우리의 프로토콜은 기존의 형광 현미경을 사용하여 다세포 구상체의 산소화를 이미징하는 데 도움이됩니다. 이 방법을 사용하면 수천 개의 산소 프로브로 염색 된 스페로이드 미세 조직을 생산하고 3D 인쇄 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 혈관화된 골 조직 이식편.
근적외선 산소 프로브는 궁극적으로 녹색 형광 염색과 같은 다른 염료의 사용과 호환되며, 이는 라이브 및 다중 파라미터 장기 분석을 허용합니다. 마이크로 패턴화된 PDMS 스탬프를 저장 바이알에서 멸균 페트리 접시로 옮기고 10분 동안 멸균된 층류 공기 흐름 조건 하에서 매끄러운 표면을 위로 공기 건조시킨다. 각 스탬프를 12-웰 멸균 조직 배양 플레이트의 웰 중앙에 놓는다.
뚜껑을 열어 한 두 분 동안 공기를 건조시킵니다. 50 밀리리터의 3 % 균질 아가로스 용액을 준비하고 삽입 된 PDMS 스탬프를 덮기 위해 12 웰 플레이트의 각 웰에 약 2 밀리리터의 뜨거운 아가 로스 용액을 즉시 첨가하십시오. 아가로스를 멸균 기류 하에서 인큐베이션하여 20분 동안 고형화시킨다.
멸균 주걱을 사용하여, 임베디드 PDMS 스탬프가 있는 아가로스를 각 웰에서 거꾸로 뒤집습니다. 스탬프의 부드러운 윗면에 약 200 마이크로 리터의 멸균수를 넣으십시오. 주걱으로 아가로스에서 분리하고 우물에서 제거하십시오.
직접 사용하기 위해 해당 멸균 세포 배양 배지 한 밀리리터를 아가로스 스탬프에 추가하십시오. 뚜껑으로 접시를 덮고 섭씨 네 도에서 밤새 배양하십시오. 사용하기 전에, 아가로스 마이크로 패턴화된 플레이트를 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 한 시간 동안 데모션한다.
사전 가온 PBS로 70% 내지 90% 합류 세포 배양물을 헹구십시오. 해리 효소 용액을 첨가하고 섭씨 37도에서 3 ~ 5 분 동안 배양하십시오. 나중에, 트립신을 10%FBS를 함유하는 완전한 세포 배양 배지로 중화시킨다.
단일 세포 현탁액을 수득하기 위해, 혈청학적 피펫의 상부에 1,000 마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 세포 응집체를 해리시킨다. 카운팅 챔버를 사용하여, 세포 현탁액의 밀리리터당 세포의 수를 계수한다. 세포 현탁액을 밀리리터 당 500, 000 세포로 희석하고 농축 산소 프로브 용액을 첨가하십시오.
12-웰 아가로스 코팅된 세포 배양 플레이트의 마이크로-패터닝된 웰로부터 오래된 배지를 제거하고, 준비된 세포 현탁액 1밀리리터를 웰에 첨가한다. 구상체를 이산화탄소 인큐베이터에서 이틀 내지 오일 동안 산소 프로브의 연속 존재하에 배양하여 스페로이드 형성 및 압축 중에 로딩되도록 합니다. 팁 캡으로 멸균 된 세 입방 센티미터 카트리지의 끝을 닫고 피펫팅으로 바이오 잉크로 채 웁니다.
카트리지에 플런저를 넣고 거꾸로 잡으십시오. 팁 캡을 분리하고 카트리지의 모든 공기가 제거될 때까지 플런저를 바이오 잉크 쪽으로 밀어 넣습니다. 바이오 프린터의 가열 맨틀에서 바이오 잉크를 섭씨 23도에서 냉각하십시오.
바이오 프린터에 70 % 에탄올을 뿌리고 흡수 종이로 말리십시오. 카트리지 상단의 압력 어댑터에 끼워 넣습니다. 카트리지에 22게이지 원뿔형 폴리에틸렌 바늘을 장착합니다.
카트리지를 압출 기반 프린트 헤드의 가열 맨틀에 설치합니다. 압력 입구를 연결하고 입구의 클립을 엽니다. 설계의 G 코드 파일을 인쇄 소프트웨어에 로드합니다.
바늘 길이 측정을 시작합니다. 멸균 된 Petri 접시에 약간의 바이오 잉크를 분배하여 인쇄 압력을 조절하십시오. 여섯 웰 플레이트를 설치하고, 웰 플레이트를 열고, 후드를 닫고 인쇄하십시오.
인쇄 후, 스캐폴드를 섭씨 다섯 도에서 10 분 동안 물리적으로 가교 시키십시오. 인쇄된 스캐폴드를 자외선 LED 램프로 60초 동안 조사합니다. 즉시 이중 항생제 용액을 함유 한 해당 성장 배지를 생체 인쇄 된 그리드가있는 모든 웰에 추가하십시오.
스캐폴드를 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양한다. 현미경 관찰을 위해 인쇄된 와플 그리드를 이미징 미디어가 있는 현미경 접시 덮개에 옮깁니다. 1 밀리리터 피펫을 사용하여 산소 프로브를 아가로스 마이크로 웰에서 미리 염색 된 구상체를 부드럽게 씻어 내고 15 밀리리터 원뿔형 바닥 튜브로 옮깁니다.
마이크로 패턴화된 웰로부터 모든 구상체를 수집하려면 추가 한 밀리리터의 배양 배지로 웰을 한 세 번 헹구고 모든 스페로이드 현탁액을 하나의 바이알에 결합하십시오. 구상체가 바닥에 정착하도록 바이알을 최대 10 분 동안 수직으로 두십시오. 조심스럽게 튜브에서 매체를 제거하여 구상체를 방해받지 않도록하십시오.
샘플 접시 당 적어도 20 개의 구상체에 충분할 신선한 배양 배지를 추가하고 피펫팅으로 구상체를 부드럽게 재현탁하십시오. 즉시 동일한 부피의 스페로이드 현탁액을 각 사전 코팅 된 현미경 웰에 추가하십시오. 현미경 표면에 잘 부착하기 위해 구상체를 섭씨 37도에서 한 시간 동안 그대로 두십시오.
현미경에서 배지를 잘 제거하고 이미징 매체로 한 번 헹구십시오. 정확한 양의 이미징 미디어를 샘플에 추가하십시오. 현미경 검사 단계에서 염색 된 구상체로 현미경을 잘 설정하십시오.
10X 배율 목표를 사용하여 투과광에서 샘플을 미리 봅니다. 구상체에 예비 초점을 맞추고, 이미지의 중앙에 배치하고, 필요한 높은 배율로 목표를 작업 위치로 가져 오십시오. 구상체의 적도 단면에서 전송 광 모드에 중점을 둡니다.
산소 프로브의 참조 및 민감한 스펙트럼 채널의 형광 또는 인광 신호를 수집하기 위한 설정을 조정하고 이미징 프로세스를 시작합니다. 병합 모드에서 참조 및 민감한 스펙트럼 채널의 산소 프로브 강도 데이터로 vsi 파일을 엽니다. 측정 메뉴에서 비율 분석 함수 창을 엽니다.
참조 채널의 강도를 분자로 선택하고 민감한 채널의 강도를 R 계산의 분모로 선택합니다. 비율 분석 창에서 각 스펙트럼 채널에 해당 강도 임계값 설정을 적용하여 병합된 강도 이미지에서 배경을 뺍니다. 스페로이드 이미지에 적용된 ROI 마스크는 스페로이드 경계를 결정합니다.
이미지 배경이 균일하게 검은색이 될 때까지 임계값을 늘립니다. 비율 분석 창에서 미리 보기 이미지가 R 그라디언트의 원하는 해상도를 제공할 때까지 비율 이미지의 배율 인수를 조정합니다. 강도비 분포의 이미지는 원본 다중 채널 이미지에 레이어로 추가됩니다.
다중 채널 이미지의 창에서 거짓 색상 막대로 레이어를 활성화합니다. 디스플레이 창 조정에서 고정 배율 조정 옵션을 사용하여 비율 분포 히스토그램의 연결 및 연결 해제 한계를 수동으로 결정합니다. 구상체의 해당 전송 광 이미지를 엽니 다.
선형 눈금자 기능을 선택하고 구상체의 직경을 측정하십시오. 데이터를 스프레드시트 테이블 파일로 내보냅니다. 필요한 크기와 모양의 ROI를 선택하고 구상체의 주변 및 저산소 코어에 적용하십시오.
ROI를 측정 대상으로 변환하여 선택한 ROI 내부의 평균 R을 분석합니다. 스프레드시트 호환 테이블 형식으로 데이터를 내보냅니다. 스페로이드의 각 현미경 섹션에 측정을 적용하여 스페로이드 직경 RC 및 RP의 데이터 세트를 획득하여 추가 계산 및 통계 비교를 수행합니다.
모든 데이터를 하나의 스프레드시트 파일로 결합합니다. MMIR1 프로브는 낮은 광표백을 가지며 다른 미토콘드리아 자극에 대한 hDPSC 구상체에서 빠른 호흡 반응의 실시간 연구에 적합합니다. FCCP는 일부 영역에서 가벼운 결합 해제 효과 만 표시 한 다음 세포 호흡을 약간 감소 시켰습니다.
한편, 로테논은 자극 후 약 80초 이내에 스페로이드 재산소화 및 주변-코어 산소 구배의 소산으로 이어지는 호흡을 강하게 억제하였다. 이미징 소프트웨어가 제공하는 픽셀 강도비 계산에 의한 픽셀의 자동화된 프로토콜을 사용하여 모든 스페로이드 유형에서 실시간으로 감지된 주변부-코어 산소 구배는 중앙의 산소화된 주변 및 저산소 틈새 시장으로 시각화됩니다. 본 명세서의 그래프는 상이한 스페로이드 유형에 대한 적도 스페로이드 단면의 비율 프로파일을 묘사한다.
동종세포 hDPSC 구상체와 비교하여, HUVEC 구상체에 대한 이종세포 hDPSC는 상당히 가파른 구배를 가졌다. 헤테로세포 구상체에서 주변-코어 산소 구배는 강한 호흡 활성을 갖는 hDPSC 구상체 산소화에 따라 그들의 조성에서 hDPSC에 의해 생성될 가능성이 높다. 그래프는 생체 인쇄 된 hDPSC 구상체가 바이오 프린팅 전에 측정 된 구상체보다 상당히 산소화 된 주변을 가졌지 만 코어 산소화는 비슷한 값을 가졌다는 것을 보여줍니다.
가끔씩 프로브 침전이 균일한 스페로이드 형성을 방해하는 경우, 사용하기 전에 프로브 용액을 고속으로 필터링하거나 원심분리하십시오. 보정 바늘 길이 측정 및 압력 조절은 다공성 스캐폴드에서 바이오프린팅 속도 및 스트럿 직경 및 바이오프린트 미세응집체를 일치시키기 위한 필수적인 단계이다. 프로브 광안정성에 미치는 영향을 고려하여 산소에 민감한 프로브 이미징을 위한 현미경 설정을 선택합니다.
산소 이미징은 다양한 유형의 라이브 현미경 측정과 호환됩니다. 이미징 후, 면역 형광을 수행하거나, 웨스턴 블롯팅을 위해 단백질을 추출하거나, 유전자 발현 분석을 수행 할 수도 있습니다.
