이 영역은 개선된 다능성 및 분화 가능성으로 인해 인간 다능성 줄기 세포의 3D 배양에 대한 관심으로 간주되며, 이러한 배양물이 형성되었다. 우리는 인간 다능성 줄기 세포 구상체의 재현 가능한 형성으로 이어지는 캡슐화 전략을 설명했습니다. 일단 캡슐화되면,이 줄기 세포 구상체는 다중 웰 플레이트 또는 교반 된 생물 반응기에서 재배 할 수 있습니다.
우리의 캡슐화 전략은 역병 생존 가능성과 스페로이드 형성의 높은 효율성을 최적화합니다. 캡슐화된 구상체는 교반 또는 흔들림과 관련된 전단 또는 기계적 에너지로부터 보호됩니다. 줄기 세포 유래 세포 요법의 개발은 부분적으로 확장 가능하고 효율적이며 비용 효율적인 방식으로 원하는 세포 생성물을 생성하는 능력에 달려 있다.
여기에 설명된 캡슐화 기술은 이러한 방향으로 나아가는 단계를 나타냅니다. 여기에 설명된 캡슐화 기술은 아마도 다른 세포로부터 다른 만능 줄기 세포에 이르기까지 다양한 세포 유형의 3D 배양에 적용될 것이다. 먼저 35 킬로달톤 PEG 4.8 그램, 밀도 구배 매체 10.2 밀리리터 및 DMEM / F-12 배지 19.8 밀리리터를 혼합하여 2 배 코어 원액 30 밀리리터를 준비하십시오.
그런 다음 0.22 마이크로미터 시린지 필터를 사용하여 이 코어 용액을 여과한다. 다음으로, 48.5 밀리리터의 미네랄 오일과 1.5 밀리리터의 계면활성제를 혼합하여 3 % 계면 활성제로 50 밀리리터의 미네랄 오일을 준비하십시오. 그런 다음 용액을 0.22 마이크로미터 시린지 필터를 통과시켜 멸균한다.
다음으로, 텍스트 원고에 설명된 대로 1몰 DTT, 1몰 TEA 및 1% PF127 용액을 준비한다. 그런 다음 4.5 밀리리터의 광유와 3 % 계면활성제 및 300 마이크로리터의 1 몰 DTT를 혼합하여 가교제 에멀젼을 제조하였다. 용액을 2 분 동안 볼텍싱 한 후 섭씨 20 도의 초음파 욕조에서 45 ~ 60 분 동안 초음파 처리하고 27 게이지 바늘이있는 5 밀리리터 주사기에 로딩하십시오.
다음으로, 0.5 % 계면 활성제를 가진 광유를 27 게이지 바늘이있는 5 밀리리터 주사기에 로딩하여 차폐 오일 용액을 준비하십시오. 쉘 용액을 제조하기 위해, 400 마이크로리터의 DPBS에 32 밀리그램의 PEG4 말레이미드를 첨가한다. 그런 다음 1 몰 TEA 6 마이크로 리터를 첨가하십시오.
용액을 2분 동안 볼텍스하고 스핀 필터를 통해 원심분리한다. 용액을 로커의 어둠 속에 30 분 동안 보관한 다음 27 게이지 바늘이있는 1 밀리리터 주사기에 적재하십시오. 마지막으로, 200 마이크로 리터 매체에 20 백만 hPSC를 재현탁하고 1 % PF127 및 200 마이크로 리터의 2X 코어 용액 30 마이크로 리터와 혼합하여 최종 코어 용액을 준비하십시오.
작은 교반기 막대를 1 밀리리터 주사기에 넣으십시오. 이어서, 코어 용액을 함유하는 세포를 27 게이지 바늘로 주사기에 로딩한다. 먼저 멸균을 위해 접합된 PDMS 액적 장치, 길이 20센티미터 4개, 길이 5센티미터 입구 마이크로튜브 1개, 10센티미터 출구 튜브 1개 및 0.5센티미터 피팅 튜브 6개를 살균 광원 아래에 30분 동안 배치하여 시작합니다.
이제 포셉을 사용하여 20cm 길이의 입구 마이크로 튜브 4 개를 쉘, 오일, 가교 에멀젼 및 해리 장치 입구에 맞 춥니 다. 그런 다음 튜브의 반대쪽 끝을 해당 용액으로 주사기 바늘에 삽입하십시오. 한편, 미세 유체 장치 코어 입구와 해리 장치 출구를 5 센티미터 마이크로 튜브로 연결하십시오.
1개의 출구 튜브를 유체 배출구 포트에 삽입하고 반대쪽 끝을 수집 저장소에 넣습니다. 그런 다음 장치를 현미경 스테이지에 놓고 튜브를 부착하여 움직이지 않도록하십시오. 유량 검사를 위해 현미경을 장치 노즐에 맞추고 초점을 맞춥니다.
각 주사기를 다른 주사기 펌프에 놓고 제대로 고정하십시오. 각 펌프를 제조업체의 프로토콜에 따라 텍스트 원고에 언급 된 유량에 따라 프로그래밍하고 모든 펌프에서 흐름을 시작하십시오. 각 유체가 장치에 들어갈 때까지 기다렸다가 나머지 공기를 밀어내는 동안 채널을 채 웁니다.
캡슐 형성이 안정화되면 수집 튜브의 반대쪽 끝을 5 밀리리터의 mTeSR 배지가 들어있는 새로운 원뿔형 튜브에 넣으십시오. 충분한 캡슐이 수집되면 10 분 동안 배양하십시오. 유상에 상주하는 캡슐은 튜브의 상단에 있으며, 튜브를 부드럽게 두드리면 바닥으로 퇴적됩니다.
캡슐을 회수하려면 먼저 수집 튜브에서 오일을 제거하십시오. 이어서, 캡슐을 100 마이크로미터 공극 크기의 세포 스트레이너 상에 놓고, 풍부한 양의 배지로 스트레이너를 세척한다. 6-웰 배양 플레이트의 웰 위에 있는 필터를 반전시키고, 필터를 통해 2밀리리터의 배지를 통과시켜 마이크로캡슐을 수집한다.
줄기 세포 캡슐을 섭씨 37도의 6-웰 배양 접시에 5 % 이산화탄소로 배양하십시오. 세포 스트레이너 필터에 캡슐을 모으고 과도한 배지로 세척한 다음 2밀리리터 배지가 있는 6웰 플레이트의 새로운 웰에 다시 매달아 배지를 격일로 교체합니다. 2 마이크로몰의 에티듐 호모디머-1 및 4 마이크로몰의 칼세인-AM 용액 1 마이크로리터를 2 밀리리터의 멸균 DPBS에 첨가함으로써 생존성 검정을 수행한다.
완벽한 혼합을 보장하는 소용돌이. 세포 스트레이너에 약 100 개의 마이크로 캡슐을 모으고 멸균 DPBS로 헹구어 캡슐에서 배지가 확산 될 수 있도록하십시오. 이들을 다시 12-웰 배양 플레이트에서 수집하여 에티듐 호모디머-1 및 칼세인 AM을 함유하는 제조된 용액 1 밀리리터를 사용하여 섭씨 37도에서 20분 동안 인큐베이션한다.
세포를 형광 현미경으로 시각화합니다. 미세유체 액적 생성을 사용하여 제조된 최적 및 차선책의 마이크로캡슐은 쉘 내의 PEG4-말레이미드 함량의 함수로서 캡슐 형태학의 차이를 보였다. 밝은 가장자리를 가진 부드러운 캡슐은 원하는 기계적 무결성과 관련이 있습니다.
캡슐의 중앙에 비드가 응집되어 코어가 수성이고 비드가 자유롭게 움직일 수 있음을 나타냅니다. 형광 환부는 하이드로겔 쉘의 존재를 나타내었고 쉘 두께를 결정하기 위해 사용되었다. H9 세포를 캡슐화한 후 6시간 후에 생사 또는 사신 염색은 세포가 캡슐화 실행 동안 일상적으로 95% 이상의 생존력을 달성한다는 것을 보여주었다.
캡슐화된 구상체 대 캡슐화되지 않은 구상체의 성장 속도 및 분화 잠재력을 비교한 경우. 캡슐화 과정이 hPSCs에 악영향을 미치지 않는 것으로 결정되었다. 코어 쉘과 오일 스트림 사이의 최적의 유량 비율을 설정하는 것이 중요하다는 것을 기억하십시오.
이렇게 하지 않으면 캡슐이 기계적으로 강하지 않고 취급 중에 파열될 수 있습니다. 우리는이 캡슐화 기술이 인간 다능성 줄기 세포 이외의 세포 유형을위한 것임을 지적하고자합니다. 우리는 유사한 전략을 사용하여 주로 가설화 된 암 세포주와 중간엽 줄기 세포를 캡슐화했습니다.
현재 우리 팀은 차세대 마이크로 캡처를 개발 중입니다. 이들 마이크로포획은 생체활성이며 줄기 세포의 캡슐화된 분화를 위한 교차 인자로 로딩될 수 있다.
