초마다 410나노미터에서 흡광도를 측정하도록 설정된 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 읽는다.
15 마이크로리터 반응에서 불정제 RCA DNA의 3 마이크로리터를 사용하는 BL21 DE3 스타 추출물에서 슈퍼폴더 GFP의 발현은 PJL1 플라스미드의 것과 비슷하다. 템플릿의 양을 두 배로 늘리고 세 배로 늘리면 명백한 이점을 제공하지 않는 것으로 보이며, 이는 반응당 3 마이크로리터에서 이미 포화 된 템플릿 수준을 시사합니다. 반대로, 셔플 스트레인 셀 추출물을 사용할 때 RCA 템플릿의 양을 증가시켜 이점이 있는 것으로 보인다.
온도가 낮거나 접는 시간이 길어야 하는 단백질은 전체 워크플로우를 완료하는 데 필요한 시간에 영향을 미칩니다. 예를 들어, 4시간 동안 의식으로 서브틸리신을 아소서 말하는 것은 서브틸리신 성숙에 충분하지 않기 때문에 실패한 결과로 이어집니다. 그러나, 반응을 계속 할 수 있도록 16 시간 서브 틸리신의 검출 가능한 수준으로 이어질.
이 프로토콜이 최대 효율로 작동하려면 모든 구성 요소를 잘 혼합해야 합니다. 이러한 방법에 따라, 단백질 후보의 큰 라이브러리는 합성적으로 생성한 다음 특성화에 대한 충분한 수율로 발현될 수 있다. 이 방법은 우리 그룹이 세포 추출물에서 작동 할 수있는 N C 두 센서를 개발할 수있는 길을 열어 주어 프로토 타입 단백질을 신속하게 특성화 할 수 있었습니다.
이를 통해 새로운 바이오 촉매 및 치료법의 단백질 설계를 보다 신속하고 지능적으로 반복할 수 있습니다.
