이 작품은 숲 Rohwer에게 수여 국립 보건 연구소 (1 R01 GM095384-01)에 의해 지원되었다. 우리는 리보 제로 역학 키트 조기 액세스를 제공하기위한 Epicentre, Illumina의 회사를 감사합니다. 우리는 초 원심 튜브 홀더의 설계 및 생산에 대한 마크 하타 감사합니다. 우리는 촬영 과정을 지원을위한 중요한 판독하고 원고의 토론 안드레아스 하스와 베냐민 놀즈 감사, 로렌 폴.

The authors have nothing to disclose.

바이러스 성 메타 지노믹스 바이러스 입자는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 석출이나 소량 농축기를 이용하여 농축된다. 일부의 경우, 농도는 필요하지 않을 수도 있지만, 미리 여과 또는 저속 원심 분리 단계가 진핵 미생물 세포를 제거하는데 사용된다. 바이러스 성 용 해물을 더욱 풍부하고 밀도 구배 초 원심 9,41 또는 작은 크기의 필터 (예를 들면 0.45 μm의)가 진핵 미생물 및 대형 셀 (25)을 제거하기 위해.하여 정제 될 밀도 구배 초 원심 분리는 일반적으로 바이러스 성 입자 (41)를 집중 수크로오스 또는 세슘 클로라이드와 같은 조밀하지만 불활성 해법 행한다. 물리적 분리는 바이러스 입자 크기와 밀도의 부력에 기초한다. 따라서, 필터의 기공 크기를 적절히 선택과 구배 엄격한 제제의 물리적 회복 성공으로, 특정 바이러스 커뮤니티를 분리하는 데 필수적인VLP를 41 (추출 밀도 내에서 필터 또는 가을에 통과하지 않는 즉, 바이러스 입자 metagenome에서 검출되지 않습니다)을 고립 지역 사회를 결정합니다. 바이러스의 분리 및 농축 후에, 무료 핵산 미생물 및 진핵 세포의 형태 모두 샘플 비 바이러스 게놈 물질 본 오염이있을 수있다. 따라서 시료에서 바이러스 입자의 순도 (도 1a 및도 1b)을 확인하는 것이 중요하다. 클로로포름 처리는 일반적으로 종래의 핵산 추출법 자유 핵산을 저하 클레아 처리하여 잔여 세포를 용해하기 위해 사용된다. 제시된 워크 플로우에 대한주의는 웹 기반 협동 학습 그라데이션를 입력 너무 낙관적 일 수있다 포락선 바이러스 입자를 제외 할 수 있으므로 바이러스 입자를 분리하는 밀도 기울기 분리를 사용했다. 대안은 &quot;포괄&quot;방법은 밀도 구배 separ를 생략하는 것입니다ATION는 0.45 μm의에서 지역 사회 DNA 분리 및 - 클로로포름의 DNase I.이 방법으로 처리 여과 액을 같은 면봉 또는 혈장에서 그와 같은 작은 샘플 볼륨을 수용하는 것이 적절하다. 그러나,이 클로로포름 내성 세균 오염과의 DNase I-내성 세포 DNA의 양이 더 발생할 수 있습니다. 높은 DNA 수율은 시퀀싱 옵션의 폭 넓은 선택을 제공함으로써 현재 시퀀싱 프로토콜은 1 NG 시퀀싱 라이브러리 준비를위한 핵산의 μg의 1이 필요합니다. 생성 viromes의 DNA 농도는 종종 200 이상 NG / μL로 검출 한계 이하의 범위. 회수 된 바이러스 핵산의 양은 직접 염기 서열 라이브러리 제조에 불충분 할 수있다. 이러한 경우, 핵산 증폭은 필수적이다. 링커 증폭 산탄 라이브러리 (LASLs) 2,42,43 복수 변위 증폭 (MDA)에 기초하여 전체 게놈 증폭 두 아르방법은 가장 일반적으로 충분한 DNA 시퀀싱을 생성하기 위해 사용될. 이러한 Phi29 DNA 폴리머 라제에 기초한 것과 MDA 방법은 증폭 바이어스 겪을 공지되어 있으며, 비 정량적 우선적 분류 학적 및 기능적 특성화 44,45 결과, ssDNA를 원형 DNA를 증폭 할 수있다. LASLs 접근법의 최적화 된 버전은 최소한의 바이어스를 소개 도시 (출발 물질이 소량에 대해) 더 높은 민감도를 촉진하고, 용이하게 다른 시퀀싱 플랫폼 (43)하도록되어있다. 그러나, 방법은 많은 단계가 DNA 손상을 최소화하기 위해 특수 장비를 필요로하고, dsDNA 템플릿에 한한다. 우리 연구실에서는이 방법이 성공적으로 기관지 lavage-, coral-과 바다 물에서 파생 된 VLP를 (미 출판과 Hurwitz의 등. 46)에서 추출 된 DNA의 검출 및 탐지 양을 증폭하도록하고있다. 데이터 분석 파이프 라인을 개발하는 것은 CLA를 가지고ssically 인해 바이러스 성 지역 사회의 매우 다양하고 대부분 알 수없는 특성으로 바이러스 메타 지노믹스 분석의 가장 어려운 문제 중 하나가되었습니다. 날짜 현재 바이러스 데이터베이스에 생물권에 약 10 8 바이러스 유전자형이가 있지만,이 대략 전체 바이러스 성 다양성의 약 1 / 100,000입니다 ~ 4000 바이러스 게놈가 포함되어 있습니다. 따라서, 바이러스 성 metagenomes의 분류 및 기능 할당 (예 : BLAST 47) 유사성 기반 검색은 고유의 과제를 가지고있다. 많은 서열은 게놈 데이터베이스의 상당한 유사성을 실패하고, 그러므로, 미지로 분류된다. 상동 기반 검색이 분류법을 할당을위한 가장 중요한 애플리케이션은 데이터 시퀀스를 작동하더라도, 데이터베이스 분석에 근거하여 독립적 인 대안 적 방법은 48 (50)이 개발되었다. Fancello 등. (51)은 비라에 사용되는 계산 도구와 알고리즘의 전체 리뷰를 제공리터의 메타 지노믹스. 미생물 메타 지노믹스 일반적으로, 저장성 용해 처리 된 미생물 군집 (HL-DNA)에서 추출 된 DNA의 총량은 20 ng의 5 μg의 범위. 수율은 환자의 건강 상태 및 본 연구 (표 2)에 추출 된 HL-DNA의 총 수율에 변화를 보이는 설명 수집 객담 시료의 양에 크게 의존한다. 중요한 단계는. 양질 시퀀스 데이터 생성 순서 라이브러리의 질에 의존 생성 2 효소 기반 DNA 단편화 절차를 이용하여 CF 객담 유래의 미생물 DNA로부터 생성 순서 라이브러리의 전형적인 크기 범위를 도시도. 최적 라이브러리 크기는 시퀀싱 플랫폼 및 애플리케이션의 선택에 의존하며, 따라서, 필요한 경우, 단편화와 같은 절차를 초음파 분무 같은 대체 방법을 통해 최적화 될 수있다. 이외에도제시된 대표적인 결과는, 여러 시점에 걸쳐 다수의 환자에서 수집 CF 객담에 제시된 방법의 성공은 또한 (2012) 9. 임 등의 알에서 설명하고 임 외. (2014) 10. 이전의 연구 9,10 모든 환자가 변동으로 인해 이러한 항생제 치료 등의 섭동 가능성시키면서 지역 사회 내 주요 선수의 지속성을 반영, 시간이 지남에 따라 이동 미생물 군집의 고유 한을 품고있는 것이 좋습니다. 이러한 변동도 외부 교란하지 않거나 인해 샘플링 절차 및 샘플 처리에 매일 발생 여부, 질문에 아직도있다. HL-DNA의 metagenomic 및 16S rDNA의 증폭 물 분석에 기초하여, 7 일 종 샘플링 보여준다 항생제 섭동없이 미생물 프로필 일일 변동 (주 1, 2, 3) 하였다 최소 (도 3a 및도 3b). 소개시항생제 시프로플록사신은 P.으로 알려진 세균성 병원균의 광범위한 스펙트럼을 대상으로하는 동안 경구 용 항생제의 duction 즉시 3 일 샘플링 한 후, 지역 사회 프로파일의 변화는 일 4. 명백하게되었다 녹농균, 황색 포도상 구균, 폐렴 구균 및은 치료 P.의 상대적인 농축 증가 녹농균은 연쇄상 구균 종을 감소한다. 및 P. melaninogenica. 6 일함으로써, 지역 사회 천천히 초기 시작 사회 구조에 회복되었다. 결과는 한 명의 환자 내에서 미생물 프로파일의 변동으로 인해기도에 지역 사회의 동요에 더 많은 가능성이 있음을 시사한다. HL-유도 된 DNA로부터 16S rDNA의 라이브러리와 metagenomes의 미생물 프로파일 사이의 일관성을 감안할 때, 우리는이 연구에서 사용 된 16S rRNA 유전자 프라이머에서 발생하는 편견을 배제. 16S rDNA 염기 분류에 걸쳐 본의 차이점에 대한 한 가지 가능한 설명총 DNA 및 HL-유래 DNA (그림 3B)에서 생성 된 알 프로파일은 슈도모나스 종 다량의 존재 일 수있다. 항생제 치료 후 세포 DNA. 이것은 이러한 차이는 7 일에서 가장 명백한 있다고 연구 결과에 의해 지원됩니다, 삼일 슈도모나스 종을 대상으로 항생제 치료 후. 다른 이외에. 시프로플록사신 일반적 만성 P. CF 환자에서 제 치료제로서 사용 활동의 스펙트럼이 가장 CF-관련된 병원체를 포함하더라도 녹농균 감염. 우리는 항생제 치료가 연쇄상 구균 종을 포함하여 취약 지역 사회를 근절한다는 가설을 세웠다. 따라서 내성 P.에 의해 채워 틈새를 만들어 녹농균. 녹농균은 생물막 지역 사회를 증가를 통해 저항을 얻을 수 있으며, 세포 외 DNA는 생물막 구조 (52)의 주요 구조 지원 될 것으로 나타났다. 심지어 t으로그는 사회 구조는 세포 외 DNA는 CF 객담에 남아있을 수있다, 회복되었다. 따라서 이러한 데이터는 저장성 용해 잠재적으로 만 인간 유래 DNA를 제거하지에 도움이 워크 플로에 제시된 세척 단계뿐만 아니라, 미생물 유래의 세포 외 DNA는 실제 미생물 프로파일을 잘못 수 있음을 시사한다. Metatranscriptomics 고품질 metatranscriptome는 상대적으로 적은 리보솜 RNA (rRNA의) 시퀀스를 포함하고 지역 사회 성적 증명서 (의 mRNA)의 편견 샘플링을 대표한다. 인해 mRNA를 짧은 반감기 및 제한된 양으로, 이는 프로토콜이 여기에 제시된 바와 같이, 회수 된 전 사체의 수를 최대화하기 위해 시료 처리를 최소화하는 것이 중요하다. 최근, rRNA의 고갈을위한 여러 접근법이 개발되어 시판 키트에 장치. 이들은 MICROB 풍부하게, 리보 제로 및 샘플 별 감산 시간을 포함ybridizations 올리고 뉴클레오티드 하이브리드 화, 및 5 &#39;모노 포스페이트를 함유하는 엑소 뉴 클레아 제 효소 활성 표적 RNA에 기초-ONLY mRNA의 키트에 기초 53아르. 또한, 이러한 우선적으로 선형 RNA를 polyadenylates 및 증폭 MessageAmp II-박테리아 키트와 같은 mRNA의 부화에 대한 몇 가지 접근 방식도 사용할 수 있습니다. 이러한 방법 (예를 들면, mRNA의 전용 MICROB E의 XPRESS 및 MessageAmp)의 일부는 최적의 효율을 동시에 사용된다. 그러나 이러한 접근 방법 모두의 효능은, 부분적으로 저하 rRNA의 작업을 자주 CF 샘플에서 추출 된 총 RNA에서 관찰 특히, 제한된다. 폴리아 데 닐화 - 의존성 RNA 증폭 원핵 및 진핵 세포 모두에의 mRNA 이루어진 metatranscriptomes을 생성하기 위해 사용될 수 없다. 또한, 폴리 (A) 꼬리에 유용 시퀀스 데이터의 양을 줄일 수있는 서열에 첨가 하였다. 단독 뻗어와 지역의 품질이 저하 점수를하는 경향이, C상당수를 ausing 것은 폴리을 트리밍 한 후 시퀀싱 및 후 시퀀싱 소프트웨어, 평균 판독 유용한 길이에 의해 여과 될 판독한다 (A) 꼬리 (54)가 크게 감소 될 것이다. 복잡한 CF 미생물 지역 사회와 부분적으로 저하 RNA (도 4A 및 4C) 다루기, 우리의 이전 연구는 리보 제로 골드 키트에 의한 하이브리드 캡처 방법을 사용하여 결합 치료에 비해 인간과 미생물 rRNA를 모두 제거에 더 효과적인 것으로 나타났다 다른 키트 9 (표 3). 결과 데이터는 인간 숙주와 미생물 성적 증명서 모두를 동시에 분석 할 수 있습니다. 수율 및 RNA의 질뿐만 아니라 시퀀싱 플랫폼의 최종 선택에 따라 cDNA를 합성하는 단계를 포함하여 이들 공정 중 많은 시퀀싱 라이브러리 생성하여 간소화 될 수있다. 예를 들어, 리보 제로 처리 된 RNA는 metatranscriptome 시퀀싱 천칭을 만들기 위해 사용될 수있다RIES ScriptSeq RNA-SEQ 도서관 준비 키트를 사용하여. 동물 관련 커뮤니티의 Metagenomic 분석은 호스트와 관련된 지역 사회를 포함하는 전체 기능 엔티티의 포괄적 인 표현을 제공합니다. 여기에 제시된 플로 특히, 원하는 바이러스 및 미생물에 더하여 두꺼운 점액 세포 파편, 세포 DNA, 단백질 및 당 단백질 복합체의 높은 양뿐만 아니라, 숙주 세포를 포함하는 것과 복잡한 동물 연관된 다양한 시료에 적용 할 수있다 입자. 미생물 및 바이러스 성 입자는 모든 단계에서 손실 될 수있다하더라도, 분리 및 정제가 숙주 DNA의 양을 최소화하는 것이 필수적이다 입자. 메타 지노믹스 데이터가 조사 된 지역 사회의 대사 잠재력을 제공하지만, 인코딩 기능 9의 발현 차이를 공개하여이를 보완 metatranscriptomics. 유전체 및 전 사체 데이터의 포괄적 인 평가는 새로운 기능을 나왔고지역 사회 상호 작용의 역학에 ights 및 개선 치료 9,10,55의 개발을 용이하게한다.

<html> 인체와 관련된 바이러스 및 미생물 군집은 1,2- 시퀀싱 기술의 적용을 통해 지난 10 년간 광범위하게 연구되었다. 결과는 인간의 건강과 질병의 중요성 미생물의 인식으로 이어졌다. 주요 사업은 인간의 피부에있는 세균을 설명하는 인간 마이크로 바이 옴 프로젝트 (일부 고세균)에서 온, 구강 충치,기도, 비뇨 기관, 위장관 3 내. 기관지 폐포 세척액 (BAL) 4,5 인두 면봉 4을 통해 건강한 사람의기도의 또 마이크로 바이 옴의 연구는 폐 환경 샘플링 장치,기도에 과도 미생물 식민지의 결과로 역할을 할 수 있음을 보여 주었다. 그러나, 장애인기도 표면의 미생물 식민지의 영향은 낭포 성 섬유증 (CF) 환자에서 본 것과 같은 심각한 만성 폐 감염으로 이어질 수 있습니다. t는 &quot;&gt; CF는 낭포 성 섬유증 막 횡단 레귤레이터 (CFTR)의 돌연변이 유전자 (6)에 의한 치명적인 유전 질환이다. 이러한 돌연변이가 차례로 상피 세포의 꼭대기의 표면을 가로 질러 transepithelial 이온 수송에 영향을 미치는 결함이있는 CFTR 단백질에 상승을 제공합니다.이 질환에 영향을 미칩니다 여러 기관 시스템,하지만 사망률과 이환율의 대부분은 CF 폐 질환 (7) 때문이다. CF 폐 미생물 식민지의 고유 한 생태계를 제공한다. 이온 수송에 결함이 호기성으로 구성된 미세 환경을 생성, CF기도에 구축하는 점액의 원인 정적 영양이 풍부한 점막 표면에 의해 고정 호기성 및 혐기성 구획.이 환경은 바이러스, 박테리아, 곰팡이를 포함한 식민지 미생물의 증식을 촉진한다. 급성 및 만성 폐 미생물 감염의 결과로 일정하지만 효과가 면역 반응으로 이어질 광범위한기도 개형, 폐 용량 감소, 궁극적 pulmo어림 실패. CF 폐와 관련된 세균 지역 사회는 물론 16S 리보솜 RNA (rRNA 유전자) 유전자 염기 서열 8 산탄 총 메타 지노믹스 (9, 10)를 사용하여 포함 모두 문화에 의존하는 문화 독립적 인 접근 방식을 사용하여 설명 하였다. 16S rRNA의 중심 접근법은 미생물 종의 다양한 특징 및 커뮤니티 다양성 넓은 변화를 포착 할 수있다. 그러나, 지역 사회를 정의의 해상도로 제한된다. (Claesson 등 2010 년 11 요약) 및 신진 대사에 영향을 미치는 잠재력의 예측은 확인 된 분류군에 대한 공지 된 일반적인 기능으로 제한됩니다. 따라서, 16​​S rRNA의 유전자 시퀀싱 방법은 CF 폐에 존재하는 다양한 미생물 지역 사회의 필요 분류 학적 및 기능적 분석의 정확성에 대한 불충분하다. 여기에 설명 metagenomic 접근은 그 한계를 극복, 16S rRNA 유전자 기반 접근법을 보완하고, 상대적으로 효율적인 방법을 가능하게미생물 군집의 분류 및 CF 폐 유전 적 내용을 모두 분석합니다. 동물 샘플들로부터 격리 관련된 미생물 DNA는 종종 숙주 DNA를 다량 포함. 14 - CF 객담 또는 폐 조직 샘플은 일반적으로 면역 반응에 의해 방출 인간 호중구 DNA 다량의 DNA (12)의 총 종종 99 % 초과를 함유한다. 일부 본래 인간 세포가 존재하더라도,이 DNA 용액의 대부분은 무료 또는 미생물의 표면에 흡착된다. 또한, 매우 점성 점액 플러그, 세포 잔해 및 다른 오염 물질이 미지의 존재는 상기 균체 분리 복잡. 여러 가지 방법을 선택적으로 인간의 DNA (16), 및 MolYsis 키트, 제한적인 성공에 모든 저하 에티 디움 브로마이드 모노 아자 미생물 균체 (15)에서 분리 된 인간의 DNase I 치료에 퍼콜 그라디언트를 포함하여 인간 DNA의 이러한 샘플을 파괴 시험 하였다.<html> CF 객담에 가장 효과적인 미생물 DNA 정제 과정을 최신 것은 Breitenstein 등에 의해 기술 된 방법의 변형이었다. (1995) 17. 본원 저장성 용해 (HL)로 알려진 방법이 방법은, 점액 이황화 결합, 진핵 세포의 저장성 용해하고, 수용성 DNA의 DNase I (9)의 처리를 줄이기 위해 β 머 캅토 에탄올의 조합을 사용한다. 대안의 부족에도 불구하고 HL 방법으로 인해 (I)에 대한 몇 가지 우려 원치 않는 미생물의 분해 및 화상으로 인한 가능한 편견을 제기 (II) 지역 사회 조성 (9, 10)의 관찰 변동이 샘플 가공과 관련이 변화의 이슈인지. 샷건 metagenomes의 생성 외에, 우리는 전체 DNA 및 연속 7 일에 걸쳐 단일 환자로부터 수집 객담 샘플들의 동일한 세트를 사용하여 HL 방법에서 추출 미생물 DNA의 16S rRNA 유전자 프로파일을 비교함으로써, 이러한 문제를 해결한다. 미생물 군집에 비해 ENT는 &quot;&gt;, 동물과 관련된 바이러스 성 지역 사회의 특성은 제한 (18, 19)이다 CF기도의 바이러스 성 사회는 최소한 20 특성화되었다 -.. 22 CF기도의 바이러스 성 지역 사회의 DNA를 특징 짓는 첫 번째 metagenomic 연구 CF 폐와 관련된 대부분의 바이러스는 파지 20 있음을 보여 주었다. CF와 비 CF 개인의 파지의 대사 가능성이 크게 달랐다. 특히, CF 개인의 파지 사회가 CF기도의 생리에 박테리아 숙주 적응의 반사 유전자를 실시, 및 CF 폐 조직에서 바이러스의 세균 독성 (20). 이후 metagenomic 연구는 해부학 적 영역 (22) 사이의 바이러스 성 지역 사회의 고유 한 공간 이질성을 보여 주었다. 또한, CF 폐 조직은 어떤 생태계 22 일에 관찰 된 가장 낮은 바이러스 성 다양성을 숨겨. 확인 된 대부분의 바이러스는 파지했다가능성 CF 병원균에 감염. 그러나, 헤르페스 바이러스, 아데노 바이러스, 인간 유두종 바이러스 (HPV)와 같은 진핵 세포 바이러스도 검출되었다. 폐 조직에 낭종 해부 동안 관찰 한 경우에서는, 인간 유두종 바이러스 게놈의 99 % 이상이 환자는 폐 암 또는 유두종으로 진단되지 않았다하더라도, 회수 하였다. 이것은 바이러스 다이버 시티는 본 조직 손상의 정도를 반영 할뿐만 아니라 노출 및 하부지지 않은 질환을 설명 할 수있을뿐만 아니라 것을 나타낸다. 여기에 설명 된 프로토콜은 두꺼운 점액, 호스트와 균체, 자유 DNA뿐만 아니라 세포 파편 다량으로 구성 샘플로부터 바이러스 - 유사 입자 (VLP를)를 분리하기 간단하지만 강력한 방법을 제공한다. 메타 지노믹스 보완, metatranscriptomics는 미생물 지역 사회와 호스트 9,23에서 유전자 발현의 역학을 모니터링하는 데 사용됩니다. 이 경우, 모두 미생물 및 호t mRNA를 우선적으로 선택해야합니다. 세균의 mRNA가 폴리아 데 닐화되지 않기 때문에, 올리고 dT를 기반 mRNA의 풀다운 방법으로 악용 할 수 없습니다. 샘플 진핵 mRNA를 다량 함유하는 것으로 알려진 경우, 폴리아 데 닐화 - 의존성 RNA 증폭 호스트 관련된 샘플에서 사용될 수 없다. CF 객담 포함한 많은 동물 연관된 샘플은, RNases 포함 높은 세포 파편의 양 및 클레아 외에도 세포의 높은 농도를 포함한다. 따라서, 또 다른 도전 과제는 metatranscriptome 처리 중에 광범위한 RNA 분해를 방지하는 것이다. 대부분의 경우에, CF 객담에서 추출한 총 RNA는 RNA 유래의 하류 어플리케이션 및 유틸리티를 제한 부분적으로 저하된다. 최근, rRNA의 고갈을위한 여러 접근법이 개발되어 시판 키트에 장치. 이러한 방법의 효능은 그러나 특히 부분적으로 저하 rRNA의 9,24 작업을 할 때, 제한된다. 여기에 사용 된 방법은 허용효율적인 하류 총 rRNA의 제거에 적합 부분적으로 성능이 저하 된 총 RNA의 검색을 위해 에디션. 두 개의 서로 다른 키트를 비교 부분적으로 성능이 저하 된 총 RNA에서 rRNA 유전자 제거의 효율을 직접 비교는 임 등의 알에 의해 설명되었다. (2012) 9. 전반적으로,이 원고의 목적은 예를 들어 객담 샘플을 사용하여, 하나의 동물 연관된 샘플로부터의 프로토콜 세트 바이러스 및 미생물 샷건 metagenomes를 생성한다 (도 1), 및 metatranscriptome를 제공하는 것이다. 분자 실험실 워크 플로는 교차 오염을 최소화하기 위해 별도의 사전 및 사후 증폭 영역을 포함해야한다. 방법은 조직 (22), 인두 및 구강 인두 면봉 (25), 기관지 폐포 세척액 (BAL)와 산호 (게시되지 않은 데이터)와 같은 다른 종류의 시료에 쉽게 적응할 수 있습니다. 각 샘플 수령시 즉시 처리, 특히 미생물 메타 지노믹스와 만족하여야한다atranscriptomics 연구가 요구된다. 샘플을 동결하면 잠재적 셀 무결성을 방해로 동결 metagenomes 속담 미생물 균체의 분리를 제한한다. 그러나, 동결 metatranscriptomics과 바이러스 분리되지만, 동결 - 해동 과정을 통해 영향을받을 수있는 회수 된 바이러스 입자의 RNA의 질과 양을 배제하지 않는다. 그것은 그 객담이 BAL이 너무 침입 할 수있는 성인 CF 환자와 만성 폐 질환 (26, 27)과 관련된 많은 연구에서 샘플의 기본 소스 역임했다 주목하는 것이 중요하다. 우리의 연구에서, 객담 샘플을 구강 및 최소 객담 내 구강 미생물 오염을 유지하는 멸균 생리 식염수를 사용하여 구강 헹굼 다음 신중하고 일관된 샘플링 방법, 즉, 함께 수집 하였다.

<table><tbody><tr><td>Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td>TRIzol LS Reagent was used in this study</td></tr><tr><td>Silica beads; 0.1 to 0.15 mm</td><td>Cole-Parmer</td><td>YO-36270-62</td><td>Zirconia-silicate beads were used in this study</td></tr><tr><td>Dithiothreitol, molecular grade (dry powder)</td><td>Promega</td><td>V3155</td><td>Can be purchased from any other company</td></tr><tr><td>Sterile syringe filter; 0.45 &amp;micro;m pore size hydrophilic PVDF membrane</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>DNase I enzyme&amp;nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>Sterile syringe filter; 0.02 &amp;micro;m pore size</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-13</td><td>Diameter: 25 mm</td></tr><tr><td>Ultra-clear centrifuge tubes</td><td>Beckman</td><td>344059</td><td>9/16 x 3 &amp;frac12; in. (14 x 90 mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation</td></tr><tr><td>SW41 Ti Rotor</td><td>Beckman</td><td>333790</td><td></td></tr><tr><td>SS-34 fixed angle rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 DNA polymerase</td><td>Monserate Biotech</td><td>4001</td><td>10 U/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>Phi29 Random Hexamer</td><td>Thermo Scientific</td><td>S0181</td><td>Previously bought from Fidelity Systems</td></tr><tr><td>Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 &amp;micro;m pore size</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-34</td><td>Whatman Anodisc filter membranes were used in this study; diameter 25 mm</td></tr><tr><td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td><td>Life Technologies</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free DNase I&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td>Can be purchased from any other company</td></tr><tr><td>Glycogen, RNA grade</td><td>FisherScientific</td><td>FERR0551</td><td>Can be purchased from any other company</td></tr><tr><td>Oak Ridge high-speed centrifuge tubes</td><td>FisherScientific</td><td>05-562-16B</td><td>For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor</td></tr><tr><td>Total rRNA removal kit</td><td>Epicentre</td><td>MRZE724</td><td>ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation</td></tr><tr><td>Cesium chloride&amp;nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>BP1595-500</td><td></td></tr><tr><td>Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5882-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

purifying the impure: sequencing metagenomes and metatranscriptomes from complex animal-associated samples

높은 처리량 시퀀싱의 접근성은 생물학의 여러 분야를 혁명을 일으켰다. 더 나은 호스트 관련 바이러스와 미생물 군집을 이해하기 위해서는, DNA와 RNA 추출을위한 포괄적 인 워크 플로우를 개발 하였다. 플로 동시에 차세대 시퀀싱 단일 샘플로부터 바이러스 및 미생물 metagenomes뿐만 아니라 metatranscriptomes를 생성한다. 이러한 방식의 커플 링은 분류 학적 특성과 사회 인코딩 기능 모두의 개요를 제공합니다. 그것은 매우 점성과 점액의 높은 양, 무료 호중구 DNA 및 기타 알 수없는 오염 물질을 포함하고 있기 때문에 제시된 방법은, 낭포 성 섬유증 (CF) 가래, 문제 샘플 유형을 사용합니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 이러한 문제를 대상으로 성공적 최소 인간 DNA의 오염 미생물 및 바이러스 성 DNA를 회수. 메타 지노믹스 연구를 보완하기 위해, metatranscriptomics 프로토콜은 모두 미생물을 복구하기 위해 최적화 된상대적으로 적은 리보솜 RNA (rRNA의) 시퀀스를 포함하고 호스트의 mRNA. 데이터 특성의 개요는 방법의 성공 여부를 평가하기위한 기준으로서 역할을 제시한다. 추가 CF 객담 샘플은 (i) 단일의 환자 내에서 연속 7 일에 걸쳐 마이크로 바이 프로파일의 일관성을 평가하고, (ⅱ) 16S 리보솜 RNA 유전자 기반 시퀀싱 metagenomic 방법의 일관성을 비교하기 위해 수집 하였다. 결과는 항생제 교란하지 않고 미생물의 프로필 매일 변동이 최소이고 일반적인 CF-관련된 박테리아의 분류 프로파일 저장성 용해 (HL) 유래 DNA로부터 생성 된 16S rDNA의 라이브러리와 metagenomes 사이에 매우 유사한 것으로 나타났다. 저장성 용해 및 세척 단계는 오직 인간 유래 DNA를 제거하지 시킨다는 이점이 제안하지만, 16S rDNA 염기 분류 학적 프로파일 간의 차이가 전체 DNA 및 HL 유래 DNA로부터 생성뿐만 아니라 extracellul을 미생물 유래실제 미생물 프로파일을 잘못 할 수있다 아칸소 DNA.

Watch this Scientific Journal Video about Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples at JoVE.com

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

일례로서 낭포 성 섬유증을기도하여, 원고는 동물 시료에서 관련 미생물 및 바이러스를 특성화하기 위해 커뮤니티 metagenomic metatranscriptomic 및 방법의 조합을 포함하는 포괄적 인 흐름을 나타낸다.

불순한 정화 : 연속 Metagenomes 및 Metatranscriptomes을 복잡한 동물 관련 샘플에서

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

purifying-impure-sequencing-metagenomes-metatranscriptomes-from

Research

JoVE Journal

Biology

37.2K 조회수.  San Diego State University.  일례로서 낭포 성 섬유증을기도하여, 원고는 동물 시료에서 관련 미생물 및 바이러스를 특성화하기 위해 커뮤니티 metagenomic metatranscriptomic 및 방법의 조합을 포함하는 포괄적 인 흐름을 나타낸다. 

비디오: Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

목초의 군 유전체학 분석

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

연구

유전학

An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

수생 미생물 Metaproteomics 워크 플로우 : 탠덤 질량 분석 기반 분석에 적합 트립신 펩티드로 세포

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

환경과학

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a larger genomic context. Subtractive genomics enables a researcher to isolate a target sequence of interest (T) by comprehensive sequencing and subtracting out known genetic elements (reference, R). The method can be used to identify novel sequences such as mitochondria, chloroplasts, viruses, or germline restricted chromosomes, and is particularly useful when T cannot be easily isolated from R. Beginning with the comprehensive genomic data (R + T), the method uses Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) against a reference sequence, or sequences, to remove the matching known sequences (R), leaving behind the target (T). For subtraction to work best, R should be a relatively complete draft that is missing T. Since sequences remaining after subtraction are tested through quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR), R does not need to be complete for the method to work. Here we link computational steps with experimental steps into a cycle that can be iterated as needed, sequentially removing multiple reference sequences and refining the search for T. The advantage of subtractive genomics is that a completely novel target sequence can be identified even in cases in which physical purification is difficult, impossible, or expensive. A drawback of the method is finding a suitable reference for subtraction and obtaining T-positive and negative samples for qPCR testing. We describe our implementation of the method in the identification of the first gene from the germline-restricted chromosome of zebra finch. In that case computational filtering involved three references (R), sequentially removed over three cycles: an incomplete genomic assembly, raw genomic data, and transcriptomic data.

The purpose of this protocol is to use a combination of computational and bench research to find novel sequences that cannot be easily separated from a co-purifying sequence, which may be only partially known.

빼기 게놈에 의해 소설 시퀀스 검색

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

나노 포어 시퀀싱을 사용 하 여 전 혈에서 mRNA의 시퀀싱

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

발생학

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers easy identification and characterization of these cell types, prerequisites to study their specific functions. This article describes the multiplex single cell reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) protocol, which allows, after patch-clamp recording in slices, to detect simultaneously the expression of tens of genes in a single cell. This simple method can be implemented with morphological characterization and is widely applicable to determine the phenotypic traits of various cell types and their particular cellular environment, such as in the vicinity of blood vessels. The principle of this protocol is to record a cell with the patch-clamp technique, to harvest and reverse transcribe its cytoplasmic content, and to detect qualitatively the expression of a predefined set of genes by multiplex PCR. It requires a careful design of PCR primers and intracellular patch-clamp solution compatible with RT-PCR. To ensure a selective and reliable transcript detection, this technique also requires appropriate controls from cytoplasm harvesting to amplification steps. Although precautions discussed here must be strictly followed, virtually any electrophysiological laboratory can use the multiplex single cell RT-PCR technique.

This protocol describes the critical steps and precautions required to perform single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp. This technique is a simple and effective method to analyze the expression profile of a predetermined set of genes from a single cell characterized by patch-clamp recordings.

패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

신경과학

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

16S 리보솜 RNA 유전자 증폭 산물의 차세대 시퀀싱

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

생물학

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

배양 된 포유 동물 세포에서 대규모 병렬 리포터 분석 실험

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

다음-세대 16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 틱 미생물 특성

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...